ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

Summary

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Abstract

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

Introduction

עבור יישומים טיפוליים גן זה הוא בעל חשיבות רבה, כדי למנוע תופעות לוואי רעילות לתאים וחיסוניים הנגרמות על ידי ביטוי של חלבונים נגיפיים, transgene עצמו או על ידי חלבונים נגיפיים נכנסים. וקטורי אדנווירוס (עו"ד) נמצאים בשימוש נרחב כדי להציג דנ"א זר לתוך מגוון רחב של תאים כדי לחקור את ההשפעה של ביטוי transgene ^1,2. הגרסה המתקדמת ביותר של עו"ד מיוצגת על ידי וקטורי קיבולת גבוהה אדנווירוס (HCAdV) חסרים כל רצפי הקידוד הנגיפיים ^3,4 ובכך מציע קיבולת אריזה עד 35 קילו בשילוב עם חיסוני נמוכות ונמוכה רעילות ^5-8. בשל יכולת האריזה שלהם גבוהה הם מאפשרים משלוח של transgenes הגדול או מרובה באמצעות מינון וקטור יחיד. לכן, הם מייצגים כלי רב ערך עבור קהילת המחקר.

בניגוד לראשון או עו"ד דור השני חסר גנים המוקדמים E1 ו / או E3 שניתן להפיק בקלות באמצעות ערכות מסחריות, vecטור ייצור בניית הגנום ווירוס של HCAdV הוא מורכב יותר. המערכת לבניית הגנום HCAdV מבוססת על פלסמיד שנשא pAdFTC הגנום HCAdV נטול כל רצפי הקידוד הנגיפיים ופלסמיד הסעות pHM5 ^9-12. כל גן של עניין של עד 14 קילו בסיסים (KB) ניתן לשכפל לpHM5 וקטור הסעות שבאתר השיבוט מרובה מוקף הכרה / ביקוע אתרים של endonucleases ביות PI- SCE אני ואני- Céu I. לכן, גן משובט של עניין ניתן לשחרר על ידי PI- רצוף SCE אני ואני- Céu אני מעכל להכנסה הבאה מופנה לאותם אתרי ההגבלה הנוכחיים בגנום HCAdV הכלול בpAdFTC פלסמיד. בpAdFTC אתר הכנסת transgene ממוקם בין PI- SCE אני ואני- Céu אני מחשוף אתרים מוקף stuffer DNA ורצפי adenoviral noncoding נדרשים לאריזת הגנום כגון חוזר מסוף כ5 'ו 3' הפוכים (ITRS)בשני קצוות ואות האריזה במורד הזרם של 5'ITR. Stuffer DNA נוסף מספק גודל אופטימלי של הגנום HCAdV הסופי הנע 27-36 קילו כדי להבטיח אריזה יעילה בייצור וירוס. מאז pAdFTC הוא פלסמיד גדול עם עד 45 קילו (תלוי בגודל של transgene הוכנס) ואת השימוש של endonucleases ביות עם אתרי הכרה comparably ארוכים DNA מציג DNA החזק מחייב, כמה צעדי ניקוי נחוצים בעת העברה של transgene מpHM5 לpAdFTC. טיפול זהיר הימנעות כוחות הגז מומלץ.

ITRS של הגנום HCAdV נמצא לצד לא אני אתרי הכרת אנזים הגבלה ממוקמים ישירות במעלה הזרם של 5'ITR ומורד זרם של 3'ITR ^12. לכן, יכול להיות שפורסם על ידי HCAdV לא אני לעכל לtransfection הבא של הגנום הנגיפי לתוך קו תא מפיק HCAdV. שימו לב שהשימוש באנזים ההגבלה לא אני לrelקלות הגנום הנגיפי מpAdFTC פלסמיד מרמזת כי transgene הוכנס הוא נטול הכרת אתרים לא אני DNA. תאי מפיק תא HEK293 מבוססים (116 תאים) ביציבות להביע recombinase Cre. להגברת וירוס 116 תאים שיתוף נגועים בוירוס עוזר (HV) מספק את כל הגנים עו"ד דרושים לשכפול ואריזה ^ב3,4 טרנס. HV הוא עו"ד דור ראשון עם אות אריזת floxed אשר הוסרה במהלך ההגברה וירוס על ידי recombinase Cre בא לידי ביטוי בתאים 116 ^4. הדבר מבטיח כי הגנום בעיקר HCAdV מכיל אות אריזת שלמי encapsidated.

טרום הגברה של HCAdV מתבצעת על ידי ביצוע צעדי passaging סידוריים ב116 תאים גדלו על משטחים במנות בתרבית רקמה. אחרי כל קטע חלקיקים נגיפיים משתחררים מהתאים נגועים על ידי ביצוע שלושה שלבים להקפיא להפשיר ברציפות. עם כל מעבר מספר רב של תאים נגועים ב1/3 של lysate תא מהמעבר הקודם. לבסוף lysate מהשלב טרום ההגברה האחרונה משמש להדביק תאי מפיק גדלו בהשעיה בבקבוק טווה להגברה בקנה מידה גדולה. Virions הם מטוהרים מתאי ההשעיה על ידי ביצוע ultracentrifugation בצפיפות צזיום כלוריד שיפוע ^4,12. עם הליך זה חלקיקים ריקים וחלקיקים שנאספו באופן מלא מופרדים לשתי להקות שונות. להתרכז HCAdV נוסף חלקיקי צעד ultracentrifugation הלא הדרגתי שני מבוצע. בהמשך לכך וכתוצאה מהלהקה המכילה את HCAdV נאסף ודיאליזה נגד מאגר פיסיולוגי. הכנות וקטור סופיות מתאפיינות ביחס למספרים של חלקיקים נגיפיים מוחלטים, חלקיקים מזהמים ורמות זיהום HV. חלקיקים נגיפיים מוחלטים יכולים להיקבע על ידי lysing חלקיקים נגיפיים ומדידת הספיגה ב 260 ננומטר או על ידי ביצוע בזמן אמת PCR (qPCR) ^12. הדבקה של PURחלקיקי נגיף ified יכולים להיקבע על ידי הגנום HCAdV מדידת qPCR הנוכחי בתוך תאים נגועים לאחר זיהום 3 שעות.

