인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

요약

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

초록

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

서문

유전자 치료 응용 것이 바이러스 단백질의 발현, 유전자 자체 또는 수신 바이러스 단백질에 의한 세포 독성 및 면역 부작용을 방지하기 위해 매우 중요하다. 아데노 바이러스 벡터 (ADV)가 널리 도입 유전자 발현 ^1,2의 영향을 조사하기 위해 다양한 세포에 외래 DNA를 도입하기 위해 사용된다. ADV의 가장 진보 된 버전은 모든 바이러스 코딩 서열 ^{3,4-함으로써} 낮은 면역 원성 및 저독성 ^5-8 결합 35킬로바이트까지 패키징을 제공하는 능력이 결여 된 고용량 아데노 바이러스 벡터 (HCAdV)으로 표시된다. 때문에 높은 포장 용량 그들은 하나의 벡터 용량을 사용하여 크거나 여러 유전자의 전달을 할 수 있습니다. 따라서, 그들은 연구 지역 사회를위한 유용한 도구를 나타냅니다.

대조적으로, 제일 - 또는 VEC를 2 세대 ADV 쉽게 상업용 키트를 사용하여 제조 할 수있다 초기 유전자 E1 및 / 또는 E3 결여 할토르 HCAdV의 게놈 구조와 바이러스 생산은 더 복잡하다. HCAdV 게놈의 건설을위한 시스템은 모든 바이러스 코딩 시퀀스 및 셔틀 플라스미드 pHM5 ^9-12없는 HCAdV 게놈을 운반하는 플라스미드 pAdFTC을 기반으로합니다. 최대 14 킬로베이스 (KB)의 관심의 모든 유전자가 여러 복제 사이트가 인식에 의해 형벌되는 셔틀 벡터 pHM5에 복제 할 수 있습니다 / 원점 복귀 엔도 뉴 클레아의 사이트를 절단 SceI 제한 I 및 I-CEU I.를 PI- 따라서, 관심의 유전자를 클로닝 연속 PI- 및 I-SceI 제한 I- CEU I 의해 플라스미드에 함유 pAdFTC HCAdV 게놈에 존재하는 동일한 제한 부위에 관한 후속 삽입 소화 해제 될 수있다. pAdFTC에 PI- SceI 제한 I 및 I- CEU 난 부위를 절단 사이에 유전자 삽입 부위는 스터 DNA 및 5 '및 3'반전으로 말단 반복 게놈 패키징에 필요한 비 암호화하는 아데노 바이러스 서열 (LTR에)와 측면으로 접하고단부와 하류 5'ITR 패키징 신호 모두에서. 추가 투표자 DNA는 바이러스 생산시 효율적인 포장을 보장하기 위해 27-36킬로바이트까지 최종 HCAdV 게놈의 최적 크기를 제공합니다. pAdFTC이 (삽입 된 유전자의 크기에 따라 다름)까지 45킬로바이트와 큰 플라스미드와 비교적 긴 DNA 인식 사이트와 유도 엔도 뉴 클레아의 사용을하기 때문에 결합 강한 DNA, 몇 가지 정리 단계 pHM5에서 유전자의 전송시 필요한 전시 pAdFTC에. 전단력을 피하고 취급에주의하는 것이 좋습니다.

HCAdV 게놈은 LTR에 5'ITR의 상류에 직접적으로 위치되고 3'ITR ^(12)의 하류 없음 I 제한 효소 인식 부위에 의해 측면된다. 따라서, HCAdV 없음 내가 HCAdV 생산 세포주에 바이러스 게놈의 후속 형질 다이제스트에 의해 방출 될 수있다. 참고 제한 효소의 사용하지 I REL위한플라스미드 pAdFTC에서 바이러스 게놈의 용이성 삽입 유전자가 없음 I DNA 인식 부위의 결여 된 것을 의미한다. HEK293 세포 기반 생산 세포 (116 세포)를 안정적으로 Cre 호텔 재조합 효소를 표현한다. 바이러스 증폭 셀 (116)은 트랜스 ^-3,4-의 복제 및 패키징을 위해 필요한 모든 ADV 유전자를 제공하는 헬퍼 바이러스 (HV)와 공동 감염. HV 116 ⁴ 세포에서 발현 Cre 호텔 재조합 바이러스에 의해 증폭되는 동안 제거 floxed 포장 신호와 제 세대 ADV이다. 이것은 본래 패키징 신호를 포함 주로 HCAdV 게놈 encapsidated되도록.

