Ультразвук оценки на основе коронарной артерии потока и коронарного кровотока заповедника Использование перегрузки Модель давления у мышей

Резюме

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Аннотация

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy.

During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS).

The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography.

The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Введение

Клиническая аортальный стеноз (АС) хорошо известны способствовать постепенное увеличение левого желудочка (ЛЖ) постнагрузки. Чтобы компенсировать этот рост хронически гемодинамической нагрузки, гипертрофия ЛЖ (ГЛЖ) вытекает в качестве адаптивного отклика ^1,2. Развитие гипертрофии левого желудочка часто ассоциируется с аномалиями коронарного микроциркуляции. Считается, что микрососудистой дисфункции способствует хронической ишемии у этих пациентов ^5. В дополнение к коронарного потока ^3,4, коронарного резерва (CFR) представляет функциональную изменение коронарных артерий ^1,3 и определяется как отношение максимальной скорости потока в гиперемии к базовой скорости потока или скорости покоя ^4,6,7 потока. CFR уменьшается при ремоделировании ЛЖ ^1-3,5-9 и используется в качестве индекса степени функциональной тяжести коронарной дисфункции ^1,10,17. Это, как известно, нарушается во многих формах дилатационной кардиомиопатии ^10, а также коронарных сtenosis ^6. CFR также прогностический маркер для бедных клинических исходов ^12.

Ремоделирования ЛЖ в условиях сердечной дисфункции, такие как ишемия или гипертрофии левого желудочка сопровождается также обширным фиброзом, изменения в коронарную микроциркуляцию и утолщение коронарных артерий ^1,2. В результате этих изменений в коронарной физиологии, существует вероятность ремоделирование коронарных артерий. Это помогает смягчить последствия низкой диффузии кислорода и диастолической дисфункции ЛЖ, что может привести к предрасположенности к ишемии миокарда ^1,2,13.

Генетически модифицированные мыши теперь широко распространены исследуемый инструмент для имитации условий человеческой болезни, такие как коронарного атеросклероза ^{5,7,10,12,17.} В частности, модель давление перегрузки у мышей был широко изучен ^14,17. Транс-сужением аорты модель (TAC), как было показано, связано с обширным фиброзом и coronarу стеноз в результате, в частности, от медиальной утолщение коронарных артерий и сопутствующих изменений в коронарных картины течения ^1,11,17,19 подобных тому, что видно в условиях гипертрофии левого желудочка у людей. Хотя известно, что перегрузка длительное давление приводит к декомпенсации сердечной недостаточности в 4-8 недель, влияние на динамику коронарного кровотока и резерва потока в этих моделях, в начале процесса прогрессирования заболевания, и на разных этапах после кольцевания, пока должны быть четко разграничены.

Многочисленные линии мышей настоящее время доступны для исследовательских целей, в том числе хорошо характеризуется LDLR - / - или ApoE - / - мышей ^10-12, и они вызвали развитие чувствительных методов для оценки сердечно-сосудистой функции и морфологии в живых мышей ^11-15. Такие методы включают МРТ, ПЭТ, контрастность КТ, высокий частоте ультразвука, и Электронно-лучевая томография ^2,9,17,19, все из которых обеспечивают перспективные альтернативы к инвазивнымметоды, такие как сердечная катетеризации и коронарной ангиографии ^12. Тем не менее, у мышей с очень малым размером коронарных артерий и высокий уровень сердечных сокращений (ЧСС), визуализация коронарного кровообращения по-прежнему представляет собой сложную техническую задачу для многих имеющихся в настоящее время методов ^4,12. Интересно, что имело экспоненциальный рост в технических достижений в области трансторакальная эходопплеркардиография (TTDE), включая разработку высокочастотных головок сканирования массива с центральными частотами от 15 до 50 МГц, позволяя осевые резолюции примерно 30-100 мкм, на глубине 8-40 мм и частотой кадров больше, чем 400 кадров в плен / сек. В свою очередь, методы TTDE основе появились как потенциально мощный инструмент для работы с изображениями больших ² или даже меньшие сосуды, например, коронарных артерий ^5,12.