Protocol

1. בנייה של רקומביננטי HCAdV הגנומים מבוססים על פלסמיד pAdFTC

הערה: כל פלסמידים תוארו בעבר ^11,12 וזמינים על פי בקשה. תהליך השכפול מוצג באופן סכמטי באיור 1.

1. לשכפל גן של עניין (ממשלת ישראל) כולל אות אמרגן וpolyadenylation (הרשות הפלסטינית) להסעות פלסמיד pHM5, משתמש באסטרטגית שיבוט של בחירה, כדי ליצור pHM5-ממשלת ישראל.
   הערה: מאחר pAdFTC הוא פלסמיד גדול יחסית, פרוטוקולי הכנת פלסמיד קלאסיים מומלצים להימנע sheering של פלסמיד דנ"א באמצעות ערכות טיהור פלסמיד מסחריות המבוססות על ממברנות סיליקה. אני- Céu אני וPI -Sce אני מאוד להיקשר ל- DNA ולשנות את ניידות electrophoretic של DNA מתעכל. לכן, חילוץ פנול, כלורופורם ומשקעים EtOH (שלב 1.3) נדרש לפני ג'ל אלקטרופורזה agarose.
2. Digest 20 מיקרוגרם של PHM5-ממשלת ישראל ו -10 מיקרוגרם של pAdFTC ידי-CeuI (10 U) במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס בנפח כולל של 100 μl לlinearize פלסמידים (~ 2.8 kb רצף + ממשלת ישראל ORF ו~ 31kb, בהתאמה).
3. לטהר פלסמידים לינארית באמצעות מיצוי פנול, כלורופורם ואחריו אתנול (EtOH) ממטרים ^13.
   1. להוסיף של פנול 100 μl: כלורופורם: אלכוהול isoamyl ומערבבים בעדינות על ידי צינור היפוך מספר פעמים. צנטריפוגה 2 דקות ב15,000 x ז.
   2. מעבירים את supernatant לצינור חדש, להוסיף 20 μl של נתרן אצטט (pH 5, 3 מ ') ו -400 μl של קרח EtOH (99.8%) קרים ומערבבים נמרצות השעיה. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 15,000 x ז.
   3. הסר את supernatant, להוסיף 300 μl של 70% EtOH ו צנטריפוגות 2 דקות ב15,000 x ז. לאחר מכן להסיר supernatant וגלולת DNA אוויר יבש. ממיסים את גלולה ב10- 20 μl של DH ₂ O. האם גלולה DNA לא יבשה מדי זמן, כפי שזה יהיה קשה יותר להשיג DNA בפתרון.
4. התקציר אני-Céu אני -digested pHM5-ממשלת ישראל ופלסמיד pAdFTC מצעד 1.3) לפחות 3 שעות או O / N עם אנזים ההגבלה PI -Sce אני (10 U) על 37 מעלות צלזיוס בהיקף כולל של 50 μl ולאחר מכן לטהר אני -CeuI וPI -Sce אני מתעכל פלסמידים באמצעות מיצוי פנול, כלורופורם ואחריו המשקעים EtOH (ראו שלב 1.3). ממיסים DNA ב -20 μl של nuclease dH החופשי ₂ O.
5. עמוד השדרה נפרד pHM5 פלסמיד (2.8 קילו) וממשלת ישראל (מהשלב 1.4) על ג'ל agarose preparative וג'ל לטהר את ממשלת ישראל באמצעות ג'ל מסחרי וPCR- ערכת ניקוי. Agarose ג'ל נציג לעכל מוצג באיור 2 א.
6. Dephosphorylate אני- Céu אני ו- מתעכל אני PI -Sce pAdFTC (משלב 1.4) עם עגל המעיים אלקליין phosphatase CIP (10 U) במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בהיקף כולל של 25 μl ולטהר pAdFTC פלסמיד dephosphorylated על ידי מיצוי פנול, כלורופורם וEtOH הבא יחסי ציבורecipitation (שלב 1.3). Elute DNA ב -20 μl של nuclease dH החופשי ₂ O.
7. בצע ג'ל אלקטרופורזה אנליטית מaliquot של פלסמיד dephosphorylated pAdFTC (משלב 1.6) וממשלת ישראל-הבר מטוהר (משלב 1.5) לנתח אם מעכל שלמים והגדלים של שברים הצפויים נכונים (~ 31 KB לpAdFTC ינארית ).
   הערה: הגודל של ממשלת ישראל הוא משתנה בהתאם לגודל של קלטת ביטוי transgene. להעריך את הריכוזים היחסי של שברים המתאימים לקשירה שלאחר מכן. Agarose ג'ל נציג של שברים מטוהרים מוצג באיור 2.
8. הגדר את תגובת קשירה בהיקף כולל של 20 μl באמצעות 400 האנזים U של T4 DNA ויחס טוחנת של וקטור להכניס של 1: 3.
   הערה: בהתאמה עם ג'ל agarose שמוצג באיור 2B אנחנו בדרך כלל לקשור בהיקף כולל של 20 μl עם 2 לוקטור 6-μl, 8 עד 12 μlהכנס ואנזים 400 U של T4 DNA. כריכוז ה- DNA הוא בדרך כלל נמוך לאחר כמה צעדי phenolization, להשתמש כמה שיותר DNA ככל האפשר כדי שלא H ₂ O נוסף יש להוסיף כדי להגיע לנפח הסופי של 20 μl. ולקשור על 16 מעלות CO / N ולאחר מכן לבצע חילוץ פנול, כלורופורם ואחריו המשקעים EtOH (שלב 1.3).
   1. Elute DNA ב -15 μl של nuclease dH החופשי ₂ O ולעכל את תגובת קשירה המטוהרת עם אנזים הגבלה שואי (10 U) לשעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס בהיקף כולל של 20 μl. אז להתרכז ולטהר DNA, על ידי ביצוע חילוץ פנול, כלורופורם ואחריו המשקעים EtOH (שלב 1.3). Elute DNA ב 10 μl של nuclease dH החופשי ₂ O.
9. להפוך 2 μl של Swa המטוהר אני מתעכל מוצר קשירה ידי electroporation לDH10B או DH5α electrocompetent E. coli ושיבוטים בחרו עבור 16 עד 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בLB המכיל אמפיציליןצלחות (50 מ"ג / מיליליטר אמפיצילין). בחר 5- 10 שיבוטים ולהכין מיני הכנות פלסמיד דנ"א באמצעות תמוגה בסיסית ואחרי חילוץ פנול, כלורופורם והמשקעים EtOH הבאים (שלב 1.3) ^13.
10. בצע לעכל אנליטי של מיני-הכנות פלסמיד אחרי ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לבדוק את הגודל של קטעי DNA. אנזימי הגבלה הציעו הם למשל אני- Céu אני וPI- SCE אני משחרר את התוסף, SPE אני או Hinc השני (איור 2 ג).
11. להגביר שיבוט נכון במדיום LB המכיל אמפיצילין (50 מ"ג / מיליליטר אמפיצילין) ולבצע הכנת midi- או מקסי-פלסמיד באמצעות כל ערכת טיהור פלסמיד זמינה מסחרי.

