Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Résumé

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Résumé

Analysant les réactions physiologiques des neurones sensoriels olfactifs (OSN) lorsqu'elles sont stimulées par des ligands spécifiques est essentiel de comprendre la base de comportements olfactifs moteur et leur modulation. Ces propriétés de codage dépendent fortement de l'interaction initiale entre les molécules d'odeur et le récepteur olfactif (OU) exprimées dans les ARS. L'identité, la spécificité et le ligand spectre du exprimés ou sont critiques. La probabilité de trouver le ligand de l'OU exprimé dans un OSN choisi au hasard dans l'épithélium est très faible. Pour relever ce défi, ce protocole utilise des souris génétiquement marquées exprimant la protéine fluorescente GFP sous le contrôle du promoteur des RUP définies. ARS sont situés dans un épithélium serré et organisé garniture de la cavité nasale, avec les cellules voisines influencer leur maturation et la fonction. Nous décrivons ici une méthode pour isoler un épithélium olfactif intact et enregistrer par patch-clamp enregistrements les propriétés des ARS expressing récepteurs olfactifs définies. Le protocole permet de caractériser les propriétés de la membrane OSN tout en maintenant l'influence du tissu voisin. Analyse des résultats de patch-clamp donne une quantification précise de ligand / ou des interactions, des voies de transduction et de la pharmacologie, les propriétés de codage de ARS et leur modulation au niveau de la membrane.

Introduction

Les neurones sensoriels olfactifs (OSN) représentent la première étape de la perception olfactive. Situé dans l'épithélium olfactif tapissant la cavité nasale chez les rongeurs, ils transforment les informations chimique de substances odorantes dans des potentiels d'action envoyés par leurs axones dans le cerveau. Pour mieux comprendre les mécanismes de codage olfactif, il est nécessaire de caractériser les propriétés de transduction et membranaires de ARS. Jusqu'à récemment, la plupart des techniques utilisées pour caractériser les propriétés des ARS de mammifères ont été effectuées sur dissocié ARS ^4.1. Le processus de dissociation utilise divers (c.-à-enzymes) des procédés mécaniques et chimiques pour libérer les ARS de leur environnement. Ces processus induisent un faible nombre de cellules disponibles pour les enregistrements. Ce faible nombre peut être encore plus critique dans le cas des cellules GFP étiqueté. La dissociation supprime également les interactions locales de cellule à cellule entre les ARS et d'autres cellules de l'épithélium olfactif qui peuvent améliorer SURVIVal et la modulation des propriétés de ARS. Afin de contourner la procédure de dissociation, une préparation intacte ⁵ a été développé.

Chaque OSN exprime un récepteur olfactif (OU) choisi parmi une grande famille multigénique ^6. Il ya ~ 1000 RUP exprimées dans la principale épithélium olfactif chez la souris. En raison du grand nombre d'OR dans les animaux de type sauvage, les chances d'enregistrer ARS exprimant le même OU sont très faibles. Pour surmonter ces limitations, les souris de gènes ciblés sont disponibles dans lequel tous les ARS exprimant une personne identifiée ou sont étiquetés avec une protéine fluorescente ^7-9. Ces ARS marquées ont été utilisés pour faire l'analyse fonctionnelle dans les préparations dissociées ^7,10,11 avec les inconvénients mentionnés plus haut. Une préparation de l'épithélium intact ⁵ de souris génétiquement marqués contourne donc sur ces questions. Il permet le suivi de l'activité des ARS exprimant RUP précisément définies dans un environnement aussi près dans vivo que possible. En outre, les enregistrements de patch-clamp de ARS permettent également une analyse précise des propriétés de la membrane, transduction voie pharmacologie, ligand / ou des interactions. Tous ces sujets peuvent difficilement être analysées à l'aide des enregistrements extracellulaires. Nous avons utilisé cette technique pour surveiller les réponses des ARS exprimant les récepteurs olfactifs SR1 et MOR23 ^12,13. La faisabilité de la technique a été confirmée par d'autres groupes sur MOR23 exprimant ARS ¹⁴ ainsi que sur les autres RUP exprimant neurones ^15,16. Le suivi d'une population définie de ARS peut conduire à l'analyse de leurs propriétés dans de nombreux contextes différents tels que le développement ^{14, 17} vieillissement, odorant induite plasticité ^18, et le rôle des variations de la séquence du récepteur olfactif de l'odeur de codage ^15. Ce protocole fournit ainsi un outil puissant pour surveiller les propriétés fonctionnelles des ARS définies au niveau de la membrane.

