본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

요약

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

초록

특정 리간드로 자극시 후각 감각 뉴런의 생리적 반응 (OSN)를 분석하는 것은 후각 구동 동작과 그 변조의 기초를 이해하는 것이 중요하다. 이러한 코딩 특성은 냄새 분자와 후각 수용체 (OR) 사이의 초기 상호 작용에 크게 의존하는 OSNs로 표현. 명시 적 또는 중요한의 ID, 특이 리간드 스펙트럼. 또는의 리간드를 찾을 수있는 확률은 상피 내에서 무작위로 선택된 OSN 매우 낮은 표현했다. 이러한 과제를 해결하기 위해,이 프로토콜은 전적으로 정의 논리합의 프로모터의 제어하에 형광 단백질 GFP를 발현하는 태깅 된 마우스를 사용한다. OSNs는 이웃 세포가 자신의 성숙과 기능에 영향을 미치는으로, 비강 안감 꽉 및 조직 상피에 있습니다. 여기에서 우리는 OSNs 전자의 속성을 그대로 후각 상피를 분리하고 패치 클램프 녹음을 기록하는 방법을 설명정의 후각 수용체를 xpressing. 프로토콜은 인접한 조직의 영향을 유지하면서 하나 OSN 막 성질을 특성화 할 수있다. 패치 클램프 결과의 분석은 리간드 / 또는 상호 작용, 전달 경로 및 약리학, OSNs '코딩 특성과 막 수준에서 자신의 변조의 정확한 정량을 산출한다.

서문

후각 감각 뉴런 (OSN)는 후각 인식의 첫 번째 단계를 나타냅니다. 설치류의 비강에 선을 긋고있는 후각 상피에 위치한, 그들은 뇌에 자신의 축삭을 통해 전송 활동 전위에 냄새 물질의 화학적 정보를 변환. 더 후각 부호화 메커니즘을 이해하기 위해서는 OSNs의 전달 및 막 특성을 특성화하는 것이 필요하다. 최근까지, 포유 동물 OSNs의 성질을 특성화하기 위해 사용되는 기법은 대부분 해리 OSNs ^1-4에서 수행 하였다. 해리 과정은 자신의 환경에서 OSNs을 확보하기 위해 다양한 기계 및 화학 물질 (즉, 효소) 프로세스를 사용합니다. 이러한 과정은 녹화 가능 세포의 낮은 번호를 유도한다. 이러한 낮은 수는 GFP 표지 된 세포의 경우에 훨씬 더 중요 할 수있다. 해리도 및 OSNs surviv 중을 상승시킬 수 후각 상피의 다른 셀 간의 로컬 세포 간 상호 작용을 제거알과 OSNs '속성의 변조. 해리 과정을 생략하기 위해, 제제는 그대로 ⁵ 개발되었다.

각 OSN은 큰 multigene 가족 ^(6)에서 선택 (OR) 하나의 후각 수용체를 표현한다. 마우스의 주요 후각 상피 세포에서 발현 1,000 관찰 보고서는 ~가 있습니다. 인해 야생형 동물 OR의 다수에, 기회는 동일한 발현 OSNs 기록 OR 매우 낮은한다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 유전자 표적으로 마우스를 사용할 수있는 식별 또는 형광 단백질 ^7-9로 표시되어 표현하는 모든 OSNs. 이 표시 OSNs는 해리 준비 앞에서 언급 한 단점과 ^7,10,11에 기능 분석을 수행 하였다. 유전자 표지 된 마우스의 상피 손상 ^{5- 따라서} 이러한 문제를 회피. 이것은 VI에서에 가까운 환경에서 정확하게 정의 논리합을 표현 OSNs의 활동의 모니터링을 허용가능한 한 VO. 게다가, OSNs의 패치 클램프 녹음도 막 특성, 전달 경로의 약리학, 리간드 / 또는 상호 작용의 정확한 분석을 할 수 있습니다. 이러한 모든 항목은 거의 세포 외 녹음을 사용하여 분석 할 수 없습니다. 우리 취제 수용체 SR1 및 MOR23 ^12,13 발현 OSNs의 응답을 모니터링하기 위해이 기술을 사용했다. 기술의 실현 가능성은 뉴런 ^{15,16 표현} OSNs ¹⁴ 발현 MOR23에 다른 그룹뿐만 아니라 다른 논리합에 의해 확인 하였다. OSNs의 정의 인구의 모니터링 ⁽¹⁷⁾ 노화, 이러한 개발 ^(14)와 같은 많은 다른 상황에서 그 특성의 분석으로 이어질 수, 부 취제 유도 소성 ^{(18), 15 코딩} 냄새에 후각 수용체의 서열 변화의 역할. 이 프로토콜은, 따라서 멤브레인 레벨에서 정의 OSNs의 기능적 특성을 모니터링하는 강력한 도구를 제공한다.

