Перфорированные патч-зажим записи из мышей Обонятельные сенсорные нейроны в неповрежденном нейроэпителии: Функциональный анализ нейронов выражая идентифицированного одоранта рецептор

Резюме

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Аннотация

Анализируя физиологические реакции обонятельных сенсорных нейронов (ОСН) при стимуляции специфических лигандов важно понять основы обонятельных приводом поведения и их модуляции. Эти свойства кодирования в значительной степени зависят от начального взаимодействия между молекулами запаха и обонятельной рецептора (или) выражается в OSNs. Идентичность, специфика и лиганд спектр выраженных или являются критическими. Вероятность найти лиганд или выражены в OSN выбранной случайным образом в пределах эпителия является очень низким. Для решения этой проблемы, этот протокол использует генетически мышей отмеченных выражающие флуоресцентного белка GFP под контролем промотора, определенных ОР. OSNs находятся в тесной и организованной эпителия, выстилающих носовую полость, с соседние клетки, влияющие на их созревание и функции. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать нетронутыми обонятельного эпителия и записывать через патч-зажим записи свойства OSNs еxpressing определенные одоранта рецепторы. Протокол позволяет характеризовать свойства ОСН мембранные, сохраняя при этом влияние соседней ткани. Анализ результатов патч-зажим дает точную количественную оценку лиганд / или взаимодействий, трансдукции и фармакологии, свойства кодирования OSNs "и их модуляции на уровне мембраны.

Введение

Обонятельные сенсорные нейроны (OSN) представляют собой первый шаг обонятельной восприятия. Расположенный в обонятельный эпителий, выстилающей полость носа у грызунов, они преобразуют химическую информацию пахучих веществ в потенциалы действия, отправленных через их аксонов в мозг. Чтобы лучше понять, обонятельные механизмы кодирования, необходимо охарактеризовать трансдукции и мембранные свойства OSNs. До недавнего времени большинство из методов, используемых для характеристики свойств OSNs млекопитающих не проводили на диссоциации OSNs ^1-4. Процесс диссоциации использует различные механические и химические (т.е., ферменты) процессы, чтобы освободить OSNs из их среды. Эти процессы вызывают низкое число доступных ячеек для записей. Это низкое количество может быть еще более важным в случае GFP меченых клеток. Диссоциация также удаляет местной ячейки к клетке взаимодействия между OSNs и других клеток обонятельного эпителия, что может усилить survivаль и модуляции свойств OSNs. Для того, чтобы обойти процедуру диссоциации, нетронутыми препарат разработан ^5.

Каждый ОСН выражает один обонятельный рецептор (OR) выбран из большого семейством генов ^6. Есть ~ 1000 ОШ, выраженные в основном обонятельного эпителия у мышей. Из-за большого числа или в животных дикого типа, шансы записать OSNs экспрессирующих тот же или очень низкой. Чтобы преодолеть эти ограничения, генные целевой мышей доступны в которой все OSNs экспрессирующие идентифицированных или помечены флуоресцентного белка ^7-9. Эти меченые OSNs были использованы, чтобы сделать функциональный анализ в диссоциированных препаратов ^7,10,11 с недостатками, упомянутых ранее. Без изменений подготовка эпителий ⁵ из генетически маркированных мышей поэтому обходит эти вопросы. Это позволяет осуществлять мониторинг деятельности OSNs выражающих именно определенные ОШ в среде, максимально приближенных в VIVO, насколько это возможно. Кроме того, патч-зажим записи OSNs также позволит точный анализ мембранных свойств, трансдукции фармакологии, лиганд / или взаимодействия. Все эти темы вряд ли могут быть проанализированы с помощью внеклеточных записи. Мы использовали этот метод для контроля ответы OSNs выражающие одоранта рецепторы SR1 и MOR23 ^12,13. Технико-экономическое техники было подтверждено другими группами на MOR23 выражающих OSNs ^14, а также на других ОШ, выражающих нейроны ^15,16. Мониторинг определенного населения OSNs может привести к анализу их свойств в различных контекстах, таких как развитие ^14, старение ^17, отдушка индуцированной пластичность ¹⁸ и роль вариаций в последовательности одоранта рецептора запаха кодирования ^15. Этот протокол, таким образом, представляет собой мощный инструмент для мониторинга функциональных свойств, определенных OSNs на уровне мембраны.

протокол

Этот протокол следует рекомендациям по уходу животное на Университета Бургундии и был одобрен Комитетом по этике Университет де Бургундия.