2. שחרור HCAdV-הגנום מpAdFTC פלסמיד וPreamplification של וקטורי HCAdV בתא מפיק הקו 116

1. לעכל 20 מיקרוגרם של פלסמיד המבוסס על pAdFTC ייצור adenoviral מכיל ממשלת ישראל המשובטת מצעד 1.11) בבהיקף כולל של 100 μl באמצעות לא אני (20 U) על 37 מעלות צלזיוס ל> שעה 2 ולבצע חילוץ פנול, כלורופורם ואחרי פעמיים על ידי המשקעים EtOH. לפזר ב20- 30 μl סטרילי DH ₂ O.
2. בדוק aliquot של 1:10 בדילול pAdFTC-ממשלת ישראל-DNA מתעכל על ידי ג'ל אלקטרופורזה. בר 9 KB לשדרת פלסמיד ו, תלוי בגודל של ממשלת ישראל, שבר DNA שני לגנום HCAdV (גודל: 28. 36 KB) ניתן לזהות.
   הערה: דוגמא מייצגת של לא אני לעכל מוצגת באיור 2 ד. ה- DNA לינארית יכול להיות מאוחסן במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.
3. לפני שתמשיך עם הפרוטוקול, לוודא כי וירוס עוזר AdNG163R-2 כבר מוגבר ^4.
   הערה: תאי transfected עם וקטורי HCAdV pAdFTC נגזר הם אורגניזמים מהונדסים גנטי סווגו כרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), אנא השתמשו בלימה נכונה וטיפול בפסולתאמצעים, כולל ציוד מגן אישי, ועבודה תחת BSL-2 זרימה למינרית ברדסים.
4. 116 תאי תרבות במדיום נשר ממ בתוספת 10% FBS וhygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר). מעבר זרע נמוך (מתחת מעבר 10) 116 תאים (~ 0.4x 10 ⁶ תאים) ביום אחד צלחת תרבית רקמת 60 מ"מ לפני transfection כך שהם מגיעים 50 confluency 80% ביום שלמחרת.
5. Transfect הגנום HCAdV לינארית מצעד (2.1) לתאים 116 באמצעות שיטות, כגון transfection סידן פוספט או חומרים כימיים אחרים זמינים מסחרי transfection (איור 3 א). 16 18 שעות לאחר transfection, להסיר בזהירות בינונית, להוסיף 3 מיליליטר בינוני טרי (ממ, 5% FBS) ולהדביק תאים עם HV החלת 5 יחידות transducing AdNG163R-2 ⁴ (TU) לכל תא (מאז מחוברות 60 מ"מ צלחת תרבית רקמה מכילה ~ 3.2x 10 ⁶ תאים, להוסיף ~ 1.6x 10 ⁷ TU של HV).
   1. בעדינות להזיז את הצלחת בכל 20 דקות במהלך השעה הראשונה לאחר הדבקה ללהבטיח חלוקה שווה HV. לטפח תאים נגועים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. במקרה של השפעה היעילה cytopathic ההגברה וירוס (CPE) הנגרמת על ידי שכפול וירוס (תאים מעוגלים ורופף מצורפים או מנותק מצלחת תרבית הרקמה) הוא נצפים 48 שעות שלאחר infection.If CPE הוא ציין קודם לכן הסכום של HV יש ל לְהִצְטַמְצֵם. אם CPE מתחיל מאוחר יותר, יותר וירוס עוזר יש להשתמש.
6. קציר תאים כוללים 48 שעות שלאחר זיהום supernatant על ידי שטיפה את התאים מצלחת התרבות באמצעות מדיום התרבות. תאים שמושעים במדיום התרבות שלהם נקראים מעבר 0 (P0). הפיצול P0 לשני שברים.
   1. מ0.5 מיליליטר של התאים מנותקים הספין למטה התאים במשך 3 דקות XG ב 2000 ולהסיר בינוני מהתא גלולה, שמאוחר יותר שימש לבידוד הדנ"א הגנומי (gDNA) לניתוח של תהליך ההגברה מבוסס qPCR. כדורי תא חנות ב -20 ° C עד עיבוד נוסף.
   2. מ2.5מיליליטר של התאים מנותקים לשחרר חלקיקים נגיפיים על ידי הקפאה (ב -80 ° C או בחנקן נוזלי) ומפשיר (ב RT או באמבט מים 37 מעלות צלזיוס) התאים שresupended בשלוש עד ארבעה פעמים בינוניות שלהם. חלק זה הוא מ lysate נקרא של P0.
7. ודא שמנות בתרבית רקמה עם תאים 116 שגדלות לconfluency 90- 95% באמצעות ממ-בינוני בתוספת FBS (10%) וhygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר) וHV זמינים לצעדים הבאים passaging.
8. מערבבים 1 מיליליטר של תקשורת הטרי (ממ, 5% FBS) עם 2.5 מיליליטר של lysate מהמעבר הקודם (שלב 2.6.2) לנפח סופי של 3.5 מיליליטר, להוסיף HV החלת 2 TU לכל תא (מאז רקמת 60 מ"מ מנה התרבות בconfluency של 90- 95% מכילה ~ 3.2x 10 ⁶ תאים, להוסיף ~ 10 6.4x ⁶ TU של HV). (איור 3). מוציא בזהירות את המדיום מצלחת 60 מ"מ של 116 תאים ולהוסיף את התערובת הנגיפית לתאים. חזור על שלב 2.6) - 2.8) פעמיים כדי לקבל lysates לעבורגילאי P1 ו- P2.
9. מערבבים 17.5 מיליליטר תקשורת טרי (ממ, 5% FBS) עם 2.5 מיליליטר של lysate מP2 ולהוסיף HV החלת 2 TU לכל תא (מאז צלחת תרבית רקמת 150 מ"מ בconfluency של 80 100% מכיל ~ 2x 10 ⁷ תאים, להוסיף ~ 4x 10 ⁷ TU של HV). הסר את המדיום מצלחת 150 מ"מ של 116 תאים ולהדביק תאים עם תערובת ויראלי. לטפח תאים נגועים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
10. תאי 48h לאחר זיהום קציר כמתואר בשלב 2.6) כדי לקבל P3 מעבר (איור 3).
    1. חזור על שלב 2.6) 1.
    2. מ19.5 מיליליטר הנותר של חלקיקים נגיפיים שחרור P3 מתאי resupended על ידי הקפאה והפשרה שלוש עד ארבעה פעמים. חלק זה הוא מ lysate נקרא P3.
       הערה: וקטורי חלק סופו של דבר עשויים לדרוש קטעים נוספים ב150 מנות מ"מ עד שהם מוגברים במידה מספקת. לכן לייעל את התהליך מראש ההגברה צריכה להיות במעקב במהלך לעבור סידוריהְזדַקְנוּת. ניתוח מבוסס qPCR של תהליך ההגברה יכול להתבצע כאמור בסעיף 3 (ראה גם איור 4 א). טרום הגברה של HCAdV ביצוע קלטת ביטוי לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בקלות יכולה להיות מוערכת על ידי התבוננות אות flourecscent GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4).