HCAdV의 사전 증폭 조직 배양 접시의 표면에 성장 (116) 세포에서 시리얼 계대 단계를 수행하여 수행됩니다. 각각의 통과 후 바이러스 입자는 세 개의 연속 동결 - 해동 단계를 수행하여 감염된 세포에서 방출된다. 세포의 수가 증가는 모든 통로로 감염된선행 통로에서 세포 용 해물의 1/3. 마지막 사전 증폭 단계는 대규모 증폭 스피너 플라스크에 정지에서 재배 생산 세포를 감염하는 데 사용됩니다에서 마지막으로 해물. 비리 온은 ^4,12 구배 염화 세슘 밀도에서 초 원심 분리를 수행하여 현탁 세포로부터 정제된다. 이 절차를 빈 입자와 완벽하게 조립 입자는 두 가지 대역으로 분리된다. 상기 HCAdV을 집중하는 제 2 비 - 점진적으로 초 원심 분리 단계가 수행되는 입자를 포함한다. 이어서 HCAdV 함유 얻어진 밴드 수거하고 생리 완충액에 대해 투석한다. 최종 제제는 벡터의 절대 바이러스 입자 감염성 입자 및 HV 오염 수준의 숫자에 대한 특징이다. 절대 바이러스 입자는 바이러스 입자를 용균 및 260 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 또는 정량적 실시간 PCR (qPCR에) ^(12)을 수행하여 결정될 수있다. 끝까지 마음의 감염ified하게 바이러스 입자는 감염된 세포에서 3 시간의 감염 후 내에 존재 qPCR의 측정 HCAdV 게놈에 의해 결정될 수있다.

프로토콜

플라스미드 pAdFTC 기반으로 재조합 HCAdV 게놈 1. 건설

참고 : 모든 플라스미드는 이전에 ^{11, 12를} 설명하고 요청에 따라 사용할 수있다. 클로닝 과정은도 1에 개략적으로 도시되어있다.

