הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Summary

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Abstract

ניתוח התגובות הפיזיולוגיות של תאי עצב תחושתיים חוש הריח (OSN) כאשר מגורה עם ligands הספציפי הוא קריטי כדי להבין את הבסיס של התנהגויות מונעים ריח והאפנון שלהם. מאפייני קידוד אלה תלויים במידה רבה באינטראקציה הראשונית בין מולקולות ריח וקולטני הריח (OR) באו לידי ביטוי בOSNs. ספקטרום זהות, הסגוליות ויגנד של ביטוי או קריטיים. ההסתברות למצוא יגנד של או הביטוי בOSN נבחר באופן אקראי בתוך האפיתל הוא נמוך מאוד. כדי להתמודד עם אתגר זה, פרוטוקול זה משתמש גנטי עכברים מתויגים המבטאים את ה- GFP חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של ​​האמרגן של חדרי ניתוח שהוגדר. OSNs ממוקם באפיתל הדוק ומסודר המצפים את חלל האף, עם תאי שכנים משפיעים ההתבגרות ותפקודם. כאן אנו מתארים שיטה לבודד אפיתל ריח שלם ולהקליט דרך הקלטות תיקון מהדק המאפיינים של דואר OSNsxpressing קולטנים odorant מוגדרים. הפרוטוקול מאפשר לאפיין תכונות קרום OSN, תוך שמירה על ההשפעה של רקמות שכנות. ניתוח של תוצאות תיקון מהדק מניב כימות מדויק של יגנד / או אינטראקציות, מסלולי העברה ופרמקולוגיה, תכונות הקידוד 'OSNs והאפנון שלהם ברמת הקרום.

Introduction

נוירונים חושיים ריח (OSN) מייצגים את השלב הראשון של תפיסת חוש הריח. ממוקם באפיתל ההרחה המצפה את חלל האף במכרסמים, הם יהפכו את המידע הכימי של ניחוחי לפוטנציאל פעולה שנשלח דרך האקסון שלהם למוח. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני קידוד חוש הריח, יש צורך לאפיין את תכונות התמרה וקרום של OSNs. עד לאחרונה, רוב הטכניקות המשמשות כדי לאפיין את המאפיינים של OSNs יונקים בוצעו על ^1-4 OSNs ניתקו. תהליך הניתוק משתמש (כלומר, אנזימים) תהליכים שונים מכאניים וכימיים לשחרר OSNs מסביבתם. תהליכים אלה גורמים למספר נמוך של תאים זמינים להקלטות. מספר נמוך זה יכול להיות אפילו יותר קריטי במקרה של תאי ה- GFP שכותרתו. דיסוציאציה גם מסירה את אינטראקציות תא אל התא המקומיות בין OSNs ותאים אחרים של אפיתל הריח שעשוי לשפר survivאל ואפנון של הנכסים "OSNs. כדי לעקוף את הליך הניתוק, הכנה שלמה פותחה ^5.

כל OSN מבטא קולטן אחד חוש הריח (OR) נבחר ממשפחת multigene גדולה ^6. יש ~ 1,000 חדרי ניתוח הביטוי באפיתל ההרחה העיקרי בעכבר. בשל המספר הגדול של בעלי חיים או בסוג בר, הסיכויים להקליט OSNs להביע זהה או נמוכים מאוד. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עכברי גן ממוקד זמינים שבו כל OSNs להביע מזוהה או מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי ^7-9. OSNs שכותרתו אלה שמשו לעשות אנליזה פונקציונלית בהכנות ניתק ^7,10,11 עם החסרונות שהוזכרו קודם לכן. הכנת אפיתל ללא פגע ⁵ מעכברים שכותרתו גנטית ולכן עוקפת בעיות אלה. זה מאפשר הניטור של הפעילות של OSNs להביע חדרי ניתוח מוגדרים במדויק בסביבה הקרוב בviVO ככל האפשר. חוץ מזה, הקלטות תיקון מהדק של OSNs גם יאפשרו ניתוח מדויק של תכונות קרום, פרמקולוגיה מסלול התמרה, יגנד / או אינטראקציות. בקושי ניתן לנתח את כל הנושאים הללו באמצעות הקלטות תאית. השתמשנו בטכניקה זו כדי לעקוב אחר התגובות של OSNs מבטאות את הקולטנים odorant SR1 וMOR23 ^12,13. ההיתכנות של הטכניקה אושרה על ידי קבוצות אחרות בMOR23 להביע ¹⁴ OSNs כמו גם בחדרי ניתוח אחרים להביע נוירונים ^15,16. הניטור של אוכלוסייה מוגדרת של OSNs יכול להוביל לניתוח של המאפיינים שלהם בהקשרים רבים ושונים כגון פיתוח ^14, הזדקנות ^17, odorant מושרה פלסטיות ^18, ותפקידם של שינויים ברצף של קולטן odorant בריח קידוד ^15. פרוטוקול זה ובכך מספק כלי רב עוצמה כדי לעקוב אחר התכונות הפונקציונליות של OSNs המוגדר ברמת הקרום.