3. ניטור של תהליך הגברה שימוש כמותי-Real Time PCR (qPCR) (ראה גם איור 4 א).

1. לבודד gDNA מכדורי תא מכל קטע של preamplifaction (שלבים 2.6) - 2.10) באמצעות כל ערכת בידוד DNA מסחרית לבידוד של gDNA מהתאים בתרבית או בשיטה אחרת של בחירה. לקבלת תוצאות אופטימליות PCR להשתמש gDNA טרי ככל האפשר. אחרת ניתן לאחסן gDNA ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
2. כדי לקבוע את מספר הגנום HCAdV הנוכחי בתאים של מעבר בהתאמה על ידי ניתוח qPCR ליצור עקומה סטנדרטית באמצעות 10 ^{1 <}/ Sup> - 10 ⁹ עותקים של פלסמיד שנשא את ממשלת ישראל הכלולה בגנום HCAdV.
3. לנתח את אותה הכמות של gDNA מP0- P3 (שלב 2.6- 2.10) החלת qPCR באמצעות 400 ננומטר של פריימרים ספציפיים לממשלת ישראל הכלולה בגנום HCAdV. לביצוע הוראות יצרן מעקב qPCR של כימיקלים qPCR בהתאמה. הגדר את תכנית qPCR כדלקמן: מראש דגירה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, הגברה ב -40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות. על הבסיס העקום הסטנדרטי מספר הגנום HCAdV בתגובה ניתן אינטרפולציה.

