マウスの圧負荷モデルを用いた冠動脈の流れと冠血流準備の超音波ベースのアセスメント

要約

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

要約

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy.

During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS).

The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography.

The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

概要

臨床大動脈弁狭窄（AS）がよく、左心室（LV）の後負荷の漸進的増加を促進することが知られている。この慢性的に上昇する血行動態の負荷を補償するために、左室肥大（LVH）は、適応応答^1,2としてすさまじい。 LVHの開発は、多くの場合、冠微小循環の異常と関連している。これは、微小血管の機能障害は、これらの患者⁵の慢性虚血に寄与すると考えられている。冠血流^3,4に加えて、冠血流予備能（CFR）は、冠状動脈^1,3の機能変化を表しており、ベースライン流速または休止流速^4,6,7に充血の最大流速の比として定義される。 CFRは、LVリモデリング^1-3,5-9の間に減少し、冠状動脈不全^1,10,17の機能的重症度の程度の指標として用いられる。これは、拡張型心筋症¹⁰と冠状sの多くの形態が損なわれることが知られているtenosis ^6。 CFRも不良な臨床転帰¹²の予後マーカーである。

そのような虚血またはLVHなどの心機能障害の設定でLVリモデリングにも豊富な線維症、冠状動脈^1,2の冠動脈微小循環と肥厚の変化を伴っている。冠状生理におけるこれらの変化の結果として、冠状動脈の可能性リモデリングがある。これは、低酸素拡散と心筋虚血の^1,2,13に対する感受性の原因となり、LV拡張機能障害の影響を軽減するのに役立ちます。

遺伝的に変更されたマウスは、そのような冠状動脈アテローム性動脈硬化症^5,7,10,12,17ようになりましたヒトの疾患状態を模倣するために広く普及して治験ツールです。特にマウスにおける圧負荷モデルが広く^14,17に研究されている。トランス大動脈狭窄モデル（TAC）は、広範な線維症と関連することが示され、coronarされているyの狭窄冠動脈の内側肥厚およびヒトにおけるLVHの設定で見られるものと同様の冠血流パターン^1,11,17,19の変化を伴うと、部分的には、結果として生じる。それは長期の圧負荷は約4~8週間で非代償性心不全につながることが知られているが、バンディング後のこれらのモデルにおいて、初期の疾患の進行の過程において、および異なる段階で冠血流動態および血流予備への影響は、まだある明瞭に描写される。

マウスの多くの株は十分に特徴付けられたLDLRを含む、研究用途のために現在利用可能である- / -またはアポE - / -マウス^10-12、これらは生きているマウス^11-15心臓血管機能および形態を評価するための敏感な技術の開発を促した。このような技術は、MRI、PET、CTコントラスト、高周波数超音波、および浸潤に有望な代替物を提供するこれらの全ての電子ビーム断層撮影法^2,9,17,19を含む心臓カテーテル法と冠動脈造影¹²のような方法。しかしながら、冠状動脈の非常に小さいサイズ、高い心拍数（HR）を有するマウスにおいて、冠循環のイメージングは、依然として多くの現在利用可能な技術^4,12のための技術的な課題である。興味深いことに、15から約30-100ミクロンの軸方向の解像度を可能にする50MHzの中​​心周波数の高周波アレイ·スキャンヘッドの開発など、経胸​​壁ドップラー心エコー検査（TTDE）の分野における技術の進歩、指数関数的上昇があった、 400フレーム捕捉/秒より大きい8〜40ミリメートル、及びフレームレートの深さで。ターンでは、TTDEベースの技術は^、2より大きい、またはそのような冠状動脈^5,12としてさらに小さな血管を画像化するための潜在的に強力なツールとして浮上している。