Другим важным заранее, что позволило исследователям провести диагностические исследования по визуализации сосудистой в малых аnimals является тщательно контролируемое использование анестетиков, которые поддерживают сердце и частота дыхания животных во время съемки ^11. Техническое обслуживание под управлением анестезия является особенно важным для исследований, связанных с расширением сосудов у мышей, и эффект обезболивания также нуждается в дальнейшем изучении в этом контексте ^10,11. В организме человека, а с другой стороны, TTDE-производные измерения CFR стали более часто используемым инструментом для оценки стенозированных и не-препятствия эпикардиальных коронарных артерий, преимущественно в левой передней нисходящей (LAD) коронарной артерии ^5,16. Тем не менее, прогностическая роль CFR и коронарных изменений потока в бессимптомных пациентов или мышей с сохраненной ЛЖ систолической функции в покое была гораздо менее изучены ^16. Таким образом, цель исследования состояла в том, чтобы сначала создать четкую шаг за шагом протокол, чтобы оценить изменения в коронарного кровотока с помощью TTDE в модели давление перегрузки мыши; Во-вторых, это исследование изучило прогностическим признакомificance из CFR и коронарных потока изменяется в ответ на давление перегрузки стресс у этих мышей. Мы предположили, что на основе TTDE оценка CFR и коронарного кровотока может быть полезным в ранней диагностике ишемической дисфункции, которые могут предшествовать дисфункции левого желудочка.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были выполнены на мышах, в соответствии с Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации (AVMA) руководящие принципы и утверждены Институциональные животных уходу и использованию комитетов (IACUC) протоколы.

1. Дизайн исследования

1. Использование 8-10 недельных самцов мышей C57BL / 6 (BW ~ 25 г) в исследовании.
2. Случайно мышей (п = 11) в двух группах, изучение группу, выбранную аортального диапазонов (N = 8), и контрольная группа (п = 3) пройти имитации операции с помощью торакотомии.
3. Подготовьте животное для визуализации путем удаления волос с груди с помощью депиляции крем, который медицинского назначения.
4. Выполните первый ультразвук (раздел 2) 24 час до аорты диапазонов для определения базовых параметров в День -1, между диапазоне от 1% и 2,5% изофлуран (в смеси с 100% O ₂ с помощью головная), индуцированной анестезией.
5. Выберите одобренного медициной анестетик (т.е. ИФ) и контролировать степень анестезии (2-3% в промCE и 1,0% для поддержания).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное анестезии имеет решающее значение в поддержании сердечного ритма при нормальных физиологических ставок (около 500 уд / мин).
6. Подтвердите глубины анестезии при потере движения от животного в ответ на педали отмены рефлекса. Используйте paralube ветеринар мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
7. Выполните операцию в день 0 ^20,21.
8. Для аорты полосы, перевязывать аорты с помощью 7-0 шелковой нити вокруг конической 26 G иглу, помещены на арке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Детали, касающиеся экспериментальный протокол, в том числе хирургических аорты процедур полосы, были описаны ранее ^20,21.
9. Выполните послеоперационной ультразвуковой визуализации (раздел 2) в сутки (ок) 2, 6 и 13.
10. Усыпить мышей на 14 день и урожай сердца для гистологического оценки. Усыпить животных с помощью передозировки пентобарбитала с последующим удалением жизненно важного органа, как сердце. Арест сердца в diastoле и исправить с формалином. Используйте процедуру сбора сердца, которая была описана ранее ^22.
11. Исправить все тканей сердца буферным 10% раствором формалина. Для трихромом окрашивания, вставлять тканей в парафин до секционирования. Используйте детали трихромом окрашивания, которые были хорошо иллюстрированы ранее ^14,23.
12. Анализ данных с помощью форума программное обеспечение (раздел 3).