Protocole

Ce protocole suit les directives de protection des animaux de l'Université de Bourgogne et a été approuvé par le comité d'éthique de l'Université de Bourgogne.

1. Les animaux

1. Utilisez la souris OU-IRES-tauGFP génétiquement disponibles au Laboratoire Jackson. Ces souris ont été développés dans le laboratoire du Dr Peter Mombaerts afin d'analyser le ciblage et le développement des axones du système olfactif ^19. Par exemple, la ligne MOR23-IRES-tauGFP, numéro de stock 006643, porte le nom officiel de la souche B6; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; de même, la ligne SR1-IRES-tauGFP, stock number 6717 porte le nom B6 officielle; 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ.
2. En ce qui concerne l'âge des animaux: pour un meilleur résultat du protocole, utiliser des animaux entre 2 et 4 semaines d'âge. Dans ce groupe d'âge, la dissection est plus facile (os plus doux, plus ferme épithélium olfactif) et les boutons dendritiques sont bigger comparer aux animaux plus âgés.

2. Préparation des électrodes et Solutions

1. Pour les pipettes de stimulation: achat prepulled stimuler pipettes. Sinon, les préparer manuellement.
   1. Utiliser une flamme, pliez six pipettes en verre de 1 mm à environ 1 cm de la pointe. Insérez ces six pipettes droites plus un 7 ^ème dans 1,5 cm gaine thermorétractable renforcer par un oeillet.
   2. Thermorétractable tube pour maintenir les barils attachés ensemble. Fixez un tube thermorétractable additionnelle à l'autre extrémité des barils. Tirez cette pipette stimulant avec un extracteur multi-canon.
   3. Ajouter un peu de colle liquide blanc autour de l'oeillet de renforcer les conseils pliés. Laisser sécher O / N.
2. Préparez 1 ou 2 L de solution extracellulaire normale Ringer (en mM: NaCl 124, KCl 3, _MgSO4 1,3, _CaCl2 2, NaHCO ₃ 26, NaH ₂ PO ₄ 1,25, le glucose 15; pH 7.6 et 305 mOsm). Conserver à 4 ° Cjusqu'à utilisation.
3. Préparer une solution stock intracellulaire (en mM): KCl 70, 53 KOH, l'acide méthane 30, EGTA 5, HEPES 10, 70 saccharose; pH 7,2 (KOH) et 310 mOsm. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation. Conseillé pour plusieurs semaines.
4. Préparer la solution intracellulaire d'enregistrement avec nystatine extemporanée (à la dernière minute) avant l'expérience.
   1. Peser 3 mg de nystatine, ajouter 50 pi de DMSO; vortex 20 sec Soniquer puis 2-3 min jusqu'à entièrement diluée.
   2. Ajouter 20 pi de solution de DMSO-nystatine dans 5 ml de solution de réserve intracellulaire. Vortex 20 sec, puis Soniquer 3 min. Gardez cette solution à 4 ° C et de protéger de la lumière directe, la nystatine est sensible à la lumière. Cette solution peut être utilisée pendant quelques heures. Remplacer tous les jours.
   3. Une fois la préparation de l'épithélium olfactif est sous le microscope, prendre un peu de cette solution dans une seringue de 1 ml avec une pointe jaune flamme allongée pour remplir les électrodes; protéger de la lumière directe. Une fois à température ambiante, la solution de nystatineest pas stable; remplacer la solution dans la seringue de 1 ml toutes les heures ou le garder dans la glace.
5. Tirez électrodes d'enregistrement avec un extracteur d'obtenir à long cou et petit pourboire (~ 2 um) avec une résistance de 15-20 MQ avec la solution de nystatine interne.
6. Préparer la solution odorant à 0,5 M dans le DMSO sous une hotte; aliquote et de garder à -20 ° C jusqu'à utilisation. Diluer substance odorante dans la solution de Ringer jusqu'à la concentration désirée. Remplissez la pipette stimulant.

