Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

Zusammenfassung

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Zusammenfassung

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

Einleitung

Für gentherapeutische Anwendungen ist es von großer Bedeutung ist es, zytotoxische und immunogene Nebenwirkungen durch die Expression von viralen Proteinen, das Transgen selbst oder von ankommenden viralen Proteine ​​zu vermeiden. Adenovirus-Vektoren (AdV) werden häufig verwendet, um Fremd-DNA in eine Vielzahl von Zellen einzuführen, um die Auswirkungen der Expression des Transgens ^1,2 zu untersuchen. Das am weitesten fortgeschrittene Version von AdV wird durch Hochleistungs-Adenovirus-Vektoren (HCAdV) fehlen alle viralen kodierenden Sequenzen ^3,4 und damit eine Verpackungskapazität von bis zu 35 kb bei geringer Immunogenität und geringe Toxizität ^5-8 bietet vertreten. Aufgrund ihrer hohen Verpackungsleistung sie ermöglichen Lieferung von großen oder mehreren Transgenen unter Verwendung eines einzelnen Vektordosis. Daher stellen sie ein wertvolles Instrument für die Forschungsgemeinschaft.

Im Gegensatz zu der ersten oder zweiten Generation AdV fehlen die frühen Gene E1 und / oder E3, die leicht mit kommerziellen Kits hergestellt werden können, vector Genom Bau und die Virusproduktion von HCAdV ist komplexer. Das System für die Konstruktion von HCAdV Genomen auf dem Plasmid pAdFTC Tragen eines HCAdV Genom frei von alen viralen kodierenden Sequenzen und dem Shuttle-Plasmid PHM5 ^9-12 basieren. Jedes Gen von Interesse von bis zu 14 Kilobasen (kb) in den Shuttle-Vektor PHM5 in dem die Mehrfach-Klonierungsstelle von Erkennungs flankiert kloniert / Spaltstellen der Homing-Endonukleasen PI- Sce I und I-Ceu I. Daher kann ein geklontes Gen von Interesse durch aufeinanderfolgende PI- Sce I und I-Ceu I freigesetzt werden verdaut für eine nachfolgende gerichtete Insertion in die gleichen Restriktionsstellen in dem Genom HCAdV im Plasmid enthaltenen pAdFTC vorhanden. In pAdFTC das Transgen Insertionsstelle zwischen dem PI- Sce I und I- Ceu I-Stellen-Spaltung entfernt wird von Füll-DNA und nicht-kodierenden Sequenzen zur adenoviralen Genoms eine Verpackung, wie beispielsweise die 5'- und 3'-Inverted Terminal Repeats (ITRs) flankiertan beiden Enden und dem Verpackungssignal stromabwärts des 5'ITR. Die zusätzliche Füll-DNA bietet eine optimale Größe der endgültigen HCAdV Genoms reicht von 27 bis 36 kb, um eine effiziente Verpackung während der Virusproduktion zu gewährleisten. Seit pAdFTC ist ein großes Plasmid mit bis zu 45 KB (abhängig von der Größe der eingefügten Transgen) und die Verwendung des Homing-Endonukleasen mit vergleichsweise langen DNA-Erkennungsstellen zeigt eine starke DNA-Bindung, mehrere Bereinigungsschritte sind notwendig, während der Übertragung des Transgens aus PHM5 um pAdFTC. Sorgfältiger Umgang Vermeidung von Scherkräften wird empfohlen.

Die ITRs des Genoms HCAdV durch Not I-Restriktionsenzym-Erkennungsstellen unmittelbar vor der 5'ITR und stromabwärts des 3'ITR ¹² flankiert. Daher kann HCAdV durch Not I zur anschließenden Transfektion des viralen Genoms in das HCAdV Erzeugerzelllinie zu verdauen freigegeben. Man beachte, dass die Verwendung der Restriktionsenzym NotI für relLeichtigkeit des viralen Genoms aus dem Plasmid pAdFTC impliziert, dass das eingefügte Transgen frei von Not I DNA-Erkennungsstellen. Die HEK293-Zelle basierend Produzentenzellen (116 Zellen) stabil Cre-Rekombinase auszudrücken. Für Virusamplifikation 116 Zellen mit einem Helfervirus (HV), allen AdV-Gene für die Replikation und Verpackung in trans ^3,4 benötigt koinfiziert. Die HV ist eine der ersten Generation AdV mit einem floxed Verpackungssignal, das während der Virus Verstärkung durch Cre-Rekombinase in 116-Zellen exprimiert ⁴ entfernt wird. Dies stellt sicher, dass überwiegend HCAdV Genome, die eine intakte Verpackungssignal eingekapselt werden.

Vorverstärkung des HCAdV durch serielle Passagierung leitenden Schritte in 116-Zellen auf Oberflächen in Gewebekulturschalen gezüchtet geführt. Nach jedem Durchgang viraler Partikel aus infizierten Zellen durch drei aufeinander folgende Durchführung Gefrier-Auftau-Stufen freigegeben. Mit jedem Durchgang immer mehr Zellen mit infiziert1/3 Zelllysat aus dem vorhergehenden Durchgang. Schließlich Lysat aus dem letzten Pre-Verstärkungsschritt wird verwendet, um Produzentenzellen in Suspension in einer Spinnerflasche für große Verstärkung gewachsen zu infizieren. Virionen werden aus den Zellen in Suspension durch Ausführen Ultrazentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten ^4,12 gereinigt. Mit dieser Vorgehensweise leere Teilchen und komplett montiert Partikel werden in zwei verschiedene Bänder getrennt. Weiter zu konzentrieren die HCAdV Partikel eine zweite nicht-schrittweise Ultrazentrifugation durchgeführt wird. Anschließend wird die resultierende Bande, die das HCAdV wird gesammelt und gegen einen physiologischen Puffer dialysiert. Endvektor Präparate bezüglich der Zahlen der absoluten Viruspartikel, infektiösen Partikeln und HV Kontamination aus. Absolutviruspartikel durch Lyse Viruspartikel und Messen der Absorption bei 260 nm oder durch Durchführen quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) ¹² bestimmt werden. Infektiosität des purified Viruspartikel können durch qPCR Mess HCAdV in infizierten Zellen 3 h nach der Infektion vorhanden Genomen bestimmt werden.

