Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Zusammenfassung

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Zusammenfassung

Analysieren der physiologischen Reaktionen von Riechzellen (OSN), wenn sie mit spezifischen Liganden stimuliert ist kritisch, um die Basis der olfaktorischen getriebenen Verhaltensweisen und deren Modulation zu verstehen. Diese Codierungseigenschaften hängen stark von der anfänglichen Interaktion zwischen Geruchsmolekülen und der Geruchsrezeptor (OR), ausgedrückt in der OSN. Die Identität, Spezifität und Ligandenspektrum der ausdrücklich oder kritisch sind. Die Wahrscheinlichkeit, den Liganden des OR finden Ausdruck in einer nach dem Zufallsprinzip im Epithel gewählt OSN ist sehr gering. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird in diesem Protokoll genetisch tagged Mäusen das fluoreszierende Protein GFP unter der Kontrolle des Promotors des definierten Randlage zum Ausdruck. OSNs sind in einer engen und organisierte Epithel der Nasenhöhle gelegen, mit Nachbarzellen zu beeinflussen ihre Reifung und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um eine intakte Riechepithel zu isolieren und durch Patch-Clamp-Aufnahmen erfassen die Eigenschaften OSNs expressing definierten Geruchsrezeptoren. Das Protokoll kann eine OSN Membraneigenschaften zu charakterisieren, während der Einfluss der benachbarten Gewebe. Analyse der Patch-Clamp-Ergebnisse ergibt eine präzise Quantifizierung der Ligand / oder Wechselwirkungen, Übertragungswege und Pharmakologie, OSNs "Kodierungseigenschaften und deren Modulation an der Membranebene.

Einleitung

Riechzellen (OSN) stellen den ersten Schritt der Geruchswahrnehmung. Das Hotel liegt im Riechepithel Auskleidung der Nasenhöhle in Nagetieren, verwandeln sie die chemische Informationen von Geruchsstoffen in Aktionspotentiale durch ihre Axon an das Gehirn gesendet. Die Duftverarbeitung Mechanismen besser zu verstehen, ist es notwendig, die Transduktion und Membraneigenschaften OSNs charakterisieren. Bis vor kurzem waren die meisten Techniken verwendet werden, um die Eigenschaften von Säugetier OSNs charakterisieren wurden an dissoziierten OSNs ^1-4 durchgeführt. Die Dissoziation Verfahren verwendet verschiedene mechanische und chemische (dh Enzyme) Prozesse, die OSNs aus ihrer Umgebung zu befreien. Diese Prozesse führen zu einer geringen Anzahl von verfügbaren Zellen für Aufzeichnungen. Diese geringe Zahl kann im Fall von GFP markierten Zellen noch kritisch. Dissoziation entfernt auch die lokale Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen OSNs und anderen Zellen des olfaktorischen Epithels surviv erhöhen kannal und Modulation OSNs 'Eigenschaften. Um die Dissoziation Verfahren umgehen, wurde ein intaktes Präparat ⁵ entwickelt.

Jedes OSN drückt eine Geruchsrezeptor (OR), die aus einer großen Multigenfamilie ^6. Es gibt ~ 1.000 OPs im Haupt Riechepithel in der Maus zum Ausdruck gebracht. Aufgrund der großen Anzahl von OR in Wildtyp-Tiere, die Chancen zu OSNs exprimieren denselben Datensatz oder sehr gering sind. Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Gen gerichtet Mäusen vorhanden, in der alle OSNs exprimieren eine bestimmte oder mit einem fluoreszierenden Protein, ^7-9 bezeichnet. Diese markierten OSNs wurden verwendet, um Funktionsanalyse in dissoziierten Vorbereitungen ^7,10,11 mit den bereits erwähnten Nachteilen zu tun. Ein intaktes Epithel Vorbereitung ⁵ aus genetisch markierten Mäusen umgeht daher diese Fragen. Es erlaubt die Überwachung der Aktivität des OSNs exprimieren genau definierten ORs in einer Umgebung so dicht in vivo wie möglich. Außerdem Patch-Clamp-Aufnahmen von OSNs erlauben auch genaue Analyse der Membraneigenschaften, Übertragungsweg Pharmakologie, Ligand / oder Wechselwirkungen. Alle diese Themen kaum mit extrazellulären Aufnahmen analysiert werden. Wir nutzten diese Technik, um die Reaktionen der OSNs Expression der Geruchsrezeptoren SR1 und MOR23 ^12,13 überwachen. Die Machbarkeit der Technik wurde von anderen Gruppen auf MOR23 ausdrücken OSNs ¹⁴ sowie auf andere Regionen in äußerster Rand exprimierenden Neuronen ^15,16 bestätigt. Die Überwachung eines definierten Population von OSNs können zur Analyse ihrer Eigenschaften in vielen verschiedenen Zusammenhängen wie Entwicklung ¹⁴ führen, Alterung ^17, Geruchsstoff induzierter Plastizität ^18, und die Rolle der Veränderungen in Folge der Geruchsrezeptor in Duftkodierung ^15. Dieses Protokoll stellt somit ein leistungsfähiges Werkzeug, um die funktionellen Eigenschaften definiert OSNs an der Membranebene zu überwachen.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Tierpflege Richtlinien der Université de Bourgogne und wurde von der Université de Bourgogne Ethikkommission genehmigt.