프로토콜

이 프로토콜은 Université 드 부르고뉴의 동물 보호 지침을 다음과 Université 드 부르고뉴 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 동물

1. 잭슨 연구소 가능한 유전자 조작 또는-IRES-tauGFP 마우스를 사용합니다. 이러한 마우스는 후각 기관 ^(19)의 축삭 타겟팅 및 개발을 분석하기 위해 닥터 피터 Mombaerts '실험실에서 개발되었다. 예를 들어, MOR23-IRES-tauGFP 라인, 재고 번호 006643는 공식 변형 이름 B6 곰, 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ을; 유사하게, SR1-IRES-tauGFP 라인은 재고 번호 6717의 공식 이름 B6 곰, 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ을.
2. 동물의 연령에 대해서는 : 프로토콜의 더 나은 결과를 위해, 생후 2 4 주 사이에 동물을 사용한다. 이 연령 그룹에서 해부 쉽게 (부드러운 뼈, 탄력있는 후각 상피 세포)와 수지상 노브는 양방향입니다입니다gger 오래된 동물에 비교합니다.

전극 및 솔루션 2. 준비

1. 자극 피펫의 경우 : 구입 피펫을 자극 prepulled. 그렇지 않으면, 수동으로 준비합니다.
   1. 화염을 사용하여, 선단에서 약 1cm의 6 1mm 유리 피펫을 구부리. 구멍에 의해 강화 1.5 CM 열 수축 관에이 여섯 피펫 플러스 바로 7 ^번째를 삽입합니다.
   2. 열은 배럴 함께 접착을 유지하기 위해 수축 배관. 배럴의 다른 말단에 추가로 열 수축 튜브를 연결합니다. 멀티 배럴 풀러와 함께이 자극 피펫을 당깁니다.
   3. 굽​​ 팁을 강화하기 위해 구멍 주위에 약간의 흰색 액체 접착제를 추가합니다. 건조 O를 /의 N하자.
2. 일반 링어의 세포 외 액의 1 또는 2 L 준비 (MM에서 : 염화나트륨 (124)의 KCl 3, _황산 1.3, _CaCl2를 2, _NaHCO3를 26의 NaH ₂ PO ₄ 1.25, 포도당 (15), pH가 7.6, 305 mOsm). 4 ° C에서 유지사용할 때까지.
3. (MM)에 세포 원액 준비 : KCl을 70, KOH (53), 메탄 설 폰산 (30), EGTA 5, HEPES (10), 수 크로스 (70); pH가 7.2 (KOH), 310 mOsm. 사용까지 4 ℃에서 보관하십시오. 몇 주에 대 한 좋은.
4. 실험 전에 (마지막 순간) 즉흥적 니 스타틴과 세포 내 기록 솔루션을 준비합니다.
   1. DMSO의 50 μl를 추가, 니 스타틴의 3 mg의 무게; 완전히 희석 될 때까지 소용돌이 20 초 후 2 ~ 3 분을 초음파 처리.
   2. 세포 내 원액 5ml에 DMSO-니 스타틴 용액 20 μl를 추가합니다. 소용돌이 20 초 후 3 분을 초음파 처리. 4 ° C에서이 솔루션을 유지하고 직사광선으로부터 보호, 니 스타틴은 빛에 민감한입니다. 이 용액을 몇 시간 동안 사용할 수있다. 매일 교체합니다.
   3. 후각 상피 준비가 현미경되면, 전극을 채우기 위해 불꽃 긴 노란색 팁 1 ML의 주사기에이 솔루션의 일부를 가지고; 직사광선으로부터 보호합니다. RT에서, 니 스타틴 용액 일단안정되지; 매 시간마다 주사기 또는 얼음에 보관 ㎖로 1 솔루션을 교체합니다.
5. 내부 니 스타틴 솔루션을 15 ~ 20 MΩ의 저항과 긴 목과 작은 팁 (~ 2 μm의)를 얻기 위해 풀러와 기록 전극을 당깁니다.
6. 흄 후드 아래에 DMSO 0.5 M에서 취제 솔루션을 준비; 나누어지는 및 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오. 원하는 농도까지 링거액에 부 취제를 희석. 자극 피펫을 채 웁니다.