3. Préparation de l'épithélium olfactif

Remarque: souris OU-IRES-tauGFP expriment la tauGFP sous le contrôle de l'OU promoteur. Chez ces souris, tous les neurones exprimant l'OU d'intérêt sont étiquetés avec la GFP. Ce protocole est adapté pour les RUP exprimées dans toutes les zones. Cependant, les dissections sont plus faciles et les enregistrements de RUP exprimées dans la zone dorsale.

1. Anesthésier l'animal par injection d'un mélange de kétamine et de xylazine (150 mg / kg et 10 mg / kg DBOpoids y, respectivement). Décapitation peut être effectuée avec des ciseaux pointus pour les jeunes souris ou avec une guillotine de rongeur bien entretenu pour les souris âgées.
   1. Aide de la bague des ciseaux de dissection font une incision médiane longitudinale à travers la peau du dos. Retirer la peau en le tirant à part. En utilisant les ciseaux, couper les mâchoires inférieures à l'articulation de la mâchoire. Retirez les incisives supérieures par une coupe coronale parallèle aux dents.
   2. Faire une coupe coronale de la tête derrière les yeux et de ne conserver que la partie antérieure de la tête. Tremper dans une solution de Ringer glacée pour la dissection sous la portée.
2. Disséquer sous le champ d'application: dans la face ventrale, faire une coupe longitudinale le long de la mâchoire supérieure / les dents. Couper les os dorsale longitudinalement, suivant la partie dorso-latérale de la cavité nasale. Retirer la plupart des os et du palais; transférer le septum et l'épithélium attaché à elle dans oxygéné Ringer à RT.
3. Pour la dissection final: Juste avant de commencer l'enregistrementsession, décoller l'épithélium de la cloison sous-jacent avec une pince. Détachez l'épithélium avec une pince et avec deux coupes 4-5 mm de ciseaux (utilisation microvannas ciseaux) à la partie antérieure de la cloison où l'adhérence est plus forte.
   1. Retirez délicatement l'organe voméronasal par découpe le long de sa connexion dorsale à l'épithélium septale. Transfert de l'épithélium à une chambre d'enregistrement avec la couche de mucus vers le haut; garder à plat dans la chambre avec une harpe.
4. Installez chambre sous un microscope droit équipé d'une optique de fluorescence et une caméra sensible. Visualisez la préparation sur l'écran d'ordinateur à fort grossissement 40X par un objectif immersion dans l'eau (ouverture numérique de 0,8) et un 2X ou 4X grossissement supplémentaire atteint par une lentille grossissante. Perfuser continu avec oxygéné Ringer à RT (1-2 ml / min).