1. Tiere

1. Verwenden gentechnisch OR-IRES-tauGFP Mäuse verfügbar am Jackson Laboratory. Diese Mäuse wurden in Dr. Peter Mombaerts 'Labor, um Axon-Targeting und Entwicklung des olfaktorischen Systems ¹⁹ Analyse entwickelt. ZB die MOR23-IRES-tauGFP Linie, Fahrzeugnummer 006643, trägt den offiziellen Namen Stamm B6; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; Auch die SR1-IRES-tauGFP Linie, Fahrzeugnummer 6717 trägt den offiziellen Namen B6; 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ.
2. In Bezug auf das Alter der Tiere: für ein besseres Ergebnis der Protokoll verwenden Tieren zwischen 2 und 4 Wochen alt sind. In dieser Altersgruppe ist die Präparation leichter (weicher Knochen, festere Riechepithel) und die dendritischen Knöpfe sind bigger Vergleich zu älteren Tieren.

2. Herstellung von Elektroden und Lösungen

1. Für die anregende Pipetten: Kauf prepulled anregende Pipetten. Andernfalls manuell vorzubereiten.
   1. Unter Verwendung einer Flamme, biegen sechs 1 mm Glaspipetten bei etwa 1 cm von der Spitze. Legen Sie diese sechs Pipetten sowie eine gerade ^7. in 1,5 cm Schrumpfschlauch zu stärken durch eine Öse.
   2. Schrumpf den Schlauch, um die Fässer miteinander verbunden zu halten. Bringen Sie eine zusätzliche Schrumpfschlauch, um das andere Ende der Fässer. Ziehen Sie diese anregende Pipette mit einem Multi-Barrel Magnet.
   3. Fügen Sie etwas weiß Flüssigkleber rund um die Öse, um die gebogenen Spitzen zu stärken. Trocknen lassen O / N.
2. Vorbereitung 1 oder 2 L normaler Ringer- extrazelluläre Lösung (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO ₄ 1.3, CaCl _{2 2,} NaHCO ₃ 26, NaH ₂ PO ₄ 1,25, Glucose 15, pH 7,6 und 305 mOsm). Halten bei 4 ° Cbis zur Verwendung.
3. Vorbereitung intrazellulärem Stammlösung (in mM): KCl 70, KOH 53, Methansulfonsäure 30, EGTA 5, HEPES 10, Saccharose 70; pH 7,2 (KOH) und 310 mOsm. Halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. Gut für mehrere Wochen.
4. Bereiten intrazellulären Recording-Lösung mit Nystatin aus dem Stegreif (in letzter Minute), bevor Experiment.
   1. Wiegen 3 mg Nystatin, fügen Sie 50 ul DMSO; Wirbel 20 sec beschallen dann 2-3 Minuten, bis vollständig verdünnt.
   2. Mit 20 & mgr; l DMSO-Nystatin-Lösung in 5 ml Stammlösung intrazellulär. Vortex 20 sec, dann 3 min beschallen. Diese Lösung wird bei 4 ° C und vor direktem Licht schützen, ist Nystatin lichtempfindlich. Diese Lösung kann für einige Stunden verwendet werden. Jeden Tag zu ersetzen.
   3. Sobald das Riechepithel Präparat unter dem Mikroskop, nehmen Sie etwas von dieser Lösung in einer 1-ml-Spritze mit einer Flamme und gedehnten gelber Spitze, um die Elektroden zu füllen; vor direktem Licht schützen. Sobald bei RT, der Nystatin-Lösungnicht stabil ist; ersetzen Sie die Lösung in der 1 ml Spritze jede Stunde oder halten Sie es in Eis.
5. Ziehen Aufzeichnungselektroden mit einer Abziehvorrichtung langen Hals und kleine Spitze (~ 2 & mgr; m) mit einem Widerstand von 15-20 MOhm mit dem internen Nystatin-Lösung zu erhalten.
6. Bereiten Geruchsstoff-Lösung mit 0,5 M in DMSO unter Abzug; aliquoten bringen und -20 ° C bis zur Verwendung. Verdünnte Riechstoff in Ringer-Lösung, bis die gewünschte Konzentration. Füllen Sie den stimulierenden Pipette.