Protocol

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של Université de Bourgogne ואושר על ידי ועדת האתיקה Université de Bourgogne.

1. בעלי חיים

1. השתמש עכברים או-IRES-tauGFP מהונדסים גנטי זמינים במעבדה ג'קסון. עכברים אלו פותחו במעבדה של ד"ר פיטר 'Mombaerts כדי לנתח מיקוד ופיתוח האקסון של מערכת ההרחה ^19. לדוגמא, קו MOR23-IRES-tauGFP, מספר מניות 006,643, נושא את השם הרשמי מתח B6; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; באופן דומה, הקו-SR1 IRES-tauGFP, מספר מניות 6717 נושא את השם הרשמי B6; 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ.
2. לגבי הגיל של בעלי החיים: לתוצאה טובה יותר של הפרוטוקול, להשתמש בבעלי חיים בין 2 ל 4 שבועות של גיל. בקבוצת גיל זו, לנתיחה היא (עצמות רכות, אפיתל ריח מוצק יותר) קלים יותר והידיות הדנדריטים הן דוgger להשוות לבעלי חיים מבוגרים.

2. הכנת אלקטרודות ופתרונות

1. לטפטפות המגרה: רכישת prepulled גירוי טפטפות. אחרת, להכין אותם באופן ידני.
   1. שימוש בלהבה, לכופף שש טפטפות זכוכית 1 מ"מ בכ 1 סנטימטר מהקצה. הכנס שש טפטפות אלה בתוספת 7 ^ה ישר בצינורות כיווץ בחום 1.5 סנטימטר לחזק על ידי לולאה.
   2. חום לכווץ את צינורות כדי לשמור על החביות המצורפות יחד. צרף צינורות לכווץ נוספים לגפיים האחרים של החביות. משוך פיפטה גירוי זה עם חולץ רב-חבית.
   3. להוסיף קצת דבק נוזלי לבן סביב חריר כדי לחזק את הטיפים הכפופים. בואו N / O היבש.
2. הכן L 1 או 2 של הפתרון תאי רינגר הרגיל (מ"מ: 124 NaCl, KCl 3, ₄ MgSO 1.3, CaCl ₂ 2, ₃ NaHCO 26, Nah ₂ PO ₄ 1.25, 15 גלוקוז; mOsm pH 7.6 ו 305). שמור על 4 מעלות צלזיוסעד לשימוש.
3. הכן פתרון מניות תאיים (מ"מ): 70 KCl, KOH 53, חומצת methanesulfonic 30, EGTA 5, HEPES 10, סוכרוז 70; pH 7.2 (KOH) וmOsm 310. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. טוב למספר שבועות.
4. הכן פתרון תאיים הקלטה עם nystatin הכנה מוקדמת (ברגע האחרון) לפני הניסוי.
   1. שוקל 3 מ"ג של nystatin, להוסיף 50 μl של DMSO; מערבולת 20 שניות לאחר מכן sonicate 2-3 דקות עד מדוללים לחלוטין.
   2. הוסף 20 μl של פתרון DMSO-nystatin ב 5 מיליליטר של פתרון מניות תאיים. מערבולת 20 שניות, ואז sonicate 3 דקות. שמור פתרון זה על 4 מעלות צלזיוס ולהגן מפני אור ישיר, nystatin הוא רגיש לאור. פתרון זה יכול לשמש לכמה שעות. להחליף כל יום.
   3. לאחר הכנת אפיתל ההרחה היא מתחת למיקרוסקופ, לקחת חלק בפתרון זה במזרק 1 מיליליטר עם קצה צהוב-מוארך להבה למלא את האלקטרודות; להגן מפני אור ישיר. ברגע שב RT, פתרון nystatinאינו יציב; להחליף את הפתרון במזרק 1 מ"ל כל שעה או לשמור אותו בקרח.
5. משוך אלקטרודות הקלטה עם חולץ להשיג צוואר ארוך וטיפ קטן (~ 2 מיקרומטר) עם התנגדות של 15-20 MΩ עם פתרון nystatin הפנימי.
6. הכן פתרון odorant על 0.5 M בDMSO מתחת למכסה המנוע קטר; aliquot ולשמור ב -20 ° C עד שימוש. לדלל odorant בפתרון של רינגר עד הריכוז הרצוי. מלא את פיפטה הגירוי.

