Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

Resumo

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Resumo

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

Introdução

Para aplicações de terapia génica, é de grande importância para evitar efeitos colaterais citotóxicos e imunogénicas provocadas pela expressão de proteínas virais, a própria transgene ou por proteínas virais de entrada. Os vectores de adenovírus (Adv) são amplamente utilizados para introduzir ADN estranho numa ampla variedade de células para investigar o impacto da expressão do transgene ^1,2. A versão mais avançada do AdV é representado por adenovírus vetores de alta capacidade (HCAdV) que faltam todas as sequências codificadoras virais ^{3,4 e} oferecendo assim uma capacidade de acondicionamento até 35 kb, combinadas com baixa imunogenicidade e baixa toxicidade ^5-8. Devido à sua capacidade de embalagem de alta permitem a entrega de transgenes grandes ou múltiplas utilizando uma dose única do vetor. Portanto, eles representam uma ferramenta valiosa para a comunidade de pesquisa.

Em contraste com a primeira ou segunda geração AdV faltam os genes precoces E1 e / ou E3 que podem ser facilmente produzidos utilizando-se kits comerciais, vecTor construção do genoma do vírus e a produção de HCAdV é mais complexo. O sistema para a construção de genomas HCAdV baseia-se na pAdFTC plasmídeo que transporta um genoma HCAdV desprovido de todos os sequências codificadoras virais e o plasmídeo de transporte pHM5 ^9-12. Qualquer gene de interesse de até 14 quilobases (kb) podem ser clonados no vector vaivém pHM5 em que o local de clonagem múltipla é flanqueado por reconhecimento / clivagem de locais de endonucleases homing os PI- Sce I e I-Ceu I. Por conseguinte, um gene clonado de interesse possa ser libertado por PI- consecutivo Sce I e I-CEU I digere para a subsequente inserção dirigida para os mesmos sítios de restrição presentes no genoma HCAdV contido no plasmídeo pAdFTC. Em pAdFTC o local de inserção do transgene localizado entre a PI-Sce I e I-I Ceu sítios de clivagem é flanqueado por ADN de enchimento e as sequências não codificantes adenovirais necessárias para o empacotamento do genoma tais como repetições terminais 5 'e 3' invertidas (ITRs)em ambas as extremidades e o sinal de empacotamento a jusante do 5'ITR. O DNA stuffer adicional fornece tamanho ideal do genoma HCAdV finais variando de 27 a 36 kb para garantir a embalagem eficiente durante a produção do vírus. Desde pAdFTC é um grande plasmídeo com até 45 kb (dependente do tamanho do transgene inserido) e o uso de endonucleases homing com locais de reconhecimento de ADN de comprimento comparativamente exibe forte ligação ao ADN, várias etapas de limpeza são necessárias durante a transferência do transgene a partir de pHM5 para pAdFTC. É recomendado um tratamento cuidadoso evitando forças de cisalhamento.

As ITRs do genoma HCAdV são acompanhadas por Nem eu locais de reconhecimento de enzimas de restrição situados directamente a montante do 5'ITR ea jusante da 3'ITR ^12. Portanto, HCAdV pode ser libertada por digestão Not I para a transfecção subsequente do genoma viral para a linha celular produtora HCAdV. Note-se que a utilização do enzima de restrição Not I para o relfacilidade do genoma viral a partir do plasmídeo pAdFTC implica que o transgene inserido é desprovido de sítios de reconhecimento de Not I de ADN. As células produtoras baseadas em células HEK293 (116 células) expressam de forma estável Cre recombinase. Para a amplificação do vírus 116 células são co-infectados com um vírus auxiliar (HV) fornecendo todos os genes necessários para a replicação AdV e embalagem de trans ^3,4. O HV é um AdV de primeira geração com um sinal de empacotamento floxed que é removido durante a amplificação por vírus recombinase Cre expresso em células 116 ^4. Isto assegura que os genomas predominantemente HCAdV contendo um sinal de empacotamento está intacto encapsidado.

Pré-amplificação do HCAdV é efectuada através da realização de passagens em série em passos de 116 células cultivadas em superfícies em pratos de cultura de tecidos. Depois de cada passagem partículas virais são libertadas a partir de células infectadas através da realização de três passos consecutivos de congelação-descongelação. Com cada passagem o aumento do número de células são infectadas com1/3 de lisado celular a partir da passagem anterior. Finalmente lisado proveniente do último passo de pré-amplificação é utilizado para infectar células produtoras cultivadas em suspensão num balão rotativo para a amplificação de grande escala. Os viriões são purificadas a partir das células em suspensão através da realização de uma ultracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio ^4,12. Com este procedimento, as partículas vazias e partículas completamente montados são separados em duas bandas distintas. Para concentrar ainda mais o HCAdV partículas de um segundo passo de ultracentrifugação não gradual, é executada. Subsequentemente, a banda resultante contendo o HCAdV é recolhido e dialisado contra um tampão fisiológico. Preparações de vector finais são caracterizados no que diz respeito ao número de partículas virais infecciosas absolutos, partículas e os níveis de contaminação HV. Absolutos partículas virais podem ser determinadas por lise das partículas virais e medindo a absorvância a 260 nm ou realizando-PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ^12. A infecciosidade do purespecifica- partículas de vírus pode ser determinado por medição qPCR HCAdV genomas presentes no interior das células infectadas 3 h após a infecção.