4. הגברה בקנה מידה גדולה של וקטורי HCAdV בתאי גידול ב116 השעיה

1. להוסיף 900 מיליליטר של ממ הטרי (37 מעלות צלזיוס) prewarmed בתוספת 10% FBS וhygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר) לתוך בקבוק תרבות טווה 3 ליטר (איור 3).
2. הסר בינוני מלפחות 10 מנות בתרבית רקמה בודדות 150 מ"מ עם 116 תאים שגודל בconfluency של 90- 100% ולשטוף את תאים עם 10 מיליליטר של טרי מראש התחמם (37 ° C) ממ בתוספת FBS (10%) וhygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר) בעזרת פיפטה סרולוגיות. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לקבל השעיה תא הומוגנית. העבר את התאים ישירות לתוך הבקבוק טווה כבר מכיל 900 מיליליטר מהשלב 4.1).
   הערה: אל תשתמש בטריפסין / EDTA כזה עלול להשפיע לרעה על צמיחה של תאי השעיה. לאחר הסרת בינונית להעביר מייד תאים לתוך בקבוק ספינר. לא להתמודד עם יותר משתי מנות בתרבית רקמה בכל פעם. כבר זמן ההמתנה לאחר הוספת תקשורת טריות קשה יותר יהיה למנותקים תאים מצלחת תרבית רקמה.
3. כדי להבטיח בקבוק טווה דגירה צמיחת תאים אופטימלי על בוחש מגנטי בתרבית רקמת חממה למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. התאם את הבוחש המגנטי עד 70 סל"ד, כדי למנוע עיקול של תאים למשטחי הזכוכית.
4. צג צמיחת תאים בבקבוק התרבות טווה לבחון אם תאים שגודלו בבקבוק התרבות טווה הם קיימא ואם הם גדלים לכמויות מספיקות. בכל פעם לפני הוספת העברה בינונית טרי 2 מיליליטר מbioreactor לצלחת תרבית רקמת 60 מ"מ. שים לב מורפולוגיה תא תחת מיקרוסקופ.
   הערה: תאים יוצרים גושים צפים במדיום התרבות מצביעים על צמיחה וכדאיות (ראה גם איור 4C) אופטימליות. לאחר 24 שעות הם יוצרים מושבות על פני השטח של המנה בתרבית הרקמה. 30 50% מצביע על צפיפות מפגש אופטימלית.
5. 24 שעות לאחר הגדרת בקבוק התרבות טווה להוסיף 500 מיליליטר של תקשורת הטרי (ממ, 10% FBS) בתוספת hygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר). 24 שעות מאוחר יותר לחזור על פעולה זו.
6. 72 שעות לאחר הגדרת תרבות ספינר, להוסיף 1,000 מיליליטר של תקשורת טרי ממ (10% FBS) עם hygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר) וכתוצאה מכך בהיקף כולל של 3 ליטר של השעיה תא.
7. 24 שעות לאחר שהגיע avolume של שלושה ליטרים, קציר 116 תאי השעיה על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 XG ב RT. בטל supernatant. שמור את בקבוק התרבות טווה רוק מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה.
8. כדורי תא גלולים בממ הטרי בתוספת 5% FBS ידי pipetting למעלה ולמטה על 8 10 פעמים כדי לקבל השעיה תא הומוגנית. נפח בינוני תלוי אם lysate משלב 2.10) 2. (19.5 מיליליטר, ראה שלב 4.8) 1. אפשרות) או מניות ויראלי מטוהרת של HCAdV מצעד 5.9) 2. (כמה μl depanding בכייל נגיף, ראה שלב 4.8) 2., אפשרות ב) משמש לזיהום של התאים. השתמש בנפח כולל של 150 מיליליטר.
   1. אפשרות: לזיהום של 116 תאי השעיה עם lysate מP3 (הגברה ראשונית) תאי העברה מצעד 4.8) לבקבוק 250 מיליליטר אחסון מצויד בבר סטרילי מגנטי ומערבבים או בקבוק טווה בקנה מידה קטנה 250 מ"ל ושיתוף להדביק תאים עם וירוס בתוך lysate מP3 (שלב 2.10.2) ו -2 TU של HV לכל תא. בהנחת צפיפות של 3x10 ⁵ תאים לכל מיליליטר, הכולל את המספר הסלולרי הוא 9x 10 ⁸ תאים. כך להוסיף 1.8x 10 ⁹ TU של HV.
   2. אפשרות ב ': לזיהום של 116 תאי השעיה עם המניה ויראלי מטוהרת, תאי העברה מצעד 4.8) לבקבוק 250 מיליליטר אחסון מצויד בבר סטרילי מגנטי ומערבבים או בקבוק טווה בקנה מידה קטנה 250 מ"ל ושיתוף להדביק תאים עם 100 חלקיקים נגיפיים לכל תא של HCAdV לשעבר מטוהר (משלב 5.9) 2.). כך להוסיף 9x 10 ¹⁰ סמנכ"ל לפי כייל פיזי (שנמדד על ידי הספיגה ב 260nm; שלב 6) של HCAdV המטוהר ו1.8x 10 ⁹ TU של HV.
9. מערבבים את תערובת תא-וירוס מספטמבר 4.8.1) או 4.8.2) בבוחש מגנטי בתרבית רקמת החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ לשעה 2 ב 60 סל"ד. ודא שבקבוק האחסון אינו סגור לחלוטין, כדי לאפשר זרימת אוויר.
10. לאחר זיהום 2 שעות להעביר את הנפח הכולל של תערובת תא-וירוס בחזרה לכת טווה 3 ליטרבקבוק יור ולהוסיף 1,850 מיליליטר של (37 מעלות צלזיוס) ממ תקשורת מראש חימם הטרי בתוספת 5% FBS בהיקף כולל של 2 ליטר ו דגירה בתרבית רקמת החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ במשך 48 שעות ב 70 סל"ד.
11. קציר תאים על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב g 890x ב RT ב500 מיליליטר צינורות צנטריפוגה. הסר את המדיום וresuspend תאי pelleted בהיקף כולל של 28 מיליליטר של DPBS. פיפטה למעלה ולמטה כדי לקבל השעיה תא הומוגנית. להקפיא את ההשעיה תא-וירוס בחנקן נוזלי או ב -80 מעלות צלזיוס ולוודא כי ההשעיה היא קפוא לחלוטין. אחסן את ההשעיה תא-הווירוס ב -80 ° C עד שמתחיל טיהור הווירוס.