Protokoll

1. Konstruktion von rekombinanten HCAdV Genome auf der Grundlage der Plasmid pAdFTC

Hinweis: Alle Plasmide wurden zuvor ^11,12 beschrieben und sind auf Anfrage erhältlich. Das Klonierungsverfahren ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.

1. Klonen eines Gens von Interesse (GOI) einschließlich Promotor und Polyadenylierungssignal (PA) in das Shuttle-Plasmid PHM5, unter Verwendung einer Klonierungsstrategie der Wahl, um PHM5-GOI generieren.
   Hinweis: Da pAdFTC ist ein relativ großes Plasmid werden klassische Plasmidpräparation Protokolle empfohlen sheering der Plasmid-DNA unter Verwendung von kommerziellen Plasmid-Reinigungskits, der auf Silica basierende Membranen sind zu vermeiden. I- Ceu I und PI -Sce I stark an die DNA binden und ändern die elektrophoretische Beweglichkeit der verdauten DNA. Daher wird eine Phenol-Chloroform-Extraktion und EtOH Niederschlag (Schritt 1.3), bevor Agarosegelelektrophorese erforderlich.
2. Digest 20 ug pHM5-IR und 10 ug pAdFTC von I-CeuI (10 U) für 3 h bei 37 ° C in einem Gesamtvolumen von 100 ul zu linearisieren Plasmide (~ 2,8 kb + GOI ORF-Sequenz und ~ 31kb, beziehungsweise).
3. Reinige linearisierte Plasmide mit Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanol (EtOH) Niederschlag ^13.
   1. Fügen Sie 100 ul Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol und vorsichtig Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Zentrifuge für 2 min bei 15.000 x g.
   2. Den Überstand in ein neues Röhrchen werden 20 & mgr; l Natriumacetatpuffer (pH 5, 3 M) und 400 & mgr; l eiskaltem EtOH (99,8%) und mischen Suspension kräftig. Zentrifuge für 10 min bei 15.000 x g.
   3. Entfernen des Überstands werden 300 ul 70% EtOH und zentrifugieren für 2 min bei 15.000 x g. Dann entfernen Überstand und der Luft trocknen DNA-Pellet. Das Pellet in 10 bis 20 & mgr; l dH ₂ O. Trocknen Sie keine DNA-Pellet zu lang ist, wie es wird schwieriger sein, DNA in Lösung zu erhalten.
4. Digest I-Ceu I -digested PHM5-IR und pAdFTC Plasmid aus Schritt 1.3) für mindestens 3 h oder O / N mit dem Restriktionsenzym PI -Sce I (10 U) bei 37 ° C in einem Gesamtvolumen von 50 ul und anschließend reinigen I -CeuI und PI -Sce verdauten Plasmide mit Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von EtOH Niederschlag (siehe Schritt 1.3). Aufzulösen DNA in 20 ul nucleasefreiem dH ₂ O.
5. Separate PHM5 Plasmidrückgrat (2,8 kb) und die indische Regierung (aus Schritt 1.4) auf einem präparativen Agarose-Gel und Gel-Reinigung der indischen Regierung mit einem handelsüblichen Gel- und PCR clean-up-Kit. Eine repräsentative Agarosegel der Digest wird in 2A gezeigt.
6. Dephosphorylieren I- Ceu I und PI -Sce-verdaute pAdFTC (aus Schritt 1.4) mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase CIP (10 U) für 1 h bei 37 ° C in einem Gesamtvolumen von 25 ul und reinige dephosphorylierte Plasmid pAdFTC durch Phenol-Chloroform-Extraktion und anschließende EtOH precipitation (Schritt 1.3). Eluieren der DNA in 20 ul Nuklease-freien _dH 2 O
7. Zuführen analytische Gelelektrophorese von einem Aliquot des dephosphorylierten pAdFTC Plasmid (aus Stufe 1.6) und das gereinigte GOI-Fragment (aus Stufe 1.5) zu analysieren, ob verdaut abgeschlossen sind und die Größen der erwarteten Fragmente korrekt ist (sind ~ 31 kb für linearisierte pAdFTC ).
   Hinweis: Die Größe des GOI ist variabel in Abhängigkeit von der Größe der Transgen-Expressionskassette. Schätzung der relativen Konzentrationen der jeweiligen Fragmente für die anschließende Ligation. Eine repräsentative Agarosegel von gereinigten Fragmente ist in 2B gezeigt.
8. Richten Sie die Ligationsreaktion in einem Gesamtvolumen von 20 ul mit 400 U T4 DNA-Ligase und ein molares Verhältnis von Vektor zu der ein 1: 3.
   HINWEIS: In Übereinstimmung mit der in 2B gezeigten Agarosegel ligieren wir in der Regel in einem Gesamtvolumen von 20 ul mit 2- bis 6-ul Vektor, 8- bis 12 & mgr;Einfügen und 400 U T4 DNA-Ligase. Da die DNA-Konzentration ist in der Regel günstig nach mehreren Phenolisierung Schritte Verwenden soviel DNA wie möglich, so dass kein zusätzliches H _{2 O} zugegeben werden muss das Endvolumen von 20 ul zu erreichen. Ligation bei 16 ° CO / N und anschließend durchzuführen Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von EtOH Niederschlag (Schritt 1.3).
   1. Eluieren der DNA in 15 ul nucleasefreiem dH _{2 O und} verdauen die gereinigte Ligationsreaktion mit dem Restriktionsenzym SwaI (10 U) für 2 Stunden bei 25 ° C in einem Gesamtvolumen von 20 ul. Dann konzentrieren und zu reinigen DNA, indem Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von EtOH Niederschlag (Schritt 1.3). Eluieren der DNA in 10 ul Nuklease-freien _dH 2 O
9. Transformations 2 ul des gereinigten SwaI verdaut Ligierungsprodukt durch Elektroporation in DH10B oder DH5a elektrokompetente E. coli und wählen Sie Klonen für 16 bis 24 Stunden bei 37 ° C auf Ampicillin-haltigen LBPlatten (50 mg / ml Ampicillin). Wählen 5- 10 Klone und bereiten Plasmid-DNA-Mini-Präparationen mit alkalische Lyse, gefolgt von Phenol-Chloroform-Extraktion und anschließende Ausfällung EtOH (Schritt 1.3) ^13.
10. Durchführen eines analytischen Verdaus von Plasmid-Mini-Präparationen, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, um die Größe der DNA-Fragmente zu prüfen. Empfohlene Restriktionsenzyme sind beispielsweise I- Ceu I und PI- Sce I Lösen des Einsatzes, Spe I oder HincII (2C).
11. Verstärken einer korrekten Klons in ampicillinhaltigem LB-Medium (50 mg / ml Ampicillin) und führen eine MIDI- oder Maxi Plasmidpräparation mit einem beliebigen im Handel erhältlichen Plasmid-Reinigungskits.