Protocolo

1. Construção de Recombinantes HCAdV Genomas baseado no plasmídeo pAdFTC

Nota: Todos os plasmídeos foram descritos anteriormente ^11,12 e estão disponíveis mediante solicitação. O procedimento de clonagem é mostrado esquematicamente na Figura 1.

1. Clonar um gene de interesse (GOI) incluindo promotor e poliadenilação sinal (PA) para o transporte para o plasmídeo pHM5, usando uma estratégia de clonagem de escolha, para gerar pHM5-GOI.
   Observação: Uma vez que pAdFTC é um plasmídeo relativamente grande, protocolos clássicos de preparação de plasmídeo são recomendadas para evitar sheering do ADN de plasmídeo utilizando kits de purificação de plasmídeo comercial que são baseados em membranas de sílica. I- Ceu I e IP -Sce I ligam-se fortemente com o DNA e alterar a mobilidade electroforética de digeridos de ADN. Portanto, uma extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com EtOH (passo 1.3) é necessária antes de electroforese em gel de agarose.
2. Digest 20 ug de pHM5-GI e 10 ug de pAdFTC por I-CeuI (10 L) durante 3 horas a 37 ° C, num volume total de 100 ul para linearizar plasmídeos (~ 2,8 kb de sequência GI + ORF e ~ 31kb, respectivamente).
3. Purifica-se plasmídeos linearizados utilizando extracção com fenol-clorofórmio, seguido de etanol (EtOH) a precipitação ^13.
   1. Adicionar 100 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico e misturar suavemente por inversão do tubo várias vezes. Centrifugar durante 2 minutos a 15.000 x g.
   2. Transferir o sobrenadante para um novo tubo, adicionar 20 ul de acetato de sódio (pH 5, 3 H) e 400 mL de gelo frio de EtOH (99,8%) e mistura-se vigorosamente a suspensão. Centrifugar durante 10 minutos a 15.000 x g.
   3. Remover o sobrenadante, adicionar 300 ul de EtOH a 70% e centrifuga-se durante 2 min a 15.000 x g. Em seguida, remover o sobrenadante e sedimento de DNA de ar seco. Dissolve-se o sedimento em 10- 20 mL de _dH2O Faça sedimento de DNA não seca muito longo, uma vez que será mais difícil obter DNA em solução.
4. Digest I-I ceu -digested pHM5-GI e pAdFTC plasmídeo a partir do passo 1.3) durante pelo menos 3 horas ou O / N com a enzima de restrição PI -Sce I (10 L) a 37 ° C, num volume total de 50 ul e subsequentemente purificar I -CeuI e PI -Sce I digerido plasmídeos utilizando extração de fenol-clorofórmio seguido de precipitação com EtOH (veja o passo 1.3). Dissolver DNA em 20 ul de nuclease livre dH _{2 O.}
5. PHM5 separado espinha dorsal do plasmídeo (2,8 kb) e o GI (a partir do passo 1.4) sobre um gel de agarose preparativo e purificar em gel o GI distribuição do gel usando um kit comercial e PCR-limpeza. Um gel de agarose representante da digestão é mostrado na Figura 2A.
6. Desfosforilar I- Ceu I e PI -Sce digerido pAdFTC (a partir do passo 1.4) com fosfatase alcalina intestinal de vitelo CIP (10 L) durante 1 h a 37 ° C, num volume total de 25 ul e purificar o plasmídeo desfosforilado pAdFTC por extracção com fenol-clorofórmio e EtOH subsequente precipitation (passo 1.3). Eluir DNA em 20 ul de nuclease livre dH _{2 O.}
7. Efectuar a electroforese de gel analítica a partir de uma aliquota do plasmídeo desfosforilado pAdFTC (a partir do passo 1.6) e o GI-fragmento purificado (do passo 1.5) para analisar se digestões são completa e os tamanhos dos fragmentos esperados estão correctas (~ 31 kb para pAdFTC linearizado ).
   Nota: O tamanho do GI é variável dependendo do tamanho da cassete de expressão do transgene. Estimar as concentrações relativas dos respectivos fragmentos de ligação subsequente. Um gel de agarose de fragmentos representante purificada é mostrado na Figura 2B.
8. Defina-se a reacção de ligação num volume total de 20 ul usando 400 U de T4 ADN-ligase e uma razão molar de vector para inserção de 1: 3.
   NOTA: Em concordância com o gel de agarose mostrado na Figura 2B que geralmente ligadura num volume total de 20 ul com 2 a 6 ul vector, com 8 a 12 ulinserir e 400 U de T4 ADN-ligase. À medida que a concentração de ADN é geralmente baixa após vários passos fenolização, utilizar tanto quanto possível de ADN de modo a que não _H2O adicional tem de ser adicionado para atingir o volume final de 20 ul. Ligadura a 16 ° CO / N e subsequentemente realizar a extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com EtOH (passo 1.3).
   1. Elui-se o ADN em 15 ul de nuclease livre dH _{2 O e} digerir a reacção de ligação purificada com a enzima de restrição SwaI (10 L) durante 2 h a 25 ° C, num volume total de 20 ul. Em seguida, concentrar e purificar o ADN, por realização de extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com EtOH (passo 1.3). Eluir DNA em 10 ul de nuclease livre dH _{2 O.}
9. Transformar 2 ul do Swa I purificado digerido produto de ligação através de electroporação em DH10B electrocompetentes ou DH5a de E. coli e selecção de clones, durante 16 a 24 horas a 37 ° C em meio contendo ampicilina LBplacas (50 mg / ml de ampicilina). Escolha 5- 10 clones e preparar DNA de plasmídeo mini-preparações utilizando lise alcalina seguido de extracção com fenol-clorofórmio e precipitação subsequente de EtOH (passo 1.3) ^13.
10. Executar uma digestão analítica de mini-preparações de plasmídeo seguido por electroforese em gel de agarose para verificar o tamanho dos fragmentos de ADN. Enzimas de restrição são sugeridos, por exemplo, I-CEU I e PI-Sce I libertar o inserto, Spe I ou HincII (Figura 2C).
11. Amplificar um clone correcto em meio LB contendo ampicilina (50 mg / ml de ampicilina) e realizar uma preparação maxi-Midi- ou qualquer plasmídeo utilizando o kit de purificação de plasmídeo disponíveis comercialmente.