5. טיהור ודיאליזה של HCAdV

1. כדי להכין lysate הנגיפי למילויי צזיום כלוריד (CsCl), להקפיא השעיה תא-וירוס מצעד 4.11) בחנקן נוזלי והפשרה באמבט מים ב 37 ° C פעמים ארבע.
2. צנטריפוגה lysate הנגיפי ב XG 500 עבור 8 דקות בRT ולאסוף את supernatant המכיל את HCAdV.
3. לultracentrifugation להכין פתרונות CsCl כfollows.Weigh 37.5 גר '(1.5 גר' / סנטימטר ^3), g 33.5 (ל1.35 גר '/ סנטימטר ^3), ו31,25 גרם (1.25 גר' לסנטימטר ³ /) של אבקת CsCl בהתאמה ולמלא עם ₂ O ל -25 מיליליטר DH.
   1. Stirr עד פתרון הופך מסנן ברור וסטרילית הפתרונות. לבסוף להסיר 1 מיליליטר של כל פתרון ולשקול את זה בקנה מידת קנס לבדוק האם הצפיפות היא נכונה. 1ml צריך לשקלל 1.5 גר ', 1.35 ו -1.25 בהתאמה ז.
   2. אם הצפיפות היא גבוהה מדי לשנות את זה על ידי תוספת בשלבים של נפחים קטנים (μl) של DH סטרילי ₂ O. לאחר תוספת של DH ₂ O למדוד densitiy שוב. אם יש צורך להוסיף עוד DH ₂ א '
   3. חזור על התהליך עד שהצפיפות היא נכונה. אם הצפיפות היא נמוכה מדי לשנות את זה על ידי הוספת כמות קטנה של אבקת CsCl. סינון סטרילי את זה שוב ולבדוק את הצפיפות. אם הצפיפות היא גבוהה מדי לשנות את זה על ידי Addinז DH ₂ O כפי שתואר קודם לכן. אם הצפיפות היא עדיין נמוכה מדי להוסיף מור CsCl, מסנן סטרילי את זה שוב ולבדוק את הצפיפות. חזור על התהליך עד שהצפיפות היא נכונה.
4. הכן הדרגתיים צעד CsCl בשישה צינורות ultracentrifuge ברורים. בזהירות ולאט פיפטה פתרונות CsCl לצינורות באמצעות הסדר הבא: 0.5 מיליליטר של 1.5 גר '/ סנטימטר ³ פתרון CsCl, 3 מיליליטר של 1.35 גר' / סנטימטר ³ פתרון CsCl ו -3.5 מיליליטר של 1.25 גר '/ סנטימטר ³ פתרון CsCl (איור 2 ג) .
5. כיסוי ~ 4.5 מיליליטר של supernatant הווקטור פינה מצעד 5.2) על גבי גרם / סנטימטר ³ שכבת CsCl 1.25. צנטריפוגה הדרגתיים בultracentrifuge באמצעות תנופה את הרוטור (SW-41) בגיל 12 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה 2 ב 226.000 XG (35,000 סל"ד) עם ההאצה איטית והאטה לHCAdV-הגנום נפרד המכיל חלקיקים נגיפיים מחלקיקים ותאים ריקים מַפּוֹלֶת.
   הערה: בתנאים אופטימליים להקה מפוזרת של formes פסולת תא על גביהצינורות. להלן שני ניתן לצפות להקות הלבנות. הלהקה העליונה מכילה חלקיקים ריקים ואילו הלהקה הנמוכה שווה HCAdV (2C דמויות ו5A).
6. מוציא בזהירות את השכבות של פסולת תא וחלקיקים ריקים ולאסוף 1 מיליליטר של הלהקות הנמוכות מצינור אחד ווירוס העברה עם קצה פיפטה נקי לתוך צינור 50 מיליליטר סטרילי. להוסיף עד 24 מיליליטר של 1.35 גר '/ סנטימטר ³ פתרון CsCl לחלקיקי נגיף נאספו ומערבבים בזהירות.
7. מלא צינורות צנטריפוגה עם 1.35 גר '/ סנטימטר ³ פתרון CsCl-וירוס לO העליון ו צנטריפוגות / N (18 20 שעות) ב226.000 XG (35,000 סל"ד) בשעת 12 ° C בultracentrifuge באמצעות את תנופת הרוטור (SW-41 ) עם ההאצה והאטה איטיות.
8. לאסוף את HCAdV הנוכחי ברצועה התחתונה הבולטת. כלהקה עליונה פוטנציאל מכילה חלקיקים ריקים להסיר שכבות העליונות מלמעלה בעזרת פיפטה (ראה 2C דמויות ו5B) ואז לקחת את USI הלהקה התחתוןng פיפטה.
9. Dialyze חלקיקי נגיף נאספו לחילופי חיץ.
   1. חותך את רצועה של צינורות דיאליזה (MWCO: 50,000) של כ 8 ס"מ אורך, לשטוף אותו עם סטרילי DH ₂ O לשלוש פעמים. ואז לסגור צד אחד של צינור הדיאליזה עם מהדק פלסטיק ולהעביר את הווירוס שנאסף מהשלב 5.8) לתוך צינורות בעזרת פיפטה 1 מ"ל. למנוע בועות אוויר בתוך צינורות ולסגור אותו בצד השני עם סגרים דיאליזה מהדק פלסטיק.
   2. Dialyze בl 1 של חיץ דיאליזה (10 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), גליצרול 10% ו 1 מ"מ MgCl ₂ בH ₂ O deionized) עבור 2 שעות על 4 מעלות ערבוב איטי Cwith. חיץ הדיאליזה Exchange עם 2 ליטר של חיץ דיאליזה ודיאליזת O / N ב 4 ° C עם ערבוב איטי. לחלופין להשתמש sucrosebuffer (140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ Na ₂ HPO ₄ x2H ₂ O, 1.5 ₂ PO ₄ וסוכרוז 730 מ"מ KH מ"מ, pH 7.8).
   3. לאסוף חלקיקי נגיף דיאליזה מצעד 5.9) 2. באמצעות עמ '1 מיליליטרipette. הכן aliquots מרובה כרכים רצויים קטנים (25 100 μl) ולאחסן את הווירוס מטוהר ב -80 ° C.