2. Veröffentlichung HCAdV-Genome von pAdFTC Plasmide und Vorverstärkung der HCAdV Vektoren in der Producer Zelllinie 116

1. Verdauen 20 ug des pAdFTC-basierten Adenovirus-Produktion Plasmid, das das geklonte GOI aus Schritt 1.11) inein Gesamtvolumen von 100 & mgr; l mit Not I (20 U) bei 37 ° C für> 2 h und durchzuführen, Phenol-Chloroform-Extraktion durch EtOH Fällung zweimal gefolgt. Lösen sich in 20 bis 30 & mgr; l sterilem _dH 2 O
2. Überprüfen eines Aliquots 1:10 verdaut pAdFTC-GOI-DNA durch Gelelektrophorese. A 9 kb-Fragment für das Plasmidgerüst und, abhängig von der Größe des GOI, eine zweite DNA-Fragment für die HCAdV Genoms (Größe: 28- 36 kb) nachweisbar.
   HINWEIS: Ein repräsentatives Beispiel für das Not I-Verdau ist in Figur 2D dargestellt. Linearisierte DNA kann für mehrere Tage bei 4 ° C oder bei -20 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.
3. Bevor mit dem Protokoll fortfahren, stellen Sie sicher, dass das Helfervirus AdNG163R-2 verstärkt worden ^4.
   Hinweis: Zellen mit pAdFTC abgeleitet HCAdV Vektoren transfiziert sind genetisch veränderter Organismen als Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2), wenden Sie sich bitte korrekte Rückhaltung und Entsorgung verwenden klassifiziertMaßnahmen, einschließlich der persönlichen Schutzausrüstung, und arbeiten unter BSL-2 Laminarströmungshauben.
4. Kultur 116-Zellen in MEM-Eagle Medium mit 10% FBS und Hygromycin B (100 ug / ml) ergänzt. Seed Niedergang (unten Durchgang 10) 116-Zellen (~ 0,4x ¹⁰ 6 Zellen) in einem 60 mm-Gewebekulturschale einen Tag vor der Transfektion, so dass sie 50- 80% Konfluenz am nächsten Tag zu erreichen.
5. Transfektion linearisiert HCAdV Genoms aus Schritt (2.1) in 116-Zellen unter Verwendung von Methoden, wie Calciumphosphat-Transfektion oder anderen im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien (3A). 16- 18 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie vorsichtig das Medium, 3 ml frisches Medium (MEM, 5% FBS) und infizieren Zellen mit dem HV AdNG163R-2 ⁴ Anwendung 5 Wandlereinheiten (UE) pro Zelle (seit einer konfluenten 60 mm Gewebekulturschale enthält ~ 3.2x ¹⁰ 6 Zellen, fügen ~ 1.6x 10 ⁷ TU von HV).
   1. Bewegen vorsichtig das Gericht alle 20 min während der ersten Stunde nach der Infektion zudie Gleichverteilung HV. Kulti infizierten Zellen bei 37 ° C und 5% _CO 2. Im Falle eines effizienten Virusamplifikation zytopathischen Effekts (CPE) durch die Virusreplikation verursachte beobachtbare (Zellen werden aufgerundet und lose befestigt oder gelöst von der Gewebekulturschale) wird 48 Stunden nach der infection.If CPE beobachtet wird zuvor die Menge des HV hat reduziert werden. Wenn CPE beginnt später mehr Helfervirus verwendet werden.
6. Ernten der Zellen einschließlich der Überstand 48 h nach der Infektion durch Spülen von den Zellen aus der Kulturschale mit dem Kulturmedium. Zellen, die in ihrem Kulturmedium suspendiert sind, werden Durchgang namens 0 (P0). Split P0 in zwei Fraktionen.
   1. 0,5 ml der abgelösten Zellen zentrifugieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei 2.000 xg und entfernen Medium vom Zellpellet wird später zur Isolierung von genomischen DNA (gDNA) zum qPCR basierten Analyse des Amplifikationsverfahrens verwendet wird. Speicher Zellpellets bei -20 ° C bis zur Weiterverarbeitung.
   2. Von 2,5ml der abgelösten Zellen setzen virale Partikel durch Einfrieren (bei -80ºC oder in flüssigem Stickstoff) und Auftauen (bei RT oder in einem 37 ° C Wasserbad) die Zellen, die in ihrem Medium drei bis vier Mal resuspendiert werden. Diese Fraktion ist als genannte Lysat von P0.
7. Sicherzustellen, dass die Gewebekulturplatten mit 116-Zellen, die auf 90- 95% Konfluenz mit MEM-Medium mit FBS (10%) und Hygromycin B (100 ug / ml) und HV ergänzt angebaut werden, sind für die folgenden Schritte Passagieren zur Verfügung.
8. Mischen 1 ml frischem Medium (MEM, 5% FBS) mit 2,5 ml des Lysats von dem vorhergehenden Durchgang (Schritt 2.6.2) bis zu einem Endvolumen von 3,5 ml, so HV Aufbringen 2 TU pro Zelle (da ein 60-mm-Gewebe Kulturschale bei einer Konfluenz von 90- 95% enthält ~ 3.2x ¹⁰ 6 Zellen, fügen ~ 6.4x 10 ⁶ TU von HV). (3B). Das Medium aus einem 60 mm-Schale von 116 Zellen vorsichtig entfernen und fügen Sie die Virus Mischung zu den Zellen. Wiederholen Sie Schritt 2.6) - 2,8) zweimal, um Lysaten Pass zu erhaltenAltersstufen P1 und P2.
9. Mischungs 17,5 ml frisches Medium (MEM, 5% FBS) mit 2,5 ml des Lysats von P2 und fügen HV Aufbringen 2 TU pro Zelle (da eine 150 mm-Gewebekulturschale mit einer Konfluenz von 80- 100% enthält ~ 2 x ¹⁰ & sup7; Zellen, fügen ~ 4x 10 ⁷ TU des HV). Entfernen Sie das Medium aus einem 150 mm-Schale von 116-Zellen und Zellen infizieren mit dem Virusmischung. Kulti infizierten Zellen bei 37 ° C und 5% _CO 2.
10. 48h nach der Infektion Ernten der Zellen, wie in Schritt 2.6 beschrieben), um Durchgang P3 (3B) zu erhalten.
    1. Wiederholen Sie Schritt 2.6) 1.
    2. Aus der verbleibenden 19,5 ml P3 Freisetzung viralen Partikel aus den Zellen resuspendiert durch Einfrieren und Auftauen drei bis viermal. Diese Fraktion ist als genannte Lysat von P3.
       Hinweis: Einige Vektoren können eventuell zusätzliche Passagen in 150 mm-Schalen benötigen, bis sie ausreichend verstärkt. Daher Effektivität der Vorverstärkung Prozess muss in der Serien Pass überwacht werdenAltern. qPCR basierte Analyse der Verstärkungsprozess kann, wie in Abschnitt 3 (siehe auch 4A) beschrieben, durchgeführt werden. Vorverstärkung HCAdV Durchführung eine Expressionskassette für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kann leicht durch die Beobachtung der GFP flourecscent Signals unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (4B) ausgewertet werden.