2. Lançamento de HCAdV-genomas de pAdFTC plasmídeo e Preamplification de HCAdV vetores na Linha Produtor celular 116

1. Digerir 20 ug do plasmídeo de produção de adenovírus baseada em pAdFTC contendo o GI clonado a partir do passo 1.11) emnum volume total de 100 ul utilizando Not I (20 L) a 37 ° C durante> 2 horas e realizar a extracção com fenol-clorofórmio, seguido duas vezes por precipitação com EtOH. Dissolve-se em 20 a 30 ul estéril dH _{2 O.}
2. Verificar-se uma alíquota diluída de 1:10-GI-ADN pAdFTC digerido por electroforese em gel. Um fragmento de 9 kb para a estrutura do plasmideo e, dependendo do tamanho do GI, um segundo fragmento de ADN para o genoma HCAdV (tamanho: 28- 36 kb) é detectável.
   NOTA: Um exemplo representativo do Not I digest é exibido na Figura 2D. ADN linearizado pode ser armazenada durante vários dias a 4 ° C ou a -20 ° C durante várias semanas.
3. Antes de prosseguir com o protocolo, certifique-se de que o vírus auxiliar AdNG163R-2 foi amplificada ^4.
   Nota: As células transfectadas com pAdFTC derivado vetores HCAdV são organismos geneticamente modificados classificados como Nível de Biossegurança 2 (BSL-2), por favor use contenção adequada e tratamento de resíduosmedidas, incluindo equipamento de protecção individual, e trabalhar sob BSL-2 capelas de fluxo laminar.
4. Cultura 116 células em meio MEM de Eagle suplementado com 10% de FBS e higromicina B (100 ug / mL). Sementes de baixa passagem (passagem 10 abaixo) 116 células (~ 0,4X 10 ⁶ células) em 60 mm um prato de cultura de tecidos um dia antes da transfecção de forma que eles atingem 50- 80% de confluência no dia seguinte.
5. Transfectar genoma HCAdV linearizado a partir do passo (2.1) em 116 células, utilizando métodos tais como, transfecção com fosfato de cálcio ou outros reagentes de transfecção comercialmente disponíveis (Figura 3A). 16- 18 horas após a transfecção, o meio cuidadosamente remover, adicionar 3 ml de meio fresco (MEM, FBS a 5%) e infectar as células com o HV-2 AdNG163R ⁴ aplicando 5 unidades transdutoras (TU) por célula (uma vez que um 60 mm confluentes cultura de tecidos prato contém ~ 3.2 x ¹⁰ 6 células, adicionar ~ 1.6x ¹⁰ 7 TU de HV).
   1. Suavemente mover o prato a cada 20 minutos durante a primeira hora após a infecçãoassegurar a distribuição igual HV. Cultivar as células infectadas a 37 ° C e 5% de CO _2. Em caso de efeito de amplificação virus citopático eficiente (CPE) causada pela replicação do vírus (células são arredondadas para cima e amarrado ou separado da cultura de tecidos prato) é observável 48 horas pós-infection.If CPE é observado mais cedo a quantidade de HV tem que ser reduzida. Se o efeito citopatogénico começa mais tarde, mais vírus auxiliar tem de ser usado.
6. Células colheita incluindo o sobrenadante 48 horas após a infecção, através de lavagem fora das células da placa de cultura utilizando o meio de cultura. As células que estão em suspensão no seu meio de cultura são chamados passagem 0 (P0). Dividir P0 em duas fracções.
   1. A partir de 0,5 ml das células destacadas girar para baixo as células durante 3 minutos a 2.000 x g e remover o meio a partir do sedimento de células, que são posteriormente usadas para o isolamento de ADN genómico (ADNg) para análise baseada qPCR do processo de amplificação. Sedimentos celulares armazenar a -20 ° C até posterior processamento.
   2. A partir de 2,5ml das células destacadas libertar partículas virais por congelação (-80 ° C ou em azoto líquido) e descongelação (à TA ou um C em banho de água a 37 °) as células que são resupended no seu meio de três a quatro vezes. Esta fração do que é chamado ligado de P0.
7. Assegurar que os pratos de cultura de tecidos com 116 células que são cultivadas para 90- 95% de confluência utilizando-MEM suplementado com FBS a forma (10%) e a higromicina B (100 ug / ml) e HV estão disponíveis para os seguintes passos Passaging.
8. Misturar 1 ml de meio fresco (MEM, FBS a 5%) com 2,5 ml do lisado a partir da passagem anterior (passo 2.6.2) para um volume final de 3,5 ml, aplicando adicionar HV 2 TU por célula (um tecido uma vez que 60 mm prato de cultura com uma confluência de 90- 95% contém ~ 3.2 x 10 ⁶ células, adicionar 6,4x 10 ~ ⁶ TU de HV). (Figura 3B). Cuidadosamente remover a forma de um prato de 60 mm de 116 células e adicionar a mistura viral para as células. Repita o passo 2,6) - 2,8) duas vezes para obter lisados ​​de passeidades P1 e P2.
9. Misture 17,5 ml de meio fresco (MEM, FBS a 5%) com 2,5 ml de lisado de P2 e adicionar HV aplicando 2 TU por célula (150 mm desde um prato de cultura de tecidos a uma confluência de 80- 100% ~ 2x contém 10 ⁷ células, adicionar ~ 4x ¹⁰ 7 TU do HV). Remover o meio de um prato de 150 mm de células 116 e infectar as células com a mistura viral. Cultivar as células infectadas a 37 ° C e 5% de CO _2.
10. 48h células colheita pós-infecção, como descrito no passo 2.6) para se obter passagem P3 (Figura 3B).
    1. Repita o passo 2.6) 1.
    2. A partir do remanescente de 19,5 ml de libertação de partículas virais a partir de células P3 resupended por congelação e descongelação de três a quatro vezes. Esta fracção é denominada de lisado de P3.
       Nota: Alguns vectores, eventualmente, pode exigir passagens adicionais em pratos de 150 mm até que sejam suficientemente amplificado. Portanto efetividade do processo de pré-amplificação precisa ser monitorado durante a passagem de sérieenvelhecimento. análise baseada qPCR do processo de amplificação pode ser efectuada tal como descrito no ponto 3 (ver também a Figura 4A). Pré-amplificação de HCAdV transportar uma cassete de expressão para a proteína fluorescente verde (GFP) pode ser facilmente avaliada por meio da observação do sinal flourecscent GFP utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 4B).