6. מדידת כייל הפיזי של תכשירי HCAdV סופי לפי צפיפות אופטית (OD)

1. לדלל 25 μl של הכנת הווקטור הסופית מצעד 5.9) 2 עם 475 μl של חיץ תמוגה (10 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 10 מ"מ EDTA (pH 8.0), 0.5% SDS)), בעדינות לנער במשך 20 דקות ב RT ולבסוף צנטריפוגות במשך 2 דקות ב RT ב15,000 x ז.
2. מאז ערכי הספיגה ב 260 ננומטר (A260) הם בדרך כלל נמוכים, למדוד ספיגת ארבע פעמים באמצעות של supernatant 100 μl ולחשב ערך ממוצע של ארבע מדידות. לחשב את מספר החלקיקים נגיפיים לכל מיליליטר (סמנכ"ל / מיליליטר ^-1) באמצעות הנוסחא הבאה: סמנכ"ל / מיליליטר ^-1 = (אומר A260) x (20) x (1.1 x 10 ¹²⁾ x (גודל / HCAdV 36 KB בkb ).
   הערה: תוצאות של תשואה אופיינית של חלקיקים נגיפיים מוחלטים (כייל OD) מוצגות באיור 7 א . ניסיון מראה, שכייל OD מגזים בהערכה מספר חלקיקי נגיף. חלקיקים נגיפיים מוחלטים נמדדו על ידי OD יכולים להיות 20 גבוהים פי 100 מאשר חלקיקים נגיפיים מדבקים הנמדדים על ידי Q-PCR. למדידה מדויקת יותר של חלקיקי HCAdV absolte ומדבקים כמו גם זיהום HV על ידי Q-PCR מתייחס לסעיף 7.

7. מדידה סה"כ חלקיקים, יחידות זיהומיות של HCAdV ורמות HV זיהום בגמר וקטור ההכנה על ידי qPCR. תכנית של נוהל כותרות מוצגת באיור 6