3. Überwachung der Verstärkungsprozess mit Quantitative-Real Time PCR (qPCR) (siehe auch 4A).

1. Isolieren gDNA aus Zellpellets aus jedem Durchgang des preamplifaction (Schritte 2.6) - 2,10) unter Verwendung von jeder kommerziellen DNA Isolation Kit zur Isolierung von gDNA aus kultivierten Zellen oder ein anderes Verfahren der Wahl. Für eine optimale PCR-Ergebnisse verwenden gDNA so frisch wie möglich. Andernfalls gDNA kann bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
2. Zur Bestimmung der Anzahl von HCAdV Genome in den Zellen des jeweiligen Durchgang durch qPCR-Analyse vorhanden Generieren Sie eine Standardkurve unter Verwendung von 10 ^{1 <}/ sup> - ¹⁰ 9 Kopien eines Plasmid, das die indische Regierung im HCAdV Genom enthalten.
3. Analysieren die gleiche Menge von gDNA P0- P3 (Schritt 2.6- 2.10) Anwenden qPCR unter Verwendung von 400 nM der Primer, die spezifisch für das GOI in der HCAdV Genom enthalten. Für die Durchführung von qPCR Folgeherstellerangaben des jeweiligen qPCR Chemikalien. Gesetzt den qPCR Programm wie folgt: Vorinkubation bei 95 ° C für 10 min, Amplifikation in 40 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 55- 60ºC für 15 s und 72 ° C für 20 s. Auf der Basis der Standardkurve die Anzahl der HCAdV Genomen in der Reaktion kann interpoliert werden.