3. Acompanhamento do processo de amplificação usando Quantitative-Real Time PCR (qPCR) (ver também Figura 4A).

1. Isolar ADNg a partir de sedimentos de células de cada passagem do preamplifaction (passos 2.6) - 2,10), utilizando qualquer kit de isolamento de ADN comercial para o isolamento de células cultivadas a partir de ADNg ou outro método de escolha. Para melhores resultados de PCR usar gDNA o mais fresco possível. Caso contrário ADNg pode ser armazenado a -20 ° C até à sua utilização.
2. Para determinar o número de genomas HCAdV presente nas células da respectiva passagem através da análise de qPCR gerar uma curva padrão, utilizando ¹ 10 ^</ sup> - 10 ⁹ cópias de um plasmídeo portador do GOI contidas no genoma HCAdV.
3. Analisar a mesma quantidade de gDNA de P0- P3 (etapa 2.6- 2.10) aplicando qPCR utilizando 400 nM de primers específicos para o GOI contidas no genoma HCAdV. Para a realização de follow instruções do fabricante qPCR dos respectivos produtos químicos qPCR. Definir o programa qPCR como se segue: pré-incubação a 95 ° C durante 10 min, a amplificação em 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55- 60 ° C durante 15 s e 72 ° C durante 20 s. Com base na curva padrão do número de genomas HCAdV na reacção pode ser interpolado.