3. הכנת אפיתל הרחה

הערה: עכברים או-IRES-tauGFP להביע tauGFP תחת שליטתו של היזם או. בעכברים אלו, כל הנוירונים המבטאים את או עניין מסומנים עם GFP. פרוטוקול זה מותאם עבור חדרי הניתוח באו לידי ביטוי בכל האזורים. עם זאת, ניתוחים והקלטות קלים יותר לחדרי ניתוח הביע באזור הגב.

1. להרדים את החיה על ידי הזרקת תערובת של קטמין ו xylazine (150 מ"ג / קילוגרם ו -10 מ"ג / קילוגרם דירקטוריוןמשקל y, בהתאמה). עריפת ראש יכול להתבצע במספריים חדים לעכברים צעירים או עם הגיליוטינה מכרסמים מתוחזקים היטב לעכברים מבוגרים.
   1. מספריים לנתח טבעת באמצעות לעשות חתך המדיאלי אורך דרך עור הגב. הסר את העור על ידי משיכתו לגזרים. בעזרת המספריים, לחתוך את הלסתות התחתונות במפרק הלסת. הסר את השיניים הקדמיות העליונות במקביל חתך עטרה לשיניים.
   2. ביצוע חתך עטרה של הראש מאחורי העיניים ולשמור את החלק הקדמי בלבד של הראש. לטבול אותו בתמיסת רינגר קר כקרח לנתיחה בהיקף.
2. לנתח תחת ההיקף: בצד הגחון, לעשות חתך אורכי לאורך הלסת העליונה / השיניים. חותך את עצמות גב לאורך זמן, הבאים בצד dorso-הרוחב של חלל האף. להסיר את רוב העצמות וחיך; להעביר את המחיצה ואפיתל קשור אליו ברינגר חומץ בRT.
3. לנתיחה הסופית: ממש לפני שמתחילה את ההקלטהפגישה, לקלף את האפיתל מהמחיצה הבסיסית עם מלקחיים. לנתק את האפיתל עם מלקחיים ועם שני 4-5 חתכי מספריים מ"מ (מספריים microvannas שימוש) בחלק הקדמי של מחיצת האף שבו ההידבקות חזקה.
   1. מוציא בזהירות את איבר יעקובסון על ידי חיתוך אותו לאורך הגב שלה לחיבור האפיתל במחיצה. העבר את האפיתל לחדר הקלטה עם שכבת הריר פונה כלפי מעלה; לשמור את זה שטוח בתא עם נבל.
4. התקן תא תחת מיקרוסקופ הזקוף מצויד באופטיקה הקרינה ומצלמה רגישה. דמיין את ההכנה על מסך המחשב בהגדלה גבוהה דרך 40X מטרת מים טבילה (צמצם מספרי 0.8) והגדלת 2X או 4X נוסף הושגה על ידי זכוכית מגדלת. Perfuse ברציפות עם צלצול מחומצן בRT (1-2 מיליליטר / דקה).