1. pHM5-GOI를 생성하기 위해, 선택의 클로닝 전략을 사용하여, 셔틀 플라스미드 pHM5으로 프로모터 및 폴리아 데 닐화 신호 (PA)를 포함하여 관심 유전자 (GOI)를 복제.
   주 : pAdFTC가 비교적 큰 플라스미드 때문에, 고전 플라스미드 제조 프로토콜 실리카 막에 기반 상업 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA의의 전단은 피해야한다. I-CEU I 및 PI -Sce 나는 강하게 DNA에 결합하여 소화 DNA의 전기 영동 이동성을 변경합니다. 따라서, 페놀 - 클로로포름 추출 및 침전을 EtOH (130 단계), 아가 로스 겔 전기 영동 전에 요구된다.
2. PHM의 다이제스트 20 μg의100 μL의 총 부피 37 ℃에서 3 시간 동안 I-CeuI (10 U) 5-GOI과 pAdFTC 10 μg의은 (~ 2.8 KB + GOI ORF의 순서와 ~ 31킬로바이트, 각각을) 플라스미드를 선형화합니다.
3. 에탄올 (EtOH 중) ^(13)에 의해 침전을 페놀 - 클로로포름 추출을 이용하여 선형화 된 플라스미드를 정제 하였다.
   1. 클로로포름 : 100 μL의 페놀 추가 이소 아밀 알콜 및 튜브를 수회 반전시켜 부드럽게 혼합한다. 15,000 X g에서 2 분 동안 원심 분리기.
   2. 새로운 튜브에 상청을 전송 초산 나트륨 20 μL (PH 5, 3 M) 및 얼음의 차가운 EtOH로 400 μL (99.8 %)를 첨가하고, 현탁액을 격렬하게 혼합한다. 15,000 X g에서 10 분 동안 원심 분리기.
   3. , 상층 액을 제거 15,000 X g에서 2 분 동안 300 70 %의 EtOH μL 원심 분리기를 추가합니다. 그런 다음 상층 액과 공기 건조 DNA 펠렛을 제거합니다. DH ₂ O의 10 ~ 20 μL에 펠렛을 해산 이 솔루션에서 DNA를 얻기 위해 더 열심히 할 것 같은, 너무 오래 건조하지 DNA 펠렛을 수행합니다.
4. 다이제스트 I-CEU I는 pHM5-GOI 단계 1.3 pAdFTC 플라스미드) -digested 50 ㎕의 총 부피에서 37 ℃에서 제한 효소 PI -Sce I (10 U)와 적어도 3 시간 또는 O / N에 대한 후속 I 정화 -CeuI 및 PI -Sce 나는 (단계 1.3 참조)의 EtOH 침전 다음 페놀 - 클로로포름 추출을 사용하여 플라스미드를 소화. 뉴 클레아 무료 DH ₂ O 20 μL에서 DNA를 녹여
5. 별도의 pHM5 플라스미드 백본 (2.8 KB) 및 예비 아가 로스 젤에 (단계 1.4에서) GOI 및 상업 겔을 사용하여 GOI를 젤 - 정화 및 청소 키트를 PCR-. 다이제스트의 대표적인 아가로 스겔은도 2a에 도시되어있다.
6. 탈 인산 I-CEU 나는 및 PI -Sce pAdFTC을 내가 소화 25 μL의 총 부피 37 ° C에서 1 시간 동안 송아지 장내 알칼리 포스 파타 아제 CIP (10 U)와 페놀 - 클로로포름 추출 및 이후의 EtOH에 의해 탈 인산화 플라스미드 pAdFTC 정화 (단계 1.4에서) 홍보ecipitation (단계 1.3). 뉴 클레아 무료 DH ₂ O 20 μL에서 DNA를 용출
7. 소화가 완료되고 예상 단편의 크기 (올바른지 ~ 선형화 pAdFTC위한 31킬로바이트을 분석한다 (단계 1.6)에서 탈 인산화 pAdFTC 플라스미드하고 (단계 1.5)로 정제 GOI 단편의 분취 액으로부터 분석적 겔 전기 영동을 수행 ).
   주 : GOI의 크기는 트랜스 발현 카세트의 크기에 따라 가변적이다. 이후 결찰 대한 각 단편의 상대적인 농도를 추정한다. 정제의 대표 단편을 아가 로스 겔을도 2b에 도시된다.
8. 400 U의 T4 DNA 리가 제 (1) 및 삽입하는 벡터의 몰비를 사용하여 20 ㎕의 총 부피에 연결 반응을 설정 : 3이다.
   참고 :도 2b에 도시 된 아가 로스 겔과 일치에서는 보통 6 μL 벡터로 -2- 20 μL의 총 부피에서 8 내지 12 μl를 결찰삽입하고 400 U T4의 DNA 리가. DNA 농도는 여러 phenolization 단계 후에 일반적으로 낮아서 20 μL의 최종 부피에 도달하도록 추가 H ₂ O를 첨가해야하지 않도록, 가능한 한 DNA를 사용한다. EtOH로 침전 (1.3 단계) 다음에 페놀 - 클로로포름 추출을 수행 이후 16 ° CO / N에서 결찰합니다.
   1. 클레아 무료 DH ₂ O 15 μL에 DNA를 용출, 20 μL의 총 부피에서 25 ℃에서 2 시간 동안 제한 효소 SwaI (10 U)으로 정제 연결 반응을 소화. 이어서 농축하고 침전을 EtOH (단계 1.3)이어서 페놀 - 클로로포름 추출을 행함으로써, DNA를 정제. 뉴 클레아 무료 DH ₂ O 10 μL에서 DNA를 용출
9. 정제 된 SWA의 2 μl를 변환 나는 DH10B으로 전기에 의해 결찰 제품을 분해 또는 DH5α는 E.을 electrocompetent 대장균 및 암피실린 함유 LB에 37 ° C에서 16 시간 24 선택 클론판 (50 ㎎ / ㎖의 암피실린). 5 10 클론을 선택하고, 페놀 - 클로로포름 추출 및 이후의 EtOH 침전 (단계 1.3) ⁽¹³⁾ 다음에 알칼리 분해를 사용하여 플라스미드 DNA 미니 준비를 준비합니다.
10. DNA 단편의 크기를 확인하기 위해, 아가 로스 겔 전기 영동에 이어, 플라스미드 미니 제제의 다이제스트 분석을 수행한다. 제안 된 제한 효소는 예 I-CEU I 및 PI- 된 SCE 내가 삽입, SPE I 또는 Hinc II (그림 2C)를 해제하기위한 있습니다.
11. 앰피 실린 함유 LB 배지에서 정확한 클론을 증폭 (50 ㎎ / ㎖ 암피실린) 및 시판 플라스미드 정제 키트를 사용하여 MIDI-또는 맥시 플라스미드 제조를 수행한다.