4. Large Scale amplificação de HCAdV Vetores em 116 células em crescimento em suspensão

1. Adicionar 900 ml de pré-aquecido (37 ° C) MEM fresco suplementado com FBS a 10% e a higromicina B (100 ug / ml) em um balão de 3 L de cultura Spinner (Figura 3B).
2. Remova o meio de, pelo menos, 10 150 mm pratos de cultura de tecidos individuais com 116 células cultivadas a uma confluência de 90- 100% e lavar as células com 10 ml de fresco pré-aquecido (37 ° C) suplementado com FBS MEM (10%) e a higromicina B (100 ug / ml) usando uma pipeta serológica. Pipeta para cima e para baixo várias vezes para obter uma suspensão celular homogênea. Transferir directamente as células no frasco de rotação contendo já 900 ml a partir do passo 4.1).
   Nota: Não use tripsina / EDTA, pois pode afetar negativamente o crescimento de células em suspensão. Após remoção do meio as células imediatamente transferir para o frasco com agitação. Não lidar com mais do que duas placas de cultura de tecido de cada vez. Quanto maior for o tempo de espera após a adição de meios frescos, mais difícil será destacado as células do prato de cultura de tecidos.
3. Para assegurar um crescimento celular óptimo Spinner frasco incubado em um agitador magnético, num incubador de cultura de tecido durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO _2. Ajustar o agitador magnético a 70 rpm para evitar a fixação das células às superfícies de vidro.
4. Monitorar o crescimento de células em cultura Spinner balão para examinar se as células cultivadas no frasco de cultura de Spinner são viáveis ​​e se crescer a quantidades suficientes. Cada vez que antes de se adicionar meio fresco transferência de 2 ml do bioreactor para uma 60 mm de cultura de tecidos prato. Observar a morfologia das células sob um microscópio.
   Nota: As células que formam aglomerados que flutuam no meio de cultura indicam crescimento e viabilidade (ver também a Figura 4C) óptima. Depois de 24 horas, formam colónias sobre a superfície do prato de cultura de tecidos. 30- 50% de confluência indica a densidade ideal.
5. 24 horas depois de configurar a garrafa de cultura do girador adicionar 500 ml de meio fresco (MEM, 10% FBS) suplementado com higromicina B (100 ug / ml). 24 horas depois, repita este passo.
6. 72 h após a configuração da cultura em balão giratório, adicionar 1000 ml de meio MEM fresco (10% de FBS) com higromicina B (100 ug / ml), resultando num volume total de 3 L de suspensão de células.
7. 24 horas depois de ter atingido AVolume de três litros, colheita 116 células em suspensão por centrifugação durante 10 min a 500 xg à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante. Mantenha o frasco de cultura girador esvaziado sob a capa de cultura de tecidos.
8. Ressuspender pellets de células em MEM fresco suplementado com 5% de FBS pipetando cima e para baixo cerca de 8- 10 vezes para obter uma suspensão celular homogênea. O volume do meio depende se o lisado a partir do Passo 2.10) 2. (19,5 ml, veja o passo 4.8) 1. opção a) ou uma ação viral purificada de HCAdV a partir do passo 5.9) 2. (vários ul depanding em título virai, ver passo 4.8) 2., a opção b) é utilizada para a infecção das células. Utilizar um volume total de 150 ml.
   1. Opção A: Para a infecção de 116 células em suspensão com lisado de P3 (amplificação primária) células de transferência a partir do passo 4.8) para uma garrafa de armazenamento de 250 mL, equipado com um filtro estéril barra de agitação magnética ou de um frasco com agitação de pequena escala de 250 ml e as células com o co-infectar vírus dentro do lisado de P3 (passo 2.10.2) e 2 TU de HV por célula. Assumindo uma densidade de 3x10 ⁵ células por ml, o número total de células é 9 x 10 ⁸ células. Assim adicionar 1,8x ¹⁰ 9 TU do HV.
   2. Opção b: Para a infecção de 116 células em suspensão com estoque viral purificado, células de transferência a partir do passo 4.8) para uma garrafa de armazenamento de 250 mL, equipado com um filtro estéril barra de agitação magnética ou de um frasco com agitação de pequena escala de 250 ml e de co-infectar as células com as 100 partículas virais por célula de HCAdV anteriormente purificados (a partir do passo 5.9) 2.). Assim, adicionar 9 x 10 ¹⁰ de acordo com VP título físico (medido por absorvância a 260 nm; passo 6) do HCAdV purificada e 1,8x 10 ⁹ UT da HV.
9. Agita-se a mistura de células-vírus de SEP 4.8.1) ou 4.8.2) em num agitador magnético na incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 2 h a 60 rpm. Certifique-se de que o frasco de armazenamento não está completamente fechada para permitir a circulação de ar.
10. 2 horas após a infecção transferir o volume total da mistura de célula-vírus de volta para o spinner de 3 l cultobalão ure e adicionar 1,850 ml de pré-aquecido (37 ° C) MEM meio fresco suplementado com FBS a 5% para um volume total de 2 L e incubar numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 48 horas a 70 rpm.
11. Células colheita por centrifugação durante 10 min a 890x g, a temperatura ambiente em 500 ml de tubos de centrífuga. Remover o meio e ressuspender as células sedimentadas num volume total de 28 ml de DPBS. Pipeta-se para baixo e para se obter uma suspensão homogénea de células. Congelar a suspensão de células-vírus em azoto líquido ou a -80 ° C para garantir que a suspensão é completamente congelada. Armazenar a suspensão de células-vírus à temperatura de -80 ° C até à purificação a partir do vírus.