4. Large Scale Amplifikation von HCAdV Vektoren in 116-Zellen in Suspension wachsen

1. Add 900 ml vorgewärmtem (37 ° C) frisches MEM mit 10% FBS und Hygromycin B (100 ug / ml) ergänzt in einen 3 l Spinner-Kulturflasche (3B).
2. Entfernen Sie Medium aus mindestens 10 einzelnen 150 mm-Gewebekulturschalen mit 116 Zellen bei einer Konfluenz von 90- 100% gewachsen und wegzuspülen Zellen mit 10 ml frischem vorgewärmtem (37 ° C) MEM, das mit FBS (10%) und Hygromycin B (100 ug / ml) unter Verwendung einer serologischen Pipette ergänzt. Pipette nach oben und unten mehrere Male, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie Zellen direkt in die Spinnerflasche bereits 900 ml von Schritt 4.1 enthalten).
   Hinweis: Verwenden Sie keine Trypsin / EDTA, wie es kann sich negativ Wachstum von Suspensionszellen beeinflussen. Nach dem Entfernen des Mediums unmittelbar übertragen Zellen in die Spinnerflasche. Mehr als zwei Gewebekulturschalen Fassen Sie zu einem Zeitpunkt. Je länger die Wartezeit nach der Zugabe von frischem Medium, desto schwieriger wird es sein, die Zellen von der Gewebekulturschale abgelöst.
3. Um ein optimales Zellwachstum Inkubat Spinnerflasche auf einem Magnetrührer in einem Gewebekultur-Inkubator für 24 h bei 37 ° C zu gewährleisten und _5% CO 2. Einstellen der Magnetrührer auf 70 rpm, um die Befestigung der Zellen an den Glasoberflächen zu vermeiden.
4. Überwachung des Zellwachstums in Spinnerkulturflasche zu untersuchen, ob Zellen in Spinnerkulturflaschen gezüchtet lebensfähig sind und ob sie ausreichende Mengen wachsen. Jedes Mal vor der Zugabe von frischem Medium Transfer 2 ml aus dem Bioreaktor zu einer 60 mm Gewebekulturschale. Beachten Zellmorphologie unter dem Mikroskop.
   Hinweis: Die Zellen bilden Klumpen schwebend in dem Kulturmedium anzuzeigen optimales Wachstum und Rentabilität (siehe auch 4C). Nach 24 h bilden Kolonien auf der Oberfläche der Gewebekulturschale. 30- 50% Konfluenz zeigt optimale Dichte.
5. 24 Stunden nach der Einrichtung des Spinnerkulturflasche fügen 500 ml frisches Medium (MEM, 10% FBS) mit Hygromycin B (100 ug / ml) ergänzt. 24 Stunden später diesen Schritt wiederholen.
6. 72 h nach dem Einrichten der Spinner-Kultur, fügen 1.000 ml frisches MEM-Medien (10% FBS) mit Hygromycin B (100 ug / ml), was zu einem Gesamtvolumen von 3 l Zellsuspension.
7. 24 Stunden nach Erreichen avolume von drei Litern, der Ernte 116 Suspensionszellen durch Zentrifugation für 10 min bei 500 × g bei RT. Überstand verwerfen. Halten Sie die geleert Spinnerkulturflasche unter der Gewebekultur Kapuze.
8. Resuspendieren Zellpellets in frischem MEM mit 5% FBS ergänzt durch Auf- und Abpipettieren ca. 8- 10-mal, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Das Volumen des Mediums abhängig, ob Lysat aus Schritt 2.10) 2. (19,5 ml, siehe Schritt 4.8) 1. Option a) oder einer gereinigten viralen Bestand an HCAdV aus Schritt 5.9) 2. (mehrere ul depanding auf Virustiter, siehe Schritt 4.8) 2., Option b) ist für Infektion der Zellen verwendet. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 150 ml.
   1. Option A: Zur Infektion von 116 Zellen in Suspension mit Lysat von P3 (Primärverstärkungs) Übertragungszellen aus Stufe 4.8) in einen 250 ml-Vorratsflasche mit einer sterilen magnetischen Rührstab oder einem 250ml kleinen Spinnerflasche und ausgestattet co-infizieren Zellen mit dem Virus innerhalb des Lysats von P3 (Schritt 2.10.2) und 2; TU HV pro Zelle. Unter der Annahme einer Dichte von 3x¹⁰ 5 Zellen pro ml ist die Gesamtzellzahl 9x ¹⁰ 8 Zellen. So fügen 1.8x ¹⁰ 9 TU der HV.
   2. Option B: Zur Infektion von 116 Zellen in Suspension mit gereinigtem Virus-Lager, Übertragungszellen aus Stufe 4.8) in einen 250 ml-Vorratsflasche mit einer sterilen magnetischen Rührstab oder einem 250ml kleinen Spinnerflasche und ausgestattet co-infizieren Zellen mit den 100 Virusteilchen pro Zelle früher gereinigt HCAdV (aus Schritt 5.9). 2). Somit fügen 9x ¹⁰ 10 VP nach physikalischen Titer (durch Extinktion bei 260 nm gemessen, Schritt 6) des gereinigten HCAdV und 1,8x ¹⁰ 9 TU des HV.
9. Rühren die Zell-Virus-Mischung SEP 4.8.1) bzw. 4.8.2) in auf einen Magnetrührer in der Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C und 5% _CO 2 für 2 Stunden bei 60 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass die Vorratsflasche nicht vollständig geschlossen ist, um die Luftzirkulation zu ermöglichen.
10. 2 h nach der Infektion und das gesamte Volumen der Zell-Virus-Gemisch wieder in den 3 l Spinner Kulture eingewogen und 1.850 ml frischem vorgewärmtem (37 ° C) MEM-Medium mit 5% FBS, zu einem Gesamtvolumen von 2 l und Inkubation im Brutschrank bei 37 ° C und 5% _CO 2 für 48 Stunden bei 70 Umdrehungen pro Minute.
11. Ernten der Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 890x g bei RT in 500 ml-Zentrifugenröhrchen. Entfernen des Mediums und Resuspendieren pelletierten Zellen in einem Gesamtvolumen von 28 ml DPBS. Pipette nach oben und unten, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Frieren Sie das Zell-Virus-Suspension in flüssigem Stickstoff oder bei -80 ° C, sicherzustellen, dass die Suspension vollständig gefroren. Bewahren Sie die Zell-Virus-Suspension bei -80 ° C bis zum Start der Virusreinigung.