생산자 세포주 (116)에 pAdFTC 플라스미드 및 HCAdV 벡터의 프리 앰프에서 HCAdV - 게놈의 2 출시

1. 단계 1.11에서 클로닝 GOI를 함유 pAdFTC 기반 플라스미드, 아데노 바이러스 생산)에서 20 μg의 다이제스트총> 2 시간 동안 37 ° C에 있지 I (20 U)를 사용하여 100 ㎕의 부피 및 수행 페놀 - 클로로포름 추출을 EtOH 회 침전시켰다. 20 30 μL 살균 DH ₂ O에 용해
2. 겔 전기 영동에 의해 1시 10분 희석 소화 pAdFTC-GOI-DNA의 분취 량을 확인합니다. GOI, HCAdV 게놈 (크기 : 28- 36킬로바이트) 미국 제 DNA 단편의 크기에 따라 9킬로바이트의 플라스미드 백본 단편이 검출된다.
   참고 : 아니 내가 다이제스트의 대표적인 예는 그림 2D에 표시됩니다. 선형 DNA는 몇 주 동안 4 ℃ 또는 -20 ℃에서 수 일 동안 저장 될 수있다.
3. 프로토콜을 진행하기 전에, 헬퍼 바이러스 AdNG163R-2 ⁴ 증폭되어 있는지 확인하십시오.
   참고 : pAdFTC 파생 HCAdV 벡터로 형질 세포는 바이오 안전성 레벨 2 (BSL-2), 적절한 봉쇄 및 폐기물 처리를 이용하시기 바랍니다으로 분류 된 유전자 변형 유기체BSL-2 층류 후드 아래 개인 보호 장비, 작업을 포함하여 조치.
4. 이글 MEM 배지에서 배양 116 세포는 10 % FBS 및 하이 그로 마이신 B (/ ㎖ 100 μg의)로 보충. (통로 10 이하) 씨 낮은 통로가 50 80 % 컨 플루 다음날에 도달 할 수 있도록 형질 전환 전에 60mm 조직 배양 접시 하루에 116 세포 (~ 0.4 10 ⁶ 세포).
5. 예컨대 칼슘 포스페이트 트랜 스펙 션 또는 기타 시판되는 형질 감염 시약 (도 3a)와 같은 방법을 사용하여 116 세포에 상기 단계 (2.1)에서 선형화 HCAdV 게놈 형질. 16 18 시간 후 형질 전환, 조심스럽게 셀 당 (합류 이후 HV AdNG163R-2 3 ⁴ 5 열 변환 장치를 적용 (TU)로 세포를 3 ㎖를 추가, 새로운 배지 (MEM, 5 % FBS)을 매체를 제거하고 감염 60mm 조직 배양 접시 ~ 3.2 10 ⁶ 세포 포함) HV의 ~ 1.6 10 ⁷ TU 추가 할 수 있습니다.
   1. 부드럽게에 감염 후 첫 한 시간 동안 요리마다 20 분을 이동동일 HV 분포를 확인합니다. 37 ° C에서 감염된 세포를 배양하고 5 % CO _2. 바이러스 복제에 의한 효율적인 바이러스 증폭 세포 변성 효과 (CPE)의 경우에는 관찰된다 (세포 반올림 느슨하게 연결된 또는 조직 배양 접시로부터 분리된다) 이후 infection.If CPE 관찰되는 48 시간 이전 HV의 양은해야 감소 될 수있다. CPE 나중에 시작되면, 더 헬퍼 바이러스가 사용되어야한다.
6. 배양액을 사용하여 배양 접시에서 세포를 세척하여 상등액 48 시간의 감염 후 세포를 수확 포함. 자신의 배지에 현탁 세포 통로 0 (P0)라고한다. 두 분수로 분할 P0.