研究者は小さなAの血管系の画像診断試験を実施することができましたもう一つの重要な前進nimals ^11を撮像中の心拍や動物の呼吸速度を維持麻酔薬の慎重に制御を使用することである。制御された麻酔の維持は、マウスにおいて血管拡張に関連する研究のために特に重要であり、麻酔の効果はまた、このコンテキスト^10,11で検討する必要がある。ヒトでは、一方で、TTDE由来のCFRの測定は、主に左前下行（LAD）冠動脈^5,16において、狭窄および非閉塞し心外膜冠動脈の評価のためのより一般的に使用されるツールとなっている。しかし、安静時の保存LV収縮機能とCFRと無症候性患者やマウスでの冠血流変化の予後の役割は、はるかに少ない^16を検討されている。したがって、研究の目的は、第一の圧負荷マウスモデルにおいてTTDEを用いた冠状動脈流の変化を評価するために、明確なステップバイステップのプロトコルを確立することであった。第二に、この研究では、予後のサインを検討CFRおよびこれらのマウスにおける圧負荷ストレスに応答して冠血流の変化ificance。私たちは、CFRと冠血流のTTDEベースの評価は左室機能障害に先行してもよい冠動脈機能障害の早期発見に有用である可能性があるという仮説を立てた。

プロトコル

注：すべての手順は、米国獣医師会（AVMA）のガイドラインに従ってマウスで行われ、施設内動物管理使用委員会（IACUC）のプロトコルを承認された。

1.研究デザイン

1. 研究では8〜10週齢の雄のC57BL / 6マウス（BW〜25グラム）を使用します。
2. マウスをランダムた（n = 11）の2つのグループに、大動脈バンディングのために選択試験群（n = 8）および対照群（n = 3）を介して、開胸偽手術を受ける。
3. 医療グレードで脱毛クリームを使用して、胸から毛を除去することにより、画像化のために動物を準備します。
4. （ノーズコーンを介して100％のO ₂と混合）1％および2.5％のイソフルラン麻酔誘発性の範囲の間、-1日目にベースラインのパラメータを決定するために、大動脈結紮の24時間前に第1の超音波（第2）を行う。
5. 医学的に承認された麻酔薬を選択してください（ つまり、イソフルラン）と寄り付きに麻酔（2から3パーセントの程度を監視するCE、および維持するための1.0％）。
   注：適切な麻酔は通常の生理学的速度（約500拍/分）でのハートビートの維持に重要である。
6. ペダル引っ込め反射に応答した動物からの動きの損失によって麻酔の深さを確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目にparalube獣医軟膏を使用してください。
7. 0日目^20,21で手術を行う。
8. 大動脈バンディングについては、アーチ上に置かれ、テーパ26 G針を中心に7-0絹縫合糸を使用して大動脈を結紮。
   注：外科大動脈バンディング手順を含む実験プロトコルに関する詳細は、以前に^20,21に記載されている。
9. 術後超音波イメージング（セクション2）日で（複数の）2,6及び13を実行する。
10. 14日目にマウスを安楽死させると組織学的評価のために心を収穫。心臓などの重要臓器を除去したペントバルビタールの過剰摂取を使用して、動物を安楽死させる。 diastoに心を逮捕LEとホルマリンで固定します。以前に²²に記載されている心臓の収穫の手順を使用します。
11. バッファリングされた10％ホルマリン溶液でのすべての心臓組織を修正。トリクローム染色のために、切片の前にパラフィン中に組織を埋め込む。よく以前に^14,23説明してきたトリクローム染色の詳細を使用してください。
12. オフラインソフトウェア（セクション3）を使用してデータを分析します。