5. Dialyse von HCAdV

1. Um Viruslysat für Cäsiumchlorid (CsCl) Gradienten vorzubereiten, Gefriert Zell-Virus-Suspension aus Schritt 4.11) in flüssigem Stickstoff und Auftauen im Wasserbad bei 37 ° C viermal.
2. Zentrifugieren Sie die Viruslysat bei 500 · g für 8 Minuten bei RT und sammeln den Überstand, der die HCAdV.
3. Für Ultrazentrifugation vorzubereiten CsCl-Lösungen als follows.Weigh 37,5 g (1,5 g / ^cm 3), 33,5 g (1,35 g / cm ^{3) und} 31,25 g (1,25 g / ^cm 3) von CsCl Pulver jeweils und füllen mit _dH 2 O auf 25 ml.
   1. Umrühren, bis die Lösung klar wird und Sterilfilter die Lösungen. Schließlich entfernen 1 ml jeder Lösung und wiegen Sie es auf einer feinen Skala, um zu überprüfen, ob die Dichte korrekt ist. 1 ml sollten 1,5 g, 1,35 und 1,25 g bzw. zu gewichten.
   2. Wenn die Dichte zu hoch einstellen durch schrittweise Zugabe von kleinen Mengen (& mgr; l) von sterilem dH ₂ O. Nach Zugabe von _dH 2 O messen die Density erneut. Evtl. _dH 2 O
   3. Wiederholen Sie den Vorgang, bis Dichte korrekt ist. Wenn die Dichte zu niedrig einstellen durch Zugabe einer kleinen Menge CsCl Pulver. Sterilfilter es wieder und die Dichte zu überprüfen. Ist die Dichte zu hoch ist, stellen Sie ihn durch Add-g dH _{2 O,} wie oben beschrieben. Wenn die Dichte ist immer noch zu niedrig erneut hinzufügen mor CsCl, Sterilfilter ist und überprüfen Sie die Dichte. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Dichte korrekt ist.
4. Bereiten CsCl Stufengradienten in sechs klar Ultrazentrifugenröhrchen. Vorsichtig und langsam pipettieren CsCl-Lösungen in die Rohre mit Hilfe der folgenden Reihenfolge: 0,5 ml von 1,5 ^g / cm 3 CsCl-Lösung, 3 ml von 1,35 ^g / cm 3 CsCl-Lösung und 3,5 ml von 1,25 ^g / cm 3 CsCl-Lösung (2C) .
5. Overlay ~ 4,5 ml gelöscht Vektorüberstand aus Schritt 5.2) auf der Oberseite der 1,25 ^g / cm 3 CsCl-Schicht. Centrifuge die Gradienten in der Ultrazentrifuge unter Verwendung eines Schwenkrotor (SW-41) bei 12 ° C für mindestens 2 h bei 226.000 xg (35.000 rpm) mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung zu trennen HCAdV-Genom Viruspartikel aus leeren Teilchen und Zellen enthält, Trümmer.
   HINWEIS: Unter optimalen Bedingungen eine diffuse Bande von Zelltrümmern Formen auf der Oberseitedie Rohre. Unten zwei weiße Streifen beobachtet werden kann. Das obere Band enthält leere Partikel während der untere Band ist gleich der HCAdV (2C und 5A).
6. Entfernen Sie vorsichtig die Schichten der Zelltrümmer und leeren Partikel und sammeln Sie 1 ml der unteren Bänder aus jedem Röhrchen und Transfer-Virus mit einem sauberen Pipettenspitze in eine sterile 50-ml-Tube. Sie können bis zu 24 ml von 1,35 ^g / cm 3 CsCl-Lösung, um den gesammelten Viruspartikel und sorgfältig mischen.
7. Füllen Zentrifugenröhrchen mit 1,35 ^g / cm 3 CsCl-Virus-Lösung an die Spitze und Zentrifugen O / N (18- 20 h) bei 226.000 xg (35.000 rpm) bei 12 ° C in einer Ultrazentrifuge unter Verwendung eines Schwenkrotor (SW-41 ) mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung.
8. Sammeln Sie die in der prominenten Unterband vorhanden HCAdV. Als eine potenzielle obere Band enthält leere Partikel zu entfernen oberen Schichten von oben mit einer Pipette (siehe 2C und 5B), dann nehmen die untere Bande using einer Pipette.
9. Dialysiere die gesammelten Viruspartikel für Pufferaustausch.
   1. Schneiden Sie einen Streifen von Dialyseschlauch (MWCO: 50.000) von etwa 8 cm in der Länge, waschen Sie es mit sterilem _dH 2 O dreimal. Dann schließen eine Seite der Dialyseschlauch mit einer Kunststoffschelle und übertragen der gesammelten Virus aus Stufe 5.8) in die Rohrleitung unter Verwendung einer 1 ml-Pipette. Vermeiden Sie Luftblasen im Schlauch und schließen Sie es auf der anderen Seite mit einer Kunststoffschelle Dialyseschließungen.
   2. Dialysieren in 1 l Dialysepuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% Glycerin und 1 mM MgCl _{2 in} entionisiertem _H 2 O) für 2 h bei 4 ° Cmit langsamem Rühren. Wechseldialysepuffer mit 2 l Dialysepuffer dialysiert und O / N bei 4 ° C unter langsamem Rühren. Alternativ eine sucrosebuffer (140 mM NaCl, 5 mM Na _{2 HPO 4} × 2H _{2 O,} 1,5 mM KH _{2 PO 4} und 730 mM Saccharose, pH 7,8).
   3. Sammeln dialysierte Viruspartikeln aus Schritt 5.9) 2. Verwendung einer 1 ml pipette. Vorbereiten mehrerer Aliquote der gewünschten kleinen Volumina (25- 100 ul) und speichert gereinigten Virus bei -80 ° C.