1. תאי זרע בHEK293 6 או 12 צלחות תרבית רקמה כל כך טובות שתאים מגיעים 90% confluency ביום שלמחרת. כדי לקבוע את מספר החלקיקים נגיפיים מדבקים (כייל מדבק), להדביק תאים של אחד גם בצלחת רב גם עם μl 1 וגם שני עם 10 μl של וירוס מטוהר מצעד 5.9) 3.
2. קציר תאים לאחר זיהום 3 שעות. הסר בינוני ולהוסיף טריפסין כדי לכסות את כל היטב דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 5 דקות. לשטוף את התאים עם טריפסין בעזרת פיפטה ולסובב את התאים ב890 XG במשך 3 דקות ב RT.
3. Resuspend תאי pelleted ב200 μl של DPBS ולשטוף אותם ביסודיות כדי להסיר חלקיקים חופשיים (שאינם מזהמים) וקטור. צנטריפוגה 3 דקות ב 890 XG ב RT. מחק את כדורי תא supernatant וגלולים ב200 μl של DPBS הטרי.
   הערה: קביעה מדויקת של כייל זיהומיות, חשוב להסיר את כל חלקיקים הנגיפיים שאינם מזהמים ממשטחי התא על ידי טריפסין טיפול ושטיפה יסודית.
4. כדי לקבוע את המספר הכולל של חלקיקים נגיפיים (חלקיקים מזהמים וחלקיקים מזהמים שאינם = כייל פיזי), קציר אינו נגוע HEK293 תאים משתי בארות ללא טריפסין על ידי שטיפה את התאים עם מדיום התרבות שלהם בעזרת פיפטה.
5. ספין למטה התאים 3 דקות ב 890 XG ב RT. מחק את המדיום וresuspend תאי טבליות ב200 μl של DPBS. סוbsequently להוסיף μl 1 ו -10 μl הכנת HCAdV מטוהר ישירות לתאים, בהתאמה. להשתמש בתאים נגועים שאינו כרקע, על מנת להבטיח את אותם תנאים לבידוד gDNA וQ-PCR שלאחר מכן.
6. לבודד gDNA מתאי HEK293 נגזרים מצעדים 7.3) ו -7.5)
   1. תאי מערבולת resuspended ב200 μl של DPBS (שלב 7.3 ו -7.4) במשך 3 שניות, להוסיף 200 μl של פתרון SDS. (10 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 10 מ"מ EDTA (pH 8.0), 0.5% SDS) ו -20 μl proteinase K (20 מ"ג / מיליליטר) והשעיה מערבולת במשך 3 שניות. דגירה 12 16 שעות על 55 מעלות צלזיוס ולנער לאט. לאחר מכן להוסיף 2 μl של RNAse (20 מ"ג / מיליליטר) ודגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   2. להוסיף 350 μl של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl צנטריפוגות 2 דקות ב15,000 x ז. מעבירים את supernatant לצינור חדש וחזור על שלב זה פעם אחת
   3. מעבירים את supernatant לצינור חדש, להוסיף 50 μl של נתרן אצטט (pH 5, 3 מ ') ו1 מיליליטר של קרח EtOH (99.8%) קרים ומערבבים השעיה. Centriדגימות fuge במשך 10 דקות ב 15,000 XG כדי גלולה DNA הגנומי.
   4. לאחר מכן להסיר את supernatant, להוסיף 500 μl של 70% EtOH ו צנטריפוגות 2 דקות ב15,000 x ז. הסר את supernatant, להוסיף 500 μl של 70% EtOH ולנער במשך 30 דקות ב RT. אז צנטריפוגות 2 דקות ב15,000 x ז.
   5. הסר את supernatant וגלולת DNA אוויר יבש. האם כדורי ה- DNA לא יבשים במשך זמן רב, כפי שזה יהיה קשה יותר לקבל gDNA בפתרון. Resuspend גלולה DNA ב120 μl של DH ₂ O ו דגירה ~ השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד. אם פתרון ה- DNA מופיע צמיג, לנער אותו במשך כמה שעות על 37 מעלות צלזיוס, או לדגור על 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ~.
7. כדי לקבוע HCAdV-חלקיקים מזהמים וHCAdV-חלקיקים מוחלטים, ליצור עקומה סטנדרטית של ינואר ^{10 -} אוגוסט 10 עותקים של פלסמיד שנשא את ממשלת ישראל הכלולה בגנום HCAdV.
8. לקבוע חלקיקים כולל וחלקיקים מזהמים על ידי ניתוח באותו סכומי gDNA של ג HEK293 הנגועאמות מצעד 7.3) ו -7.4) תחולנה qPCR באמצעות 400 ננומטר של פריימרים ספציפיים לממשלת ישראל הכלולה בגנום HCAdV.
9. הגדר את תכנית ה- PCR כדלקמן: מראש דגירה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, הגברה ב -40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות. על הבסיס העקום הסטנדרטי (שלב 7.7), לשרבב את המספר הכולל של הגנום adenoviral בתגובה.
10. לחשב את מספר הגנום adenoviral בהכנת הווקטור הסופי באמצעות הנוסחות הבאות: (מספר HCAdV / המשקל בng של gDNA בתגובה) x (משקל בng של DNA של כל התאים בצלחת נגועה / וירוס נפח בμl) .
    הערה: הטווח האופייני לתשואות חלקיקים נגיפיים מוחלטים ומזהמים הוא סביב 1x10 ⁷ -1x10 ⁸ חלקיקים / μl ויראלי. Titers כי הם פי עשר גבוהים או נמוכים יותר הראו כאן יכול להיחשב כנורמליים. titers גבוה יותר יהיה שיפור. עם כל כבוד ליחס של לגבי השתתפות HCAdV המוחלטתles לחלקיקי HCAdV זיהומיות, ניסיון מראה כי כ 5 10% מחלקיקי HCAdV מוחלטים הם (איור 7 א) זיהומיות.
11. כדי לקבוע את רמות הזיהום עם HV, לבצע qPCR על ידי הגברת חלק של גן adenoviral מאוחר 3 (L3) קיים בגנום HV. השתמש בפלסמיד הנושא את הגן באיחור adenoviral 3 (L3) כדי ליצור עקומה סטנדרטית (שלב 7.7).
12. בתגובה זו יחול 400 ננומטר של L3 פריימרים קדימה 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'וL3 הפוך 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3 "יחד עם 300 ננומטר של חללית L3 ספציפי 5'-Fam-המרכז לאמנות עכשווית CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-טמרה-3 ".
13. הגדר את תכנית ה- PCR כדלקמן: טרום דגירה / הפעלה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, הגברה במהלך 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. השתמש בכל בדיקה PCR אוניברסלית mastermix לתגובת qPCR. על הבסיס העקום הסטנדרטי (שלב 7.7), לחשב את מספר בחלקיקי HV מידבקים בהכנת הווקטור הסופית. ראה (איור 7 א) לתשואות אופייניות לחלקיקי HV.
14. לבסוף לחשב את היחס של חלקיקים מזהמים מוחלטים של HCAdV לרמות זיהום HV להעריך את איכות הכנת הווקטור.
    הערה: עד עכשיו חלק קטן של HV שנותר לא ניתן לשלול. בדרך כלל את אחוז זיהום HV הוא ~ 5% של חלקיקים מזהמים או פחות, וזה מקובל (איור 7). כמובן שפחות HV ככל האפשר רצוי, במיוחד אם הכנת הווקטור הולכת לשמש לניסויים בבעלי חיים.

תוצאות

דוגמאות כאן נציג לשיבוט, הגברה וטיהור של הכנות HCAdV מוצגות. סקירה של אסטרטגית השיבוט (איור 1) ודוגמאות מייצגות לשכפול ולשחרורו של הגנום HCAdV על ידי הגבלת אנזים עיכול מסופקים (איור 2). דפוס אופייני הגבלה לאחר שחרורו של קלטת ממשלת ישראל-ה?...

Discussion

הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר טיהור של וקטורי HCAdV מבוססים על סוג אדנווירוס אדם 5 מבוססים על נהלים שתוארו קודם לכן ^4,12. הגנום HCAdV בתוך פלסמיד pAdFTC הוא נטול כל הגנים אדנווירוס ורק נושא את 5'- ו3'- ITRS ואות האריזה. באסטרטגיה זו HV AdNG163R-2 ⁴ מספק את כל הגנים הנחוצים לייצו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	restriction digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restriction digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	selection of CRE expressing 116 cells
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 cell culture medium
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle	Sigma	CLS430281-24EA	infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask	Bellco	1965-61030	growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes	Beckmann Coulter	344059	density gradient centrifugation
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes	Thermo	66383	dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305	tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 touch	Biorad		qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carl Roth	A156.1	purification of DNA
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	density gradient centrifugation
sodium acetate 99%	Carl Roth	6773.2	DNA precipitation
LB medium	Carl Roth	X968.3	bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure	Carl Roth	9065.5	DNA precipitation and washing
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	lysis  buffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	lysis  buffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	dialysis buffer
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	dialysis buffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional dialysis buffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional dialysis buffer
sucrose	Carl Roth	9286.1	optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	optional dialysis buffer
1.5-ml tubes	sarstedt	72,730,005	storage of virus preparations at -80 °C