5. Purificação e Diálise de HCAdV

1. Para preparar lisado virai de cloreto de césio (CsCl) gradientes, congelar suspensão de células-vírus a partir do passo 4.11) em azoto líquido e descongelamento num banho de água a 37 ° C quatro vezes.
2. Centrifugar o lisado viral a 500 xg durante 8 minutos em RT e recolher o sobrenadante contendo o HCAdV.
3. Para preparar as soluções de CsCl Ultracentrifugação como follows.Weigh 37,5 g (para 1,5 g / cm ^3), 33,5 g (para 1,35 g / cm ^3), e 31,25 g (para 1,25 g / cm ³⁾ de CsCl em pó, respectivamente, e preencher com _dH2O a 25 ml.
   1. Stirr até solução torna-se clara e filtro estéril as soluções. Finalmente retire 1 ml de cada solução e pesá-lo em uma escala bem para verificar wether a densidade está correto. 1ml deve pesar 1,5 g, 1,35 e 1,25 g, respectivamente.
   2. Se a densidade for demasiado elevada ajustá-lo por adição progressiva de pequenos volumes (ul) de estéril dH _{2 O.} Após a adição de _dH2O medir a densitiy novamente. Se necessário, adicione mais dH _{2 O.}
   3. Repita o procedimento até que a densidade está correto. Se a densidade for demasiado baixa ajustá-lo por adição de pequena quantidade de pó de CsCl. Filtro estéril-lo novamente e verificar a densidade. Se a densidade for demasiado elevada ajustá-lo por suplementog _dH2O, tal como descrito antes. Se a densidade é ainda muito baixo adicionar mor CsCl, filtro estéril-lo novamente e verificar a densidade. Repita o procedimento até que a densidade está correto.
4. Preparar gradientes de CsCl passo em seis tubos de ultracentrífuga claras. Cuidadosa e lentamente pipetar soluções de CsCl em tubos com a seguinte ordem: 0,5 ml de 1,5 g / ^cm3 solução de CsCl, 3 ml de 1,35 g / ^cm3 solução de CsCl e 3,5 ml de 1,25 g / ^cm3 solução de CsCl (Figura 2C) .
5. Sobreposição ~ 4,5 ml de sobrenadante contendo vector apuradas a partir do passo 5.2) em cima do g / ^cm3 camada de CsCl 1,25. Centrifugar os gradientes em uma ultracentrífuga usando um balanço out rotor (SW-41) a 12 ° C durante pelo menos 2 horas a 226.000 xg (35.000 rpm) com a aceleração lenta e desaceleração para HCAdV-genoma separado contendo partículas virais de partículas vazias e celular detritos.
   NOTA: Em condições óptimas uma banda difusa de formes restos celulares em cima deos tubos. Abaixo duas faixas brancas podem ser observados. A faixa superior contém partículas vazias enquanto que a banda inferior é igual ao HCAdV (Figuras 2C e 5A).
6. Remover cuidadosamente as camadas de detritos celulares e partículas vazias e recolher 1 mL de bandas mais baixas de cada um dos tubos de transferência de vírus e com uma ponta de pipeta para um tubo limpo estéril de 50 ml. Adicionar-se a 24 ml de 1,35 g / ^cm3 solução de CsCl para as partículas de vírus recolhidas e misturar cuidadosamente.
7. Encher tubos de centrífuga com 1,35 g / ^cm3 solução de CsCl-vírus para o topo e centrifugar S / N (18- 20 h) a 226.000 x g (35.000 rpm) a 12 ° C em uma ultracentrífuga com um balanço para fora do rotor (SW-41 ), com aceleração e desaceleração lenta.
8. Recolher o HCAdV presente na banda inferior proeminente. Como um potencial de banda superior contém partículas vazias remover as camadas superiores da parte superior com uma pipeta (ver Figuras 2C e 5B) Em seguida, tirar a USI banda inferiorng de uma pipeta.
9. Dialisar as partículas do vírus coletadas para troca de buffer.
   1. Cortar uma tira de tubo de diálise (MWCO: 50.000) de cerca de 8 cm de comprimento, lave-o com dH _{2 O} estéril por três vezes. Em seguida, fechar um lado da tubagem de diálise com uma pinça plástica e transferir o vírus recolhido a partir do passo 5.8) em tubos com uma pipeta de 1 ml. Evitar bolhas de ar dentro do tubo e fechá-lo por outro lado com um plástico fechos de grampo de diálise.
   2. Dialisar em 1 L de tampão de diálise (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), glicerol a 10% e _MgCl 2 1 mM em água desionizada _H2O) durante 2 h a 4 ° Cwith agitação lenta. Tampão de diálise Exchange com 2 L de tampão de diálise e diálise O / N a 4 ° C com agitação lenta. Em alternativa utilizar um sucrosebuffer (140 mM de NaCl, 5 mM de Na ₂ HPO ₄ x2H ₂ O, 1,5 mM _de KH 2 PO ₄ e 730 mM de sacarose, pH 7,8).
   3. Coletar partículas do vírus dialisados ​​a partir do passo 5.9) 2. utilizando uma mistura 1 mL de pipette. Prepare várias aliquotas de pequenos volumes desejados (25- 100 ul) e armazenar a -80 vírus purificado ° C.