   1. 분리 된 세포를 0.5 ml를 000 XG에서 3 분 동안 세포를 스핀 다운하고 세포 펠렛으로부터 매질을 제거으로부터 해당 나중에 증폭 과정 qPCR에 기초하여 분석 게놈 DNA (gDNA를)를 분리시키는 데에 사용된다. 추가 처리 할 때까지 -20 ℃에서 보관 세포 펠렛.
   2. 2.5에서분리 된 세포 ml의 자신의 매체 3-4 배에 재현 탁 된 세포를 (액체 질소 -80 ° C에서 또는에서) 동결 (37 ° C의 물을 욕조 실온에서 또는에서) 해동하여 바이러스 입자를 놓습니다. 이 부분은 P0의 호출 해물보다.
7. FBS (10 %)과 하이 그로 마이신 B (100 μg의 / ㎖) 및 HV 보충 MEM-매체를 이용하여 90 - 95 %의 포화 상태로 성장 (116) 세포와 그 조직 배양 접시를 확인 다음 계대 단계에 사용할 수 있습니다.
8. 60mm 조직 때문에 셀 (당 2 TU 적용 HV를 추가하고, 3.5 ㎖의 최종 부피로 선행 통로 (단계 2.6.2)로부터의 분해물의 2.5 ml의 신선한 매체 (MEM, 5 % FBS)의 1 ml에 섞어 90 - 95 %의 포화 상태에서 배양 접시가 ~ 3.2 10 ⁶ 세포 포함) HV의 ~ 6.4 배 (10) ⁶ TU 추가 할 수 있습니다. (그림 3B). 조심스럽게 116 세포 60mm 접시에서 배지를 제거하고 세포에 바이러스 혼합물을 추가한다. 단계를 반복 2.6) - 2.8) 두 번 패스의 해물을 얻기나이 P1과 P2.
9. ~ 포함 P2에서 해물의 2.5 ㎖로 17.5 ml의에게 신선한 미디어 (MEM, 5 % FBS)을 혼합하고 80 100 %의 포화 상태에서 150mm 조직 배양 접시 때문에 세포 (당 2 TU 적용 HV를 추가 배 (10) ⁽⁷⁾ 세포) ~ HV의 4 배 (10) ⁷ TU를 추가합니다. (116) 셀의 150mm 접시에서 매체를 제거하고 바이러스의 혼합물로 세포를 감염. 37 ° C에서 감염된 세포를 배양하고 5 % CO _2.
10. 같은 단계 2.6에 설명 된 48 시간 후 감염 수확 세포는) 유로 (P3) (그림 3B)을 얻었다.
    1. 단계를 반복 2.6) 1.
    2. 재현 탁 세포 P3 출시 바이러스 입자의 나머지 19.5 ml의에서 서너 번 동결 융해에 의한. 이 부분은 P3의 호출 해물보다.
       주 :이 충분히 증폭 될 때까지 일부 벡터는 결국 150mm 요리에 추가 구절이 필요할 수 있습니다. 따라서 사전 증폭 과정의 유효성은 직렬 패스 동안 모니터링 될 필요노화. (3) (또한도 4a 참조)에 설명 된대로 증폭 과정 qPCR에 기초하여 분석이 수행 될 수있다. 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대한 발현 카세트를 운반 HCAdV 사전 증폭 쉽게 형광 현미경 (도 4b)을 이용하여 GFP flourecscent 신호를 관찰함으로써 평가 될 수있다.

정량 실시간 PCR (qPCR에)를 사용하여 증폭 과정 3. 모니터링 (또한도 4a 참조).