6. Messung der physikalischen Titer von Final HCAdV Vorbereitungen der optischen Dichte (OD)

1. Verdünnen von 25 ul der endgültigen Vektorpräparation aus Schritt 5.9) 2 mit 475 ul Lysepuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS)), leicht geschüttelt für 20 Minuten bei RT und schließlich zentrifugiert werden für 2 Minuten bei RT bei 15.000 x g.
2. Da die Absorptionswerte bei 260 nm (A260) in der Regel niedrig sind, zu messen Absorption viermal mit 100 ul des Überstands und berechnen Mittelwert der vier Messungen. Berechnen Sie die Anzahl der Viruspartikel pro ml (vp / ml ^-1) mit der folgenden Formel: vp / ml ^{-1 =} (Mittelwert A260) x (20) x (1,1 x 10 ¹²⁾ x (36 kb / HCAdV Größe in KB ).
   Anmerkung: Die Ergebnisse einer typischen Ausbeute von absolute Viruspartikel (OD-Titer) in 7A gezeigten . Die Erfahrung zeigt, dass die OD-Titer überschätzt die Zahl der Viruspartikel. Absolut viralen Partikel durch OD mess 20- 100-mal höher als infektiöse virale Partikel durch Q-PCR gemessen. Für eine genauere Messung von absolte und Infektions HCAdV Partikel sowie HV Kontamination durch q-PCR Abschnitt 7 beziehen.

7. Mess gesamten Teilchen, infektiöse Einheiten des HCAdV und HV-Kontamination in der Schluss Vector Vorbereitung von qPCR. Ein Schema der Titration wird in 6 gezeigt

1. Samen HEK293-Zellen in 6 oder 12-Well-Gewebekulturplatten so, dass die Zellen bis zu 90% Konfluenz am nächsten Tag. Um die Anzahl von infektiösen Viruspartikeln (infektiöse Titer) zu bestimmen, zu infizieren Zellen einer Vertiefung in einer Platte mit mehreren Vertiefungen mit 1 & mgr; l, und eine zweite gut mit 10 ul gereinigtem Virus aus Stufe 5.9) 3.
2. Ernten Sie die Zellen 3 Stunden nach der Infektion. Entfernen Sie Medium und fügen Trypsin, das ganze gut abdecken und Inkubation bei 37 ° C und _5% CO 2 für 5 min. Wegzuspülen die Zellen mit Trypsin mit einer Pipette und Spin-down werden die Zellen bei 890 g für 3 min bei RT.
3. Resuspendieren der pelletierten Zellen in 200 ul DPBS und waschen Sie sie gründlich, um freie (nicht-infektiösen) Vektorpartikel zu entfernen. Zentrifugieren für 3 min bei 890 · g bei RT. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellets in 200 ul frisches DPBS.
   Anmerkung: Für eine genaue Bestimmung der infektiösen Titer, ist es entscheidend, alle nicht-infektiöse Viruspartikel aus den Zelloberflächen durch Trypsinbehandlung und gründliches Waschen zu entfernen.
4. Um die Gesamtviruspartikel Nummer (infektiöse Partikel und nicht infektiösen Partikel = physikalische Titer) zu bestimmen, der Ernte nicht infizierten HEK293-Zellen von zwei Brunnen ohne Trypsin durch Spülen von den Zellen, die mit ihrem Kulturmedium mit einer Pipette.
5. Spin down die Zellen für 3 min bei 890 × g bei RT. Entsorgen Sie die mittleren und resuspendieren pelletierten Zellen in 200 ul DPBS. Subsequently hinzuzufügen 1 ul und 10 ul gereinigt HCAdV Zubereitung direkt auf die Zellen. Verwenden Sie nicht infizierten Zellen als Hintergrund, um die gleichen Bedingungen für gDNA Isolierung und anschließende q-PCR zu gewährleisten.
6. Isolieren gDNA aus HEK293-Zellen aus den Schritten 7.3 abgeleitet) und 7.5)
   1. Wirbelzellen in 200 ul DPBS (Schritt 7.3 und 7.4) für 3 sec, resuspendiert werden 200 ul SDS-Lösung. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS) und 20 ul Proteinase K (20 mg / ml), vortexen Suspension für 3 sec. Inkubieren 12- 16 Stunden bei 55 ° C und schüttelt langsam. Dann fügen Sie 2 ul RNAse A (20 mg / ml) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
   2. Mit 350 & mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol und zentrifugieren für 2 min bei 15.000 x g. Den Überstand in ein neues Röhrchen und wiederholen Sie diesen Schritt einmal
   3. Den Überstand in ein neues Röhrchen werden 50 & mgr; l Natriumacetatpuffer (pH 5, 3 M) und 1 ml eiskaltem EtOH (99,8%) und mischen Suspension. Centrifuge Proben für 10 Minuten bei 15.000 xg pelletiert genomischer DNA.
   4. Dann entfernen Sie den Überstand, 500 & mgr; l 70% EtOH und Zentrifuge für 2 min bei 15.000 x g. Entfernen Sie den Überstand, 500 & mgr; l 70% EtOH und schütteln für 30 min bei RT. Dann zentrifugieren für 2 min bei 15.000 x g.
   5. Entfernen Sie den Überstand und der Luft trocknen DNA-Pellet. Trocknen Sie keine DNA-Pellets für eine lange Zeit, da es wird schwieriger sein, gDNA in Lösung zu erhalten. Resuspendieren der DNA-Pellet in 120 & mgr; l _dH 2 O und Inkubation für ca. 1 h bei 37 ° C unter Schütteln. Wenn DNA-Lösung erscheint viskose, schütteln Sie sie für mehrere Stunden bei 37 ° C, oder Inkubation bei 55 ° C für ca. 1 Std.
7. Um infektiöse HCAdV-Teilchen und absolute HCAdV-Partikel zu bestimmen, zu erzeugen, eine Standardkurve ^von 10 1 - 10 ⁸ Kopien eines Plasmids, welches das GOI in der HCAdV Genom enthalten.
8. Bestimmen Sie Gesamtpartikel und infektiösen Partikel durch die Analyse der gleichen Mengen an gDNA von infizierten HEK293 cEllen von Schritt 7.3) und 7.4) gelten qPCR mit 400 nM von Primern spezifisch für die indische Regierung im HCAdV Genom enthalten.
9. Stellen Sie die PCR-Programm wie folgt: Vorinkubation bei 95 ° C für 10 min, Amplifikation in 40 Zyklen von 95 ° C für 10 sec, 55 ° C für 10 sec und 72 ° C für 20 sec. Auf der Basis der Standardkurve (Schritt 7.7), zu interpolieren, die Gesamtzahl von adenoviralen Genomen in der Reaktion.
10. Berechnung der Anzahl von adenoviralen Genomen in der endgültigen Vektorpräparation mit dem folgenden Formel: (Anzahl der HCAdV / Gewicht in ng gDNA in der Reaktion) x (Gewicht in ng DNA aller Zellen in der infizierten Platte / Volumen Virus in ul) .
    HINWEIS: Der typische Bereich für absolute und infektiöse Viruspartikel Renditen liegen bei 1x10 ⁷ -1x10 ⁸ Viruspartikel / ul. Titer, die das Zehnfache höher oder niedriger als hier gezeigt, sind als normal angesehen werden. Höhere Titer eine Verbesserung wäre. In Bezug auf das Verhältnis der absoluten HCAdV particles, um Infektions HCAdV Partikel zeigt die Erfahrung, dass etwa 5- 10% der absoluten HCAdV Partikel infektiös sind (7A).
11. Um die Kontamination mit HV zu bestimmen, führen qPCR durch Verstärken einen Teil des adenoviralen späten Gen 3 (L3) in der HV-Genom vorhanden. Verwenden ein Plasmid, das das adenovirale späte Gen 3 (L3), um eine Standardkurve (Schritt 7,7) zu erzeugen.
12. Bei dieser Umsetzung anwenden 400 nM der Primer L3 vorwärts 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'und L3 umgekehrter 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3' zusammen mit 300 nM des L3-spezifischen Sonde 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
13. Stellen Sie die PCR-Programm wie folgt: Vorinkubation / Aktivierung bei 95 ° C für 10 min, während der Amplifikation 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 1 min. Verwenden Sie eine universelle Sonde PCR Mastermix für die qPCR Reaktion. Auf der Basis der Standardkurve (Schritt 7.7), die Berechnung der Anzahl der inInfektions HV Partikel in der endgültigen Vektor Vorbereitung. Siehe (7A) für typische Ausbeuten für HV-Teilchen.
14. Schließlich wird das Verhältnis der absoluten infektiösen Teilchen HCAdV HV Kontaminationsniveaus, um die Qualität der Vektorpräparation zu beurteilen.
    Hinweis: Bis jetzt ein kleiner Teil der verbleibenden HV kann nicht ausgeschlossen werden. In der Regel der Anteil der HV Kontamination ~ 5% der infektiösen Partikel oder weniger, was akzeptabel ist (7B). Natürlich weniger als HV wie möglich wünschenswert ist, insbesondere wenn der Vektorpräparation wird für Tierversuche verwendet werden.