2. изображений протокол

1. Длинные и короткие изображения оси перегородки коронарной артерии (SCA) (B- режим)
   1. Использование MS550D зонд с центральной частотой 40 МГц, подключенных к активному-порт, установить предустановки приложений к "сердечной визуализации".
   2. С животного на спине на нагретой платформы, и под наркозом управляется через носовой конус, поместите зонд с помощью системы железнодорожных, чтобы получить парастернальной долгосрочную перспективу оси (PSLAX) (рис 1а). Всегда убедитесь, что животное в тепле на подогретую platforм, температура тела поддерживается на уровне физиологических уровней.
   3. Поверните датчик (с надрезом указывая каудально) по часовой стрелке таким образом, чтобы угол зонда 15 ° влево парастернальной линии (длинной оси зрения) (рис 1б).
   4. Регулировка угла датчика, слегка наклон вдоль оси у зонда, чтобы получить полную длину продольный вид в SCA в центре экрана (Фиг.1В).
   5. Как только правильные ориентиры (аортальный клапан и легочной артерии) рассматриваются, Cine сохранить изображение с использованием самых высоких частоту кадров можно.
   6. При использовании "ху" оси микро-манипуляторы (рис 1D), отрегулируйте положение датчика для получения ясное изображение SCA.
   7. Поверните датчик 90 ° (с надрезом указывая каудально) по часовой стрелке таким образом, чтобы срезанный конец зонда находится слева от срединной линии (короткой оси) (рис 1в).
2. Длинные и короткие изображения оси SCA (цвет доплеровский Modе)
   1. После того, как изображение Режим B захвачен или кино-хранения, нажмите кнопку цветового допплеровского на клавиатуре, чтобы включить цветового допплеровского акустического окна (рисунок 2).
      Примечание: Это помогает изолировать коронарной артерии (белые стрелки указывает, SCA) либо в конечном (фиг.2А) или короткой оси (фиг.2С). Красный цвет, как показано в реальном времени и свидетельствует о направлении потока (от аортального клапана).
   2. Убедитесь, что глубина фокусировки (на схеме обозначен желтым наконечником на правой стороне экрана изображения), лежит в центре коронарной артерии.
   3. Убедитесь, что данные записываются с помощью клавиши кино-магазина, на максимально возможной скорости кадров (> 100 кадров / сек).
3. PW Doppler Визуализация SCA (импульсно-волновой или PW Mode)
   1. В то время как в режиме цветной доплеровской, нажмите на клавишу PW воспитывать желто-индикаторной линии на коронарной артерии (рис 2, как показано красным).
   2. Поместите желтыйPW линии в середине коронарной артерии с учетом, под углом, который параллелен направленности потока. Обратите внимание, что измерения скорости в значительной степени зависит от угла захвата изображения.
   3. Отрегулируйте угол потока (ключ угол PW) и объем образца (ключ SV), что ключ угол PW на 60 ° или меньше и объем выборки захватывает поток прямо в центре SCA.
   4. Использование кинопамяти магазин для захвата формы волны, которые указывают скорость коронарного потока при максимальной систолы (S) и диастолы (D) (Фигуры 3А и 3В), с использованием 1% и 2,5% изофлуран.

3. Расчет и анализ данных

1. Выберите время скорость интеграл (VTI) инструмент для получения пиковой систолического и диастолического скорости от изображений, показанных на рис 3a и 3b.
2. Рассчитайте коронарного резерва индекс (CFR) как отношение гиперемического (2,5% ИФ) пик диастолического Fнизкая скорость с исходным значением (1% ИФ) пик скорость диастолического потока.
3. Рассчитать отношение S / D в качестве пикового систолического скорости коронарный кровоток / пик диастолического скорости коронарного кровотока. Определить соотношение в исходной точке (1% ИФ) и в гиперемии (2,5% изофлуран).
4. Для стандартных параметров сердечной функции, такие как FS, КВС, LVM обратитесь к руководствам от производителя для выполнения анализа данных, используя программное обеспечение или обратитесь к Чэн Юпитер бумаги ^2.

Результаты

Из 11 мышей, которые были изучены (полосчатых, п = 8 и фиктивные, N = 3), были получены адекватные и воспроизводимые изображения с помощью одного наблюдателя в нескольких временных точках: в начале исследования (Д-1), D2, D6 и D13 , Кроме того, скорость потока на констриктивного сайте был измерен ка?...

Обсуждение

В этом ультразвукового исследования, основанного, неинвазивная оценка коронарного кровотока воспроизводимо выполняется в режиме реального времени, в течение нескольких дней, в живых подопытных мышей; Кроме того, протокол продемонстрировали потенциал для обнаружения дисфункции коро...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Depilatory cream	Miltex, Inc.	Surgi-Prep	Apply 24 hours prior to imaging
Isoflurane	Baxter International Inc.	NDC 10019-773-40	2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute
	Table of equipments
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
High-frequency Mechanical Transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS250, MS550D, MS400