1. 2.10) 배양 세포에서 gDNA를의 격리 또는 선택한 다른 방법 상업적 DNA 분리 키트를 사용하여 - preamplifaction (2.6 단계)의 각 통로에서 세포 펠렛에서 gDNA를 격리. 최적의 PCR 결과를 가능한 한 신선한로 gDNA를 사용합니다. 그렇지 gDNA를 추가로 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
2. 표준 곡선 10 ^(1)를 이용한 생성 qPCR의 분석에 의해 각각의 통로의 세포 내에 존재 HCAdV 게놈의 수를 결정하는 ^</ SUP> - 10 HCAdV 게놈에 포함 GOI 운반 플라스미드 ⁹ 사본.
3. HCAdV 게놈에 포함 된 GOI에 대한 특정 프라이머의 400 nm의를 사용하여 qPCR에 적용 P0- P3 (단계 2.6- 2.10)에서 gDNA를 같은 양을 분석합니다. 각각의 qPCR에 화학 물질의 qPCR의 추적 제조업체의 지침을 수행하십시오. 다음과 같이 qPCR에 프로그램을 설정합니다 미리 배양을 95 ℃에서 10 분, 10 초 동안 95 ° C의 40주기의 증폭, 15 초 동안 55- 60 ℃, 20 초, 72 ° C에 대해. 표준 곡선에 기초하여 상기 반응에서 HCAdV 게놈의 번호는 보간 될 수있다.