6. Medir o título das Preparações física HCAdV finais por densidade óptica (OD)

1. Dilui-se 25 ul da preparação final do vetor a partir do passo 5.9) 2 com 475 ul de tampão de lise (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0), SDS a 0,5%)), agite suavemente durante 20 min a RT e finalmente centrifuga-se durante 2 min à temperatura ambiente a 15000 x g.
2. Uma vez que os valores de absorvância a 260 nm (A260) são geralmente baixos, medir a absorvância quatro vezes utilizando 100? L de sobrenadante e calcular o valor médio dos quatro medições. Calcular o número de partículas virais por ml (VP / ml ^-1) utilizando a seguinte fórmula: VP / ml ^{-1 =} (A260 média) x (20) x (1,1 x 10 ¹²⁾ x (36 kb de tamanho / HCAdV em kb ).
   Nota: Os resultados de um rendimento típico de partículas virais absolutos (OD) de titulação são mostradas na Figura 7A . A experiência mostra, que a título de OD sobrestima o número de partículas de vírus. Partículas virais absoluto medido por OD pode ser 20- 100 vezes maior do que as partículas virais infecciosas medidas por Q-PCR. Para a medição mais precisa das partículas HCAdV absolte e infecciosas, bem como a contaminação por HV q-PCR consulte a secção 7.

7. Medir total das partículas, Unidades Infecciosas do HCAdV e Níveis HV contaminação no final Vector Preparação por qPCR. Um esquema do método de titulação é mostrado na Figura 6

1. Semente células HEK293 em 6 placas de 12 poços ou de cultura de tecidos de modo que as células atingem a confluência de 90% no dia seguinte. Para determinar o número de partículas virais infecciosas (título infeccioso), infectar as células de um poço numa placa multi-poços com 1 ul e um segundo poço com 10 uL de vírus purificada a partir do passo 5.9) 3.
2. Células colheita de infecção 3 hr post. Remover médio e adicione tripsina para cobrir todo o bem e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 5 min. Lave fora das células com tripsina usando uma pipeta e girar as células a 890 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
3. Ressuspender as células peletizadas em 200 mL de DPBS e lavá-los completamente para remover livres (não-infecciosa) partículas de vector. Centrifuga-se durante 3 min a 890 xg à temperatura ambiente. Descartar as peletes de células e ressuspender em sobrenadante 200 ul de DPBS fresco.
   Nota: Para a determinação precisa do título infeccioso, é crucial para remover todas as partículas virais não infecciosas a partir das superfícies de células por tratamento com tripsina e a lavagem exaustiva.
4. Para determinar o número total de partículas virais (partículas infecciosas e não infecciosas = partículas título física), a colheita não-infectadas células HEK293 de dois poços sem tripsina, através de lavagem fora das células com o seu meio de cultura, usando uma pipeta.
5. Girar as células durante 3 minutos a 890 xg à temperatura ambiente. Descartar a forma e ressuspender as células precipitadas em 200 mL de DPBS. Subsequently adicionar 1 ul e 10 ul de preparação HCAdV purificado directamente para as células, respectivamente. Utilização de células não infectadas como o fundo, para garantir as mesmas condições para o isolamento e subsequente ADNg Q-PCR.
6. Isolar a partir de células HEK293 ADNg derivados dos passos 7.3 e 7.5))
   1. Vortex células ressuspensas em 200 ul de DPBS (passo 7.3 e 7.4) durante 3 seg, adicionar 200 ul de solução de SDS. (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0), SDS a 0,5%) e 20 ul de proteinase K (20 mg / ml) e a suspensão vortex durante 3 segundos. Incubar 16 horas a 12- 55 ° C e agitar lentamente. Em seguida, adicionar 2 ul de ARNase A (20 mg / ml) e incubar durante 30 min a 37 ° C.
   2. Adicionar 350 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico e centrifuga-se durante 2 min a 15.000 x g. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e repita esta etapa uma vez
   3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo, adicionar 50 ul de acetato de sódio (pH 5, 3 M) e 1 mL de gelo frio de EtOH (99,8%) e misturar a suspensão. CentriFuge amostras durante 10 min a 15.000 x g para sedimentar o ADN genómico.
   4. Em seguida, remover o sobrenadante, adicionar 500 mL de EtOH a 70% e centrifuga-se durante 2 min a 15.000 x g. Remover o sobrenadante, adicionar 500 mL de EtOH a 70% e agita-se durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, centrifuga-se durante 2 min a 15.000 x g.
   5. Remover o sobrenadante e sedimento de DNA seco ao ar. Faça sedimentos de DNA não secos por um longo tempo, uma vez que será mais difícil de obter gDNA em solução. Ressuspender o sedimento de DNA em 120 ul de _dH2O e incubar durante 1 hora a ~ 37 ° C enquanto se agita. Se a solução de ADN parece viscosa, agitar durante várias horas a 37 ° C, ou incubar a 55 ° C durante ~ 1 h.
7. Para determinar HCAdV-partículas infecciosas e HCAdV-partículas absolutos, gerar uma curva padrão de 10 ¹ - 10 ⁸ cópias de um plasmídeo que transporta o GI contidos no genoma HCAdV.
8. Determinar partículas totais e partículas infecciosas, analisando as mesmas quantidades de gDNA de infectados HEK293 cvaras da etapa 7.3) e 7.4) aplicar qPCR utilizando 400 nM de primers específicos para o GOI contidas no genoma HCAdV.
9. Definir o programa de PCR como se segue: pré-incubação a 95 ° C durante 10 min, a amplificação em 40 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 55 ° C durante 10 seg e 72 ° C durante 20 seg. Com base na curva padrão (passo 7.7), interpolar o número total de genomas adenovirais na reacção.
10. Calcular o número de genomas adenovirais na preparação final vector utilizando o seguinte formular: (Número de HCAdV / peso em ng de gDNA na reacção) x (peso em ng de ADN de todas as células no prato infectada de vírus / volume em ul) .
    NOTA: A gama típica de partículas virais infectantes absolutos e os rendimentos estão em torno de 1x10 ⁷ -1x10 ⁸ viral partículas / mL. Os títulos que são dez vezes mais elevada ou mais baixa do que mostrou aqui pode ser considerado como normal. Títulos mais altos seria uma melhoria. No que diz respeito ao rácio de partic HCAdV absolutales a partículas HCAdV infecciosas, a experiência mostra que cerca de 5 a 10% das partículas HCAdV absolutos são infecciosas (Figura 7A).
11. Para determinar os níveis de contaminação com HV, realizar qPCR por amplificação de uma parte do gene tardio adenoviral 3 (L3) presente no genoma HV. Usar um plasmídeo portador do gene tardio adenoviral 3 (L3) para gerar uma curva padrão (passo 7.7).
12. Nesta reacção aplicar 400 nM do L3 primers para a frente 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'e L3 reversa 5'-ATA AGC CAT TTG GGT GTT ATG CAG GAT GG-3' juntamente com 300 nM da sonda específica L3-5'-Fam-CCA CCC GTG TGG TGG ACC TGT ACA-Tamra-3 '.
13. Definir o programa de PCR como se segue: pré-incubação / activação a 95 ° C durante 10 min, a amplificação durante 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. Use qualquer sonda universal PCR MasterMix para a reação de qPCR. Com base na curva padrão (passo 7.7), calcular o número de emHV partículas infecciosas na preparação final do vetor. Veja (Figura 7A) para rendimentos típicos para partículas HV.
14. Finalmente calcular a relação de partículas infecciosas de HCAdV absolutos para os níveis de contaminação de alta tensão para avaliar a qualidade da preparação de vector.
    Nota: Até agora uma pequena parte do HV restante não pode ser excluída. Normalmente, a percentagem de contaminação é HV ~ 5% de partículas infecciosas ou menos, o que é aceitável (Figura 7B). É claro que quanto menos HV quanto possível é desejável, especialmente se a preparação de vector vai ser utilizado para experiências com animais.