후각 상피 3. 준비

주 : OR-IRES-tauGFP 마우스는 OR 프로모터의 제어하에 tauGFP 표현. 이 마우스에서 관심의 또는를 표현하는 모든 신경 세포는 GFP로 표시되어 있습니다. 이 프로토콜은 모든 영역에서 발현 논리합하도록 구성된다. 그러나, 해부 및 녹음 등의 영역에서 표현 관찰 보고서에 대한 쉽다.

1. 자일 라진 및 케타민 (150 ㎎ / ㎏ 및 10 ㎎ / ㎏ BOD의 혼합 주사하여 동물을 마취Y 무게, 각각). 참수는 젊은 쥐에 대한 이상 마우스에 대한 제대로 관리 설치류 단두대와 날카로운 가위로 수행 할 수 있습니다.
   1. 사용 링 해부 가위는 등쪽 피부를 통해 종 방향 내측 절개를합니다. 그것을 떨어져 당겨 피부를 제거합니다. 가위를 사용하여 턱 관절에서 아래턱을 잘라. 치아 관상 컷 병렬로 위 앞니를 제거합니다.
   2. 눈 뒤에 머리의 관상 컷을 확인하고 머리의 앞쪽 부분을 유지. 범위에서 해부를위한 얼음처럼 차가운 링거 용액에 담근다.
2. 범위에서 해부 : 복부 측면에서, 위 턱 / 이빨을 따라 길이 절단을합니다. 비강 배측-외측부 다음, 종 지느러미 뼈를 잘라. 대부분의 뼈와 미각을 제거; 실온에서 산소 벨소리에 부착 된 격벽과 상피 세포를 전송합니다.
3. 최종 절개의 경우 : 마우스 오른쪽 버튼으로 녹화를 시작하기 전에세션은, 집게로 기본 격막에서 상피를 벗겨. 집게와의 접착 성이 강한 격막의 앞쪽 부분에 두 4-5mm의 가위 컷 (사용 microvannas 가위)와 상피를 분리합니다.
   1. 조심스럽게 중격 상피에 그 등의 연결을 따라 밖으로 절단하여 골코 (vomeronasal) 기관을 제거합니다. 위로 향하게 점액층으로 기록 챔버로 이동 상피; 하프와 챔버에 평면을 유지.
4. 형광 광학 및 민감한 카메라가 장착 된 수직 현미경 실을 설치합니다. 40X 물 침지 목표 (개구 0.8) 및 확대 렌즈에 의해 달성 여분의 2 배 또는 4 배 확대를 통해 높은 배율에서 컴퓨터 화면의 준비를 시각화. 실온에서 산소 벨소리 (1-2 ml / 분)와 함께 지속적으로 관류.

4. 녹음 세션

1. 형광 셀에 대한 검색 : 480에서 준비를 자극530-550 nm의 범위에서 발광 용 나노 EGFP; 형광의 밝은 분야에서 확실하게 볼 수 있습니다 하나 수지상 노브를 대상으로.
2. 니 스타틴과 세포 내 솔루션 전극을 채우기; 부드럽게 전극에 눌러 거품을 제거합니다.
3. , 전극 홀더에 전극을 삽입 피펫에 긍정적 인 압력을 적용; 저항은 15 ~ 20 MΩ해야한다.
4. 셀에 가까운 전극을 가져와; 저항 ~ 40 MΩ에 도달하면, 긍정적 인 압력을 해제하고 기가 시일에 도달하려면 약간의 부정적인 압력을 적용합니다.
5. 시일에 도달하면, 약 -75 MV의 막 전위를 설정;
6. 셀이 열리면 자극 프로토콜 약리 치료 진행. 단일 자극 취제, 기록 자발 활동 200-500 밀리에 대한 응답을 측정하기 위해 500 msec의 자극과 최대 10 초 ¹³ 대 세포의 반응을 측정한다. 약물 치료의 경우에서 약리 에이전트를 관류원하는 농도 ^(20).