서스펜션의 성장 (116) 세포에서 HCAdV 벡터 4. 대규모 증폭

1. 3 리터 스피너 문화 플라스크 (그림 3B)에 10 % FBS와 하이 그로 마이신 B (100 ㎕ / ml)이 첨가 된 데워진 (37 ° C) 신선한 (MEM)의 900 ML을 추가합니다.
2. 1 적어도 10 개인 150mm 조직 배양 접시에서 매체를 제거(16) 세포를 90- 100 %의 컨 플루 언시로 성장하고 10 mL로 세포를 세척 신선한 예열 (37 ° C) MEM FBS (10 %) 및 ​​혈청 학적 피펫을 사용하여 하이 그로 마이신 B (100 ㎕ / ml)이 첨가. 최대 피펫 아래로 여러 번 균일 한 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 이미) 단계 4.1에서 900 ml에 포함 된 스피너 플라스크에 직접 세포를 전송합니다.
   참고 : 부정적인 서스펜션 세포의 성장에 영향을 미칠 수 있으므로 트립신 / EDTA를 사용하지 마십시오. 매체의 제거 후 즉시 스피너 플라스크에 세포를 전송합니다. 한 번에 두 개 이상의 조직 문화 요리를 취급하지 마십시오. 긴 대기 시간이 더 어려워 신선한 미디어를 첨가 한 후에는 조직 배양 접시에서 세포를 분리하는 것이다.
3. 37 ° C에서 24 시간 동안 조직 배양 인큐베이터에서 마그네틱 교반기에 최적 세포 성장 인큐베이션 스피너 플라스크를 보장하고, 5 % CO _2로. 유리 표면에 세포의 부착을 방지하기 위해 70 rpm으로 자석 교반기를 조정합니다.
4. 회 문화 플라스크에서 자란 세포가 생존 여부를 그들이 충분한 양을 증가 여부를 검토 회 문화 플라스크에 세포의 성장을 모니터링합니다. 60mm 조직 배양 접시에 생물 반응기에서 신선한 매체 전송 2 ml에 추가하기 전에 때마다. 현미경으로 세포 형태를 관찰한다.
   참고 : 배지에 떠있는 덩어리를 형성하는 세포가 최적의 성장과 생존을 (또한 그림 (c) 참조)을 나타냅니다. 24 시간 후 그들은 조직 배양 접시의 표면에 콜로니를 형성한다. 30 50 %의 합류는 최적의 밀도를 나타냅니다.
5. 24 시간 회 문화 플라스크를 설정 한 후 하이 그로 마이신 B (100 ㎕ / ml)이 첨가 된 새로운 미디어의 500 ㎖ (MEM, 10 % FBS)를 추가합니다. 24 시간 이상이 단계를 반복합니다.
6. 72 시간 회 문화를 설정 한 후, 세포 현탁액의 3 L의 총 부피의 결과로 하이 그로 마이신 B (100 ㎕ / ml)이 신선한 MEM 미디어 (10 % FBS)의 1,000 ml에 추가 할 수 있습니다.
7. 24 시간 AV에 도달 한 후실온에서 500 XG에 10 분 동안 원심 분리하여 삼리터, 수확 (116) 서스펜션 세포의 olume. 상층 액을 버린다. 조직 문화 후드 아래 비워 회 문화 플라스크를 유지합니다.
8. 신선한 MEM에 재현 탁 된 세포 펠릿 균질 세포 현탁액을 얻는 아래 약 8-10 배를 피펫 팅에 의해 5 % FBS로 보충. 매질의 부피는 단계 2.10) (2)로부터인지 해물에 의존한다. 1 (19.5 ㎖의 단계 4.8 참조). 옵션) 또는 단계 5.9에서 HCAdV의 정제 된 바이러스 주) 2. (바이러스 역가 depanding 여러 μL는 단계 4.8 참조) 2., 옵션 B) 세포의 감염을 위해 사용된다. 150 ml의 총 부피를 사용한다.
   1. 옵션은 : 멸균 자기 교반 막대 또는 250ML 작은 규모의 스피너 플라스크가 장착 된 250 ml의 저장 병에 P3 (주 증폭) 단계 4.8에서 전송 세포)에서 해물과 116 서스펜션 세포의 감염과 세포를 공동 감염 P3 (단계 2.10.2)과 셀 당 HV의 2 TU에서 해물 내에서 바이러스. 배의 밀도를 가정¹⁰⁵ ml의 세포 당, 총 세포 수는 9 배 10 ⁸ 세포이다. 따라서 HV의 1.8 배 (10) ⁽⁹⁾ TU를 추가합니다.
   2. 옵션 B는 : 정제 바이러스 재고 116 서스펜션 세포의 감염, 멸균 자기 교반 막대 또는 250ML 작은 규모의 스피너 플라스크가 장착 된 250 ml의 저장 병 단계 4.8에서 전송 세포) 100 바이러스 입자와 세포를 공동-감염 (단계 5.9에서) 이전에 정제 HCAdV 2의 세포 당.). 정제 HCAdV와 HV의 1.8 배 (10) ⁽⁹⁾ TU (6 단계 260 나노 미터에서 흡광도를 측정) 따라서 실제 역가에 따라 9 배 (10) ⁽¹⁰⁾ 부사장을 추가합니다.
9. 60 rpm에서 2 시간 동안 CO _2를 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 자석 교반기에 9월 4.8.1) 또는 4.8.2)에서 세포 바이러스 혼합물을 저어 5 %. 저장 병이 완전히 공기 순환 할 수 있도록 폐쇄되지 않았는지 확인합니다.
10. 2 시간의 후 감염은 3 리터 스피너 숭배에 다시 세포 바이러스 혼합물의 총 부피를 전송URE 플라스크 및 48 시간에서 37 ° C, 5 % CO _2에서 조직 배양 인큐베이터에서 2 L의 총 부피로 5 % FBS가 보충 된 신선한 예열 (37 ° C) MEM 미디어 1,850 mL를 추가하고 부화 70 RPM.
11. 500 ml의 원심 분리기 튜브에 실온에서 890x g에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확 세포. 배지를 제거하고 DPBS 28 mL의 총 부피에서 세포 펠렛을 재현 탁. 균일 한 세포 현탁액을 얻기 위해 아래 피펫합니다. 서스펜션이 완전히 고정되어 있는지 확인하고 액체 질소 또는 -80 ° C에서 세포 바이러스 현탁액을 동결. 바이러스 정화를 시작 할 때까지 -80 ° C에서 세포 바이러스 서스펜션을 저장합니다.