Resultados

Aqui exemplos representativos para a clonagem, amplificação e purificação de preparações HCAdV são mostrados. Uma visão geral da estratégia de clonagem (Figura 1) e exemplos representativos para a clonagem e a libertação do genoma HCAdV por digestão com enzimas de restrição estão disponíveis (Figura 2). Um padrão de restrição típica após a libertação da cassete de expressão a partir de GI-pHM5 por PI-Sce I e I-I Ceu

Discussão

O protocolo aqui apresentado permite a purificação de vectores HCAdV com base em adenovírus humano tipo 5 com base em procedimentos descritos anteriormente ^4,12. O genoma HCAdV dentro do plasmídeo pAdFTC é destituído de todos os genes de adenovírus e só transporta as ITRs 5 'e 3'- e o sinal de empacotamento. Nesta estratégia do HV AdNG163R-2 ⁴ fornece todos os genes necessários para a produção de vírus eficiente em trans. Isto oferece uma capacidade de acondicionamento...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	restriction digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restriction digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	selection of CRE expressing 116 cells
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 cell culture medium
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle	Sigma	CLS430281-24EA	infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask	Bellco	1965-61030	growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes	Beckmann Coulter	344059	density gradient centrifugation
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes	Thermo	66383	dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305	tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 touch	Biorad		qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carl Roth	A156.1	purification of DNA
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	density gradient centrifugation
sodium acetate 99%	Carl Roth	6773.2	DNA precipitation
LB medium	Carl Roth	X968.3	bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure	Carl Roth	9065.5	DNA precipitation and washing
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	lysis  buffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	lysis  buffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	dialysis buffer
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	dialysis buffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional dialysis buffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional dialysis buffer
sucrose	Carl Roth	9286.1	optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	optional dialysis buffer
1.5-ml tubes	sarstedt	72,730,005	storage of virus preparations at -80 °C