4. הקלטת מושב

1. לחפש את תא ניאון: להלהיב את ההכנה ב480ננומטר לEGFP, אשר פולט אור בטווח 530-550 ננומטר; יעד ידית הדנדריטים אחד שהיא באופן מהימן גלוי בקרינה ותחת שדה בהיר.
2. מלא אלקטרודה עם פתרון תאיים עם nystatin; להסיר בועות בעדינות על ידי הקשה על האלקטרודה.
3. הכנס האלקטרודה על בעל אלקטרודה, להפעיל לחץ חיובי בפיפטה; התנגדות צריכה להיות 15-20 MΩ.
4. להביא האלקטרודה קרובה לתא; פעם התנגדות מגיעה ~ 40 MΩ, לשחרר לחץ חיובי ולהפעיל לחץ שלילי קל להגיע gigaseal.
5. ברגע שהוא הגיע חותם, להגדיר את פוטנציאל הממברנה בכ -75 mV;
6. ברגע שהתא נפתח, להמשיך עם פרוטוקולי גירוי, טיפולים תרופתיים. כדי למדוד את התגובה לגירוי odorant אחת, שיא 200-500 אלפיות שני של פעילות ספונטנית, לעורר עבור 500 אלפית שני ולמדוד את התגובה של התא לתקופה של עד 10 שניות ^13. לטיפולים תרופתיים, perfuse הסוכנים תרופתיים בהריכוז הרצוי ^20.

ניתוח נתונים 5.

1. לנתח זרמים שהושרו על ידי גירוי odorant אחריו כמו: משרעת המרביות, עלייה-הזמן (זמן דרוש כדי להגיע ל -90% ממשרעת המרבית, באלפיות שני), הסכום הנוכחי (שטח מתחת לעקומה בPAS), בפעם ב 50% (זמן בין תחילת והקיזוז של התגובה ב -50% את המשרעת המרבית, באלפיות השני).
   1. שימוש בזרמי התמרה השיא (משרעת מרבי הגיע) בריכוזים שונים, לצייר ולהתאים עקומת תגובת מינון באמצעות משוואת היל: אני = Imax / (1 ​​+ (K _1/2 / ⁿ C)), שבו אני מייצג את השיא נוכחי , IMAX התגובה המרבית בריכוזים להרוות, K1 / 2 הריכוז שבהגיעה מחצית מהתגובה המרבית, C ריכוז odorant וn מקדם היל.
2. ניתוח הקלטות של פוטנציאל הממברנה במהדק נוכחי לשלילת הקוטביות המרבית, טוטהפוטנציאל l הושר (שטח מתחת לעקומה בmVsec); פעילות שיא ספונטנית spiking מעל 30 שניות עד 1 הקלטות דקות; שיא רגישות דרך קוצים שהושרו על ידי הזרקה של זרמים (5-10 הרשות הפלסטינית).

תוצאות

התוצאה של פרוטוקול זה תלויה באיכות של הנתיחה. צעדים לנתיחה זה חייבים להיות קצרים (פחות מ 10 עד 15 דקות) ומדויקים (כלומר, כדי למנוע נזקים של האפיתל). איור 1 מדגים כיצד הכנה אידיאלית נראית כמו ברמות הגדלה שונות. בהגדלה נמוכה בשדה בהיר תאים מסוגים השונים (כגון י?...

Discussion

היכולת של פרוטוקול זה כדי לפקח בצורה נכונה את המאפיינים של OSNs הבריא תלויה במידה רבה באיכות של התכשיר. לכן, הצעדים לנתיחה הם קריטיים. הראשון הוא קריטי לשים לב לאיכות (pH, osmolarity), חמצון וטמפרטורה של המדיום לנתיחה (אבל לא קפוא קר כקרח). שנית, המניפולציה של האפיתל עם כלים לנתח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
vibration table with Faraday cage	TMC	63-500 SERIES	required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope	Olympus	BX51WI	upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives	Olympus	LUMPLFL40XW	at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera	Olympus	DP72	a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters	Olympus/Chroma		depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier	HEKA	EPC10 USB	monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software	HEKA	Patchmaster	controls the amplifier during the experiment
micromanipulator	Sutter	MP225	precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller	Sutter	P97	with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass	Sutter	BF120-69-10	in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber	Warner Instruments	RC-26G	a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass	WPI	TW100F-4	attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller	MDI	PMP-107-Z	by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector	Toohey Company	P/N T25-1-900 Single Channel	this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator	Narishige	YOU-1	a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings	N/A		tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump	gardner denver	300 series	a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system	N/A	N/A	gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin	Sigma-Aldrich	N3503	mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE	Sigma-Aldrich	D5879	used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	extracellular solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	extracellular solution
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	E3889	internal solution
Potassium hydroxyde	Sigma-Aldrich	P1767	internal solution
Methyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387509	intracellular solution
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	intracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	intracellular solution