3. Herstellung von Riechepithel

Hinweis: oder-IRES-tauGFP Mäuse exprimieren das tauGFP unter der Steuerung der ODER-Promotor. Bei diesen Mäusen werden alle Neuronen, die oder von Interesse mit GFP markiert. Dieses Protokoll wird für die Regionen in äußerster Rand in allen Zonen ausgedrückt angepasst. Allerdings sind Dissektionen und Aufnahmen einfacher für OPs im Rückenbereich ausgedrückt.

1. Betäuben das Tier durch Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (150 mg / kg und 10 mg / kg BODy Gewicht, respectively). Enthauptung kann mit einer scharfen Schere für junge Mäuse oder mit einem ordnungsgemäß gewartet Nagetier Guillotine für ältere Mäuse durchgeführt werden.
   1. Verwendung Ring Präparierscheren einen mittleren Längsschnitt durch die Rückenhaut. Entfernen Sie die Haut, indem Sie sie auseinander. Mit der Schere, schneiden Sie die Unterkiefer im Kiefergelenk. Entfernen Sie die oberen Frontzähne durch einen koronalen Schnitt parallel zu den Zähnen.
   2. Machen Sie einen koronalen Schnitt des Kopfes hinter den Augen, und nur den vorderen Teil des Kopfes zu halten. Tauchen sie in eiskaltes Ringer-Lösung für die Präparation in den Geltungsbereich.
2. Sezieren in den Anwendungsbereich: in der Bauchseite, stellen einen Längsschnitt entlang der Oberkiefer / Zähne. Schneiden Sie die dorsalen Knochen in Längsrichtung nach der dorsolateralen Seite der Nasenhöhle. Entfernen Sie die meisten Knochen und Gaumen; übertragen die Scheidewand und das Epithel mit ihm verbunden in Sauerstoff angereichert Ringer bei RT.
3. Für die endgültige Präparation: Kurz vor Beginn der AufzeichnungSitzung, abziehen der Epithel von der zugrunde liegenden Septum mit einer Pinzette. Nehmen Sie das Epithel mit einer Pinzette und mit zwei 4-5 mm Scherenschnitte (Verwendung microvannas Schere) auf den vorderen Teil der Nasenscheidewand, wo die Haftung ist stärker.
   1. Entfernen Sie vorsichtig die Vomeronasalorgans durch Ausschneiden entlang der dorsalen Verbindung zum Septum-Epithel. Übertragen Sie das Epithel zu einer Aufzeichnungskammer, die mit der Schleimschicht nach oben; halten Sie es flach in der Kammer mit einer Harfe.
4. Installieren Kammer unter einem aufrechten Mikroskop mit Fluoreszenzoptik und einer empfindlichen Kamera ausgestattet. Visualisieren Sie die Vorbereitung auf dem Computerbildschirm bei hoher Vergrößerung durch ein 40-fach Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur 0,8) und ein extra 2X oder 4X Vergrößerung durch eine Vergrößerungslinse erreicht. Perfundieren kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert Ringer bei RT (1-2 ml / min).

4. Recording Session

1. Suchen Sie für fluoreszierende Zelle: regen die Herstellung bei 480nm für EGFP, die Licht im Bereich 530-550 nm emittiert; Ziel einer dendritischen Knopf, der in der Fluoreszenz und unter Hellfeld zuverlässig sichtbar ist.
2. Füllen Elektrode mit intrazellulären Lösung mit Nystatin; entfernen Luftblasen durch leichtes Antippen auf der Elektrode.
3. Einfügen Elektrode auf Elektrodenhalter, gelten positive Druck in der Pipette; Widerstand sollte 15-20 MOhm sein.
4. Bringen Elektrode in der Nähe der Zelle; einmal Widerstand erreicht ~ 40 MOhm, lassen Druck und mit leichtem Unterdruck wird eine undurchlässige erreichen.
5. Sobald Dichtung erreicht ist, setzen Sie das Membranpotential von etwa -75 mV;
6. Sobald die Zelle geöffnet wird, fahren Sie mit Stimulationsprotokolle, pharmakologische Behandlungen. Um die Antwort auf eine einzelne Riechstoff Stimulation Rekord 200-500 ms von spontaner Aktivität zu messen, zu stimulieren für 500 ms und messen die Antwort der Zelle bis zu 10 sec ^13. Für pharmakologische Behandlungen, durchströmen die pharmakologischen Mitteln andie gewünschte Konzentration ^20.