Ergebnisse

Hier repräsentative Beispiele für die Klonierung, Amplifikation und Reinigung von HCAdV Zubereitungen gezeigt. Ein Überblick über die Klonierungsstrategie (Abbildung 1) und repräsentative Beispiele für das Klonen und die Freisetzung des HCAdV Genom durch Restriktionsenzymverdau vorgesehen sind (Figur 2). Eine typische Restriktionsmuster nach dem Lösen der GOI-Expressionskassette aus PHM5 von PI- Sce I und I Ceu ich verdauen und a...

Diskussion

Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt die Reinigung von HCAdV Vektoren auf Basis menschlichen Adenovirus Typ 5 basierend auf zuvor beschriebene Verfahren ^4,12. Die HCAdV Genom innerhalb der pAdFTC Plasmid ist frei von allen Adenovirusgene und nur trägt die 5'- und 3'-ITR und das Verpackungssignal. In dieser Strategie die HV AdNG163R-2 ⁴ stellt alle notwendigen Gene, die für eine effiziente Virusproduktion in trans. Dies bietet eine Verpackungskapazität von bis zu 35 kb, was ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	restriction digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restriction digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	selection of CRE expressing 116 cells
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 cell culture medium
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle	Sigma	CLS430281-24EA	infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask	Bellco	1965-61030	growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes	Beckmann Coulter	344059	density gradient centrifugation
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes	Thermo	66383	dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305	tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 touch	Biorad		qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carl Roth	A156.1	purification of DNA
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	density gradient centrifugation
sodium acetate 99%	Carl Roth	6773.2	DNA precipitation
LB medium	Carl Roth	X968.3	bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure	Carl Roth	9065.5	DNA precipitation and washing
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	lysis  buffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	lysis  buffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	dialysis buffer
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	dialysis buffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional dialysis buffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional dialysis buffer
sucrose	Carl Roth	9286.1	optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	optional dialysis buffer
1.5-ml tubes	sarstedt	72,730,005	storage of virus preparations at -80 °C