4. Enregistrement de session

1. Rechercher cellule fluorescente: exciter la préparation à 480nm pour EGFP, qui émet de la lumière dans la gamme 530-550 nm; cibler un seul bouton dendritique qui est fiable visible dans fluorescence et sous champ lumineux.
2. Remplir l'électrode avec une solution intracellulaire à la nystatine; éliminer les bulles en tapotant doucement sur l'électrode.
3. Insérez électrode sur un support d'électrode, appliquer une pression positive dans la pipette; La résistance doit être 15-20 MQ.
4. Apportez électrode proche de la cellule; une fois la résistance atteint ~ 40 MQ, relâcher la pression positive et appliquer une légère pression négative pour atteindre un gigaseal.
5. Une fois joint est atteint, réglez le potentiel de membrane à environ -75 mV;
6. Une fois que la cellule est ouverte, procéder à des protocoles de stimulation, les traitements pharmacologiques. Pour mesurer la réponse à une stimulation odorante unique, fiche 200-500 ms de l'activité spontanée, stimuler pour 500 ms et mesurer la réponse de la cellule pour un maximum de 10 sec ^13. Pour les traitements pharmacologiques, perfuser les agents pharmacologiques àla ²⁰ concentration souhaitée.

5. Analyse des données

1. Analyser les courants induits par la stimulation odorante comme suit: l'amplitude maximale, le temps de montée (temps nécessaire pour atteindre 90% de l'amplitude maximale, en ms), le courant total (aire sous la courbe à pas), le temps à 50% (temps entre le début et le décalage de la réponse à 50% de l'amplitude maximale, en ms).
   1. En utilisant les courants de pointe de transduction (amplitude maximale atteinte) à différentes concentrations, dessiner et ajuster une courbe dose-réponse en utilisant l'équation de Hill: I = Imax / (1 ​​+ (K _1/2 / C) ^n), où je représente le courant de crête , Imax la réponse maximale à des concentrations de saturation, K1 / 2, la concentration à laquelle la moitié de la réponse maximale a été atteinte, C la concentration de substance odorante et n le coefficient de Hill.
2. Analyser les enregistrements de potentiel de membrane en pince ampèremétrique pour la dépolarisation maximale, la total potentiel suscité (aire sous la courbe dans mVsec); enregistrent l'activité de dopage spontanée en 30 sec à 1 min enregistrements; fiche excitabilité travers pointes provoquées par injection de courants (5-10 Pa).

Résultats

Le résultat de ce protocole dépend de la qualité de la dissection. Cette dissection étapes doivent être courts (moins de 10 à 15 min) et précis (par exemple, pour éviter les dommages de l'épithélium). La figure 1 illustre comment une préparation idéale ressemble à différents niveaux de grossissement. A un faible grossissement sous champ lumineux les différents types de cellules (comme les poignées de ARS, des cellules de soutien) se distinguent (figure 1A). ...

Discussion

La capacité de ce protocole pour surveiller correctement les propriétés des ARS en bonne santé dépend fortement de la qualité de la préparation. Par conséquent, les étapes de dissection sont critiques. D'abord, il est essentiel de prêter attention à la qualité (pH, osmolarité), l'oxygénation et la température (glace-froid mais non congelé) du milieu de dissection. Deuxièmement, la manipulation de l'épithélium avec des outils de dissection doit être aussi limité que possible pour éviter ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
vibration table with Faraday cage	TMC	63-500 SERIES	required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope	Olympus	BX51WI	upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives	Olympus	LUMPLFL40XW	at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera	Olympus	DP72	a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters	Olympus/Chroma		depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier	HEKA	EPC10 USB	monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software	HEKA	Patchmaster	controls the amplifier during the experiment
micromanipulator	Sutter	MP225	precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller	Sutter	P97	with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass	Sutter	BF120-69-10	in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber	Warner Instruments	RC-26G	a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass	WPI	TW100F-4	attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller	MDI	PMP-107-Z	by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector	Toohey Company	P/N T25-1-900 Single Channel	this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator	Narishige	YOU-1	a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings	N/A		tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump	gardner denver	300 series	a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system	N/A	N/A	gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin	Sigma-Aldrich	N3503	mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE	Sigma-Aldrich	D5879	used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	extracellular solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	extracellular solution
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	E3889	internal solution
Potassium hydroxyde	Sigma-Aldrich	P1767	internal solution
Methyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387509	intracellular solution
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	intracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	intracellular solution