1. Животные

1. Используйте генетически мышей ИЛИ IRES-tauGFP доступные в Jackson Laboratory. Эти мыши были разработаны в лаборатории доктора Питера Mombaerts 'для того, чтобы проанализировать аксонов адресности и развитие обонятельной системы ^19. Например, MOR23-IRES-tauGFP линия, инвентарный номер 006643, несет официальное название штамма B6; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; Аналогично, линия SR1-IRES-tauGFP, инвентарный номер 6717 носит официальное название В6; 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ.
2. Что касается возраста животных: на лучший исход протокола, использовать животных между 2 и 4-недельного возраста. В этой возрастной группе, рассечение легче (мягкие кости, прочнее обонятельный эпителий) и дендритные ручки биgger сравнить старых животных.

2. Подготовка электродов и решения

1. Для стимулирующих пипеток: покупка prepulled стимулирования пипетки. В противном случае, подготовить их вручную.
   1. С использованием пламени, согнуть шесть 1 мм стеклянные пипетки на 1 см от кончика. Вставьте эти шесть пипеток плюс прямые ^{7-е место} в 1,5 см термоусадочной трубки укрепить с помощью глазка.
   2. Термоусадочная трубки для поддержания баррелей прикрепленные вместе. Присоединение дополнительного трубки термоусадочные другой оконечности баррелей. Потяните стимулирующее пипетки с съемника нескольких баррель.
   3. Добавить немного белого жидкого клея вокруг глазка для укрепления изогнутой советы. Дайте высохнуть O / N.
2. Подготовка 1 или 2 л внеклеточной решение нормальный Рингера (в мм: 124 NaCl, KCl, 3, MgSO ₄ 1,3, CaCl _{2 2,} NaHCO ₃ 26, NaH ₂ PO ₄ 1,25, глюкоза 15; рН 7,6 и 305 мОсм). Хранить при температуре 4 ° Cдо использования.
3. Подготовка исходного раствора внутриклеточного (в мм): KCl 70, KOH 53, метансульфоновая кислота, EGTA 30, 5 HEPES 10, сахароза 70; рН 7,2 (КОН) и 310 мОсм. Хранить при 4 ° С до использования. Хорошо в течение нескольких недель.
4. Подготовка внутриклеточного решение для записи с нистатин экспромтом (в последнюю минуту) до эксперимента.
   1. Взвешивание 3 мг нистатин, добавить 50 мкл ДМСО; вихрь 20 сек, то разрушать ультразвуком 2-3 мин, пока полностью не разбавляют.
   2. Добавьте 20 мкл ДМСО-нистатин раствора в 5 мл раствора внутриклеточного. Вихревой 20 сек, а затем разрушать ультразвуком 3 минуты. Держите это решение при 4 ° С и защищают от прямого света, нистатин светочувствительный. Это решение может быть использовано в течение нескольких часов. Заменить каждый день.
   3. После обонятельный эпителий препарат под микроскопом, принять некоторые из этого раствора в 1 мл шприц с пламенем удлиненные желтого наконечника для заполнения электрода; защиты от прямого света. После того, как в РТ, нистатин решенияне является стабильным; заменить решение в 1 мл шприц каждый час или держать его на льду.
5. Потяните записи электроды с съемника, чтобы получить длинную шею и небольшие чаевые (~ 2 мкм) с сопротивлением 15-20 МОм с внутренним решением нистатина.
6. Подготовка одоранта раствор при 0,5 М в ДМСО под вытяжным шкафом; Аликвоту и держать при температуре от -20 ° С до использования. Развести не одоранта в растворе Рингера до желаемой концентрации. Заполните стимулирующее пипетки.

3. Подготовка обонятельного эпителия

Примечание: мышей ИЛИ-IRES-tauGFP выразить tauGFP под контролем промотора ИЛИ. В этих мышей, все нейроны, выражающие или интерес помечены GFP. Этот протокол адаптирован для ОШ, выраженных во всех зонах. Тем не менее, вскрытия и записи легче для ОШ, выраженных в зоне спинного.

1. Обезболить животное путем инъекции смеси кетамина и ксилазина (150 мг / кг и 10 мг / кг БПКу веса, соответственно). Обезглавливание может быть выполнена с острыми ножницами для молодых мышей или с надлежащим образом грызунов гильотины для старых мышей.
   1. Использование кольцевых рассечения ножницами сделать продольный разрез медиальной через кожу спины. Снимите кожу, потянув ее на части. Используя ножницы, вырезать нижние челюсти на нижнечелюстного сустава. Снимите верхние передние зубы корональной вырезанной параллельно к зубам.
   2. Сделайте разрез корональной головы позади глаз и держать только переднюю часть головы. Опустите его в ледяной Рингера раствор для вскрытия под сферу.
2. Проанализируйте под действие: в брюшной стороне, сделать продольный разрез вдоль верхней челюсти / зубов. Отрежьте спинной кости в продольном направлении, после спинно-боковой части носовой полости. Удалить большинство костей и вкус; перевести перегородку и эпителий, прикрепленный к ней в окисленной Ringer при комнатной температуре.
3. Для окончательного вскрытия: Прямо перед началом записисессия, удаляйте эпителий от подлежащей перегородки щипцами. Снять эпителий с пинцетом и с двумя 4-5 мм разрезами ножницами (использование microvannas ножницы) на передней части перегородки, где адгезия сильнее.
   1. Осторожно снимите вомероназальный орган путем разрезания его вдоль спинного подключения к перегородки эпителия. Перевести эпителия к записи камеры со слоем слизи вверх; держать его квартиру в камере с арфой.
4. Установите камеру под прямой микроскоп, снабженный флуоресцентной оптики и чувствительного камеры. Представьте себе препарат на экране компьютера в высоком увеличении через 40X воды погружения объективной числовой апертурой (0.8) и дополнительную 2X 4X или увеличении достигнутого лупой. Заливать непрерывно с кислородом Рингера при комнатной температуре (1-2 мл / мин).