5. 데이터 분석

1. 그 다음으로 취제 자극 유도 전류를 분석 (밀리 초에서 최대 진폭의 90 %에 도달하는데 필요한 시간)의 최대 진폭, 상승 시간, 전체 전류 (PAS의 곡선 아래 영역), 시간을 50 % (개시 및 밀리에서 최대 진폭의 50 %의 응답 시간 사이의 오프셋).
   1. 그리는 힐 방정식을 이용하여 투여 량 반응 곡선에 맞는 서로 다른 농도 (최대 진폭에 도달) 피크 전달 전류를 사용 : I = 아이 맥스 / (1 ​​+ (K _1/2 / C) ^N) I는 피크 전류를 나타내고, , 최대 반응의 절반에 도달되었을 때의 K1 / 2 농도, C 취제의 농도이고; n은 힐 (Hill) 계수를 포화 농도에서 최대 반응을 IMAX.
2. 최대 탈분극의 현재 클램프자는 tota을 막 전위의 기록을 분석L 전위 (mVsec에서 곡선 아래 면적)를 유발; 30 초 ~ 1 분 녹음을 통해 기록 자발적인 급상승 활동; 전류 (5 ~ 10 PA)의 주입에 의해 유도 스파이크를 통해 기록 흥분.

결과

이 프로토콜의 결과는 절개의 품질에 따라 달라집니다. 이 해부 단계는 짧은 (이하 10 분 ~ 15) 및 (즉, 상피 세포의 손상을 방지하기 위해) 정확해야합니다. 그림 1은 이상적인 준비가 다른 배율 수준에서처럼 보이는 방법을 보여줍니다. 밝은 필드 아래 낮은 배율 (예컨대 세포를지지 OSNs의 손잡이와 같은) 다른 유형의 세포는 구별 (도 1A)이다. 최대 배율 수준에서, 일?...

토론

올바르게 건강한 OSNs의 특성을 모니터링이 프로토콜의 능력은 제제의 품질에 크게 의존한다. 따라서, 해부 단계는 매우 중요하다. 첫째는 품질 (PH, 삼투압), 산소 및 온도 (빙냉하지만 냉동 생략) 해부 배지에 주목하는 것이 중요하다. 둘째, 해부 도구 상피의 조작 등의 손상을 피하기 위해 가능한 한 제한해야한다. 마지막으로, 가능한 최대 OSN 인구를 액세스하기 위해 가능한 한 평탄 제제를 얻는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
vibration table with Faraday cage	TMC	63-500 SERIES	required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope	Olympus	BX51WI	upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives	Olympus	LUMPLFL40XW	at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera	Olympus	DP72	a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters	Olympus/Chroma		depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier	HEKA	EPC10 USB	monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software	HEKA	Patchmaster	controls the amplifier during the experiment
micromanipulator	Sutter	MP225	precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller	Sutter	P97	with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass	Sutter	BF120-69-10	in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber	Warner Instruments	RC-26G	a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass	WPI	TW100F-4	attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller	MDI	PMP-107-Z	by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector	Toohey Company	P/N T25-1-900 Single Channel	this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator	Narishige	YOU-1	a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings	N/A		tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump	gardner denver	300 series	a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system	N/A	N/A	gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin	Sigma-Aldrich	N3503	mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE	Sigma-Aldrich	D5879	used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	extracellular solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	extracellular solution
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	E3889	internal solution
Potassium hydroxyde	Sigma-Aldrich	P1767	internal solution
Methyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387509	intracellular solution
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	intracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	intracellular solution