5. Datenanalyse

1. Analysieren von Geruchsstoffströme Stimulation ausgelöst wie folgt: die maximale Amplitude, die Anstiegszeit (Zeit notwendig, 90% der Maximalamplitude erreichen, in msec), dem Gesamtstrom (Fläche unter der Kurve in PAS), die Zeit, zu 50% (Zeit zwischen dem Beginn und dem Versatz der Reaktion bei 50% der maximalen Amplitude in ms).
   1. Mit den Spitzenübertragungsströme (maximale Amplitude erreicht) in unterschiedlichen Konzentrationen, ziehen und passen eine Dosis-Wirkungs-Kurve mit der Hill-Gleichung: I = Imax / (1 ​​+ (K _1/2 / C) ^n), wobei I den Spitzenstrom Imax die maximale Antwort bei sättigenden Konzentrationen, K1 / 2 die Konzentration, bei der die Hälfte der maximalen Reaktion erreicht war, C die Konzentration des Geruchsstoffs und n der Hill-Koeffizient.
2. Analysieren Sie Aufnahmen von Membranpotential in Stromzange für die maximale Depolarisation, die total Potential ausgelöst (Fläche unter der Kurve in mVsec); Rekord spontane spiking Aktivität über 30 sec bis 1 min-Aufnahmen; Rekord Erregbarkeit durch Spikes durch Injektion von Strömen (5-10 pA) ausgelöst.

Ergebnisse

Das Ergebnis dieses Protokolls ist abhängig von der Qualität der Präparation. Diese Dissektion Schritte müssen kurz (weniger als 10 bis 15 min) und präzise (dh auf Schäden des Epithels zu vermeiden) sein. Die 1 veranschaulicht, wie eine ideale Vorbereitung sieht aus wie bei verschiedenen Vergrößerungsstufen. Bei einer niedrigen Vergrößerung unter Hellfeld die verschiedenen Zelltypen (wie Knöpfe OSNs, Stützzellen) sind zu unterscheiden (Abbildung 1A). Bei der höchst...

Diskussion

Die Fähigkeit dieses Protokoll, um die Eigenschaften der gesunden OSNs korrekt überwachen hängt stark von der Qualität der Vorbereitung. Daher sind die Dissektion Schritte kritisch. Zunächst ist es wichtig, auf die Qualität (pH, Osmolarität), Sauerstoffzufuhr und Temperatur (eiskalten, aber nicht gefroren) der Dissektion Medium zu zahlen. Zweitens müssen die Manipulation der Epithel mit Präparierbesteck so begrenzt wie möglich ist, Schäden zu vermeiden. Schließlich ist es wichtig, eine Zubereitung so flach w...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
vibration table with Faraday cage	TMC	63-500 SERIES	required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope	Olympus	BX51WI	upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives	Olympus	LUMPLFL40XW	at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera	Olympus	DP72	a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters	Olympus/Chroma		depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier	HEKA	EPC10 USB	monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software	HEKA	Patchmaster	controls the amplifier during the experiment
micromanipulator	Sutter	MP225	precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller	Sutter	P97	with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass	Sutter	BF120-69-10	in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber	Warner Instruments	RC-26G	a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass	WPI	TW100F-4	attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller	MDI	PMP-107-Z	by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector	Toohey Company	P/N T25-1-900 Single Channel	this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator	Narishige	YOU-1	a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings	N/A		tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump	gardner denver	300 series	a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system	N/A	N/A	gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin	Sigma-Aldrich	N3503	mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE	Sigma-Aldrich	D5879	used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	extracellular solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	extracellular solution
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	E3889	internal solution
Potassium hydroxyde	Sigma-Aldrich	P1767	internal solution
Methyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387509	intracellular solution
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	intracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	intracellular solution