2.イメージングプロトコル

1. 中隔冠動脈のロングとショート軸像（SCA）（B-モード）
   1. アクティブポートに接続された40 MHzの中​​心周波数でMS550Dプローブを用いて、「心臓イメージング」への適用プリセットを設定する。
   2. 加熱されたプラットフォーム上で、ノーズコーンを介して制御麻酔下の動物の仰臥位では、胸骨傍長軸ビュー（PSLAX）（ 図1A）を得るためにレールシステムを使用してプローブを配置する。常に動物が予め温めplatforに保温されていることを確認m及び体温を生理学的レベルに維持される。
   3. （ノッチが尾側に向くように）プローブ角度が左胸骨傍のライン（長軸ビュー）（ 図1B）に15°であるように時計回りにプローブを回転させます。
   4. 画面（ 図1B）の中央にSCAの全長の縦断面を得るために、プローブのy軸に沿ってわずかに傾斜させることによって、プローブの角度を調節する。
   5. 適切な目印（大動脈弁及び肺動脈）は、シネ·ストアの可能な限り最高のフレームレートを使用して画像を見たら。
   6. 「のxy "を使用して、SCAの鮮明な画像を得るためのプローブ位置を調整し、マイクロマニピュレーター（ 図1D）を軸。
   7. （ノッチが尾側に向くように）プローブをプローブの切り欠き端が正中線の左側（短軸）（ 図1C）にあるように、時計回りに90°回転します。
2. SCAのロングとショート軸像（カラー·ドップラーのModE）
   1. Bモード画像を撮影またはシネ格納されると、カラードップラー音響窓（ 図2）をオンにするキーボードのカラードプラキーをクリックする。
      注：これは、長い（ 図2A）または短軸（ 図2C）のいずれかで（白い矢印がSCAを示す）冠動脈を特定するのに役立ちます。赤色がリアルタイムに見られるようにし、（離れて大動脈弁の）流れの方向を示している。
   2. （画像画面の右側に黄色い矢印で示す）は、焦点深度は、冠動脈の中心にあることを確認してください。
   3. データは可能な限り高いフレームレート（> 100フレーム/秒）で、シネストアキーを使用して、記録されていることを確認してください。
3. SCAのPWドップラーイメージング（パルス波またはPWモード）
   1. カラードプラモードにある間、冠状動脈（赤で示した図2、）に黄色のインジケータラインを表示するためにPW]キーをクリックしてください。
   2. 黄色を配置流れの方向と平行する方向のビ​​ュー内の冠状動脈の中央にPWライン。速度測定は、画像取得の角度に大きく依存することに注意してください。
   3. PW角度キーが60°以下であり、サンプルの体積はSCAの中心に流れ権利を捕捉するように流れの角度（PW角度キー）及びサンプルボリューム（SVキー）を調整する。
   4. 1％および2.5％イソフルランを使用して、ピーク収縮期（S）および拡張期（D）（ 図3Aおよび図3B）における冠血流速度を示す波形を捕捉するためにシネ·ストアを使用する。

3.データの計算と分析

1. 図3Aおよび3Bに示されている画像からのピーク収縮期および拡張期速度を得るために、速度の時間積分（VTI）ツールを選択します。
2. 充血の割合（2.5％イソフルラン）ピーク拡張期fとして冠血流予備インデックス（CFR）を計算ベースライン（1％イソフルラン）最大拡張期流速を低速。
3. ピーク収縮期冠動脈流速/ピーク拡張期冠血流速度としてS / D比を計算します。ベースラインでの割合（1％イソフルラン）と充血で（2.5％イソフルラン）を決定します。
4. そのようなFS、FAC、LVMなどの標準的な心機能のパラメータについては、独自のソフトウェアを使用してデータ分析を実行したり、チェンのJoveの紙²を参照するために、メーカーからの説明書を参照してください。

結果

研究された11匹のマウス（バンドはn = 8、偽手術、n = 3）を、適切かつ再現可能な画像は、いくつかの時点で、単一の観察者により得られた：ベースライン（D-1）において、D2、D6及びD13 。また、狭窄部位での流速は、手術の翌日に（p <0.05）に偽手術マウスにおいて277.5±10.51ミリメートル/秒と比較して、110.9ミリメートル/秒±2225として測定した。速度の増加は、圧負荷モデルの確立に成功の...

ディスカッション

この超音波ベースの研究では、冠血流の非侵襲的評価は、再現性のライブ実験マウスにおいて、日にわたって、リアルタイムで行われた。さらに、プロトコルは、初期の段階で存在し、心筋灌流における欠乏に関連した冠状動脈機能不全を検出するための可能性を実証した。この方法は、最終的に心血管リスク層別化および/または治療的介入に対する応答を評価するための臨床ツールとして...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Depilatory cream	Miltex, Inc.	Surgi-Prep	Apply 24 hours prior to imaging
Isoflurane	Baxter International Inc.	NDC 10019-773-40	2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute
	Table of equipments
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments
High Frequency Ultrasound	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
High-frequency Mechanical Transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS250, MS550D, MS400