4. Запись сессии

1. Поиск для люминесцентных ячейки: возбуждают подготовку на 480нм для EGFP, который излучает свет в диапазоне 530-550 нм; цель одна дендритных ручки, которая надежно видно флуоресценции и при ярком поле.
2. Заполните электрод с внутриклеточной раствора с нистатин; удалить пузырьки, осторожно постукивая по электрода.
3. Вставьте электрод на держатель электрода, применять положительное давление в пипетку; Сопротивление должно быть 15-20 МОм.
4. Доведите электрод близко к камере; когда сопротивление достигает ~ 40 МОм, отпустите положительное давление и применять небольшое отрицательное давление для достижения gigaseal.
5. После того, как печать будет достигнута, устанавливается мембранный потенциал на -75 мВ;
6. После того, как клетка открыта, перейдите протоколов стимуляции, фармакологического лечения. Для измерения ответа на один одоранта стимуляции, запись 200-500 мс спонтанной активности, стимулировать за 500 мс и измерить реакцию клетки на срок до 10 сек ^13. Для фармакологического лечения, заливать фармакологические агенты нажелаемая концентрация ^20.

5. Анализ данных

1. Анализ течения, вызываемые одоранта стимуляции, как следует: максимальную амплитуду, рост времени (время, необходимое для достижения 90% от максимальной амплитуды, в мс), суммарный ток (площадь под кривой в PAS), время на 50% (время между началом и смещение ответ на 50% от максимальной амплитуды, в мс).
   1. Использование пик трансдукции токов (максимальная амплитуда достигается) в различных концентрациях, рисовать и соответствовать кривую, используя уравнение Хилла: Я = Imax / (1 ​​+ (К _1/2 / С) ^п), где я представляет пиковый ток , Imax максимальный отклик у насыщающих концентрациях К1 / 2 концентрации, при которой была достигнута половина максимального ответа, C концентрации одоранта и п коэффициент Хилл.
2. Анализ записей мембранного потенциала в текущей зажим для максимальной деполяризации, по Тотал вызывало потенциал (площадь под кривой) в mVsec; запись спонтанной пики активности в течение 30 сек до 1 мин записей; запись возбудимость через шипы вызываемых инъекции токов (5-10 Па).

Результаты

Результатом этого протокола зависит от качества вскрытия. Это рассечение шаги должны быть короткими (менее от 10 до 15 мин) и точным (т.е., чтобы избежать повреждения эпителия). Рисунок 1 иллюстрирует, как идеальная подготовка похоже на разных уровнях увеличения. На малом увел...

Обсуждение

Способность этого протокола правильно контролировать свойства здоровых OSNs в значительной степени зависит от качества препарата. Таким образом, шаги рассечение являются критическими. Во-первых важно обратить внимание на качество (рН, осмолярность), оксигенации и температуры (льдом хо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
vibration table with Faraday cage	TMC	63-500 SERIES	required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope	Olympus	BX51WI	upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives	Olympus	LUMPLFL40XW	at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera	Olympus	DP72	a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters	Olympus/Chroma		depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier	HEKA	EPC10 USB	monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software	HEKA	Patchmaster	controls the amplifier during the experiment
micromanipulator	Sutter	MP225	precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller	Sutter	P97	with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass	Sutter	BF120-69-10	in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber	Warner Instruments	RC-26G	a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass	WPI	TW100F-4	attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller	MDI	PMP-107-Z	by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector	Toohey Company	P/N T25-1-900 Single Channel	this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator	Narishige	YOU-1	a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings	N/A		tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump	gardner denver	300 series	a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system	N/A	N/A	gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin	Sigma-Aldrich	N3503	mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE	Sigma-Aldrich	D5879	used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	extracellular solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	extracellular solution
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	E3889	internal solution
Potassium hydroxyde	Sigma-Aldrich	P1767	internal solution
Methyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387509	intracellular solution
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	intracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	intracellular solution