5. 정제 및 HCAdV의 투석

1. 세슘 클로라이드 (CSCL) 그라디언트 바이러스 해물을 준비 37 ° C의 네 배에 물을 욕조에 액체 질소와 해동 단계 4.11에서 세포 바이러스 서스펜션)를 고정합니다.
2. R에서 8 분 동안 500 XG에 바이러스 해물을 원심 분리기T와는 HCAdV을 포함하는 상층 액을 수집합니다.
3. 초 원심 분리, 그리고 31,25 G (1.35 g / cm ^3), 33.5 g (1.5 g / cm ³⁾ 협동 학습 해결책으로 follows.Weigh 37.5 g을 준비 (1.25 g ^/ ㎤) CSCL 분말 각각 채운다 DH ₂ O 25 ml의 최대.
   1. 솔루션까지 Stirr 명확하고 살균 필터에게 솔루션을하게된다. 마지막으로 각 솔루션 1 ㎖를 제거하고 밀도가 올바른지 어떠했는지를 확인하는 미세 규모에 무게. 1ml를 각각 1.5 g, 1.35 및 1.25 g의 무게를해야합니다.
   2. 농도가 너무 높으면 멸균 DH ₂ O. 작은 볼륨 (μL)을 첨가하여 단계적으로 조정 DH ₂ O를 첨가 한 후 다시 densitiy을 측정한다. 필요하면 더 DH ₂ O를 추가
   3. 밀도가 올 때까지 절차를 반복합니다. 농도가 너무 낮 으면 CSCL 분말을 소량 첨가하여 조정한다. 살균 필터는 다시 밀도를 확인합니다. 농도가 너무 높으면 애드하여 조정G DH 전술 한 바와 같이 ₂ O. 밀도는 여전히 너무 낮은 추가 MOR CSCL, 살균 필터를 다시 밀도를 확인됩니다. 밀도가 올 때까지 절차를 반복합니다.
4. 여섯 분명 초원 심 분리기 튜브에서 협동 학습 단계 구배를 준비합니다. 조심스럽게 천천히 다음과 같은 순서로 사용하여 튜브에 협동 학습 솔루션을 피펫 : 1.5 0.5 ml의 g ^/ ㎤ 협동 학습 솔루션, 1.35의 3 ㎖ g ^/ ㎤ 협동 학습 솔루션과 1.25의 3.5 ml의 g ^/ ㎤ 협동 학습 솔루션 (그림 2C) .
5. 오버레이 ~ 1.25 g ^/ ㎤ CSCL 층의 상단에 단계 5.2에서 지워 벡터 상층 액의 4.5 ㎖). 원심 분리기 빈 입자와 세포에서 바이러스 입자를 포함하는 별도의 HCAdV 게놈에 느린 가속과 감속 226,000 XG (35,000 RPM)에서 최소 2 시간 동안 12 ℃에서 회 전자 (SW-41) 스윙을 사용하여 초 원심 분리기에서 그라디언트 부스러기.
   참고 : 위에 세포 파편 FORMES의 최적의 조건에서 확산 대역튜브. 두 아래의 흰색 띠가 관찰 할 수있다. 낮은 밴드 HCAdV (도 2C 및 5A)를 동일 반면 상위 대역은 빈 입자를 포함하고 있습니다.
6. 신중 세포 파편 및 빈 입자의 층을 분리하고 50 ㎖ 멸균 된 튜브에 깨끗한 피펫 팁 각 튜브 및 전사 바이러스로부터 낮은 대역 1 ㎖를 수집한다. G 수집 된 바이러스 입자 ^/ ㎤ 협동 학습 솔루션을 조심스럽게 혼합 1.35 24 ml의 최대 추가합니다.
7. 1.35 g / ㎤ 초 원심 분리기에서 12 ° C에서 226,000 XG (35,000 RPM)에서 상단과 원심 분리기 O / N (18 20 시간) ³ CSCL 바이러스 솔루션 로터 스윙을 사용하여 (SW-41 원심 분리기 튜브를 입력 ) 느린 가속 및 감속.
8. 눈에 띄는 낮은 대역에 존재하는 HCAdV를 수집합니다. 잠재적 인 위 밴드가 비어 입자가 피펫을 사용하여 위에서 상위 계층을 제거 포함으로 그런 다음 하단 밴드 USI를 빼앗아 (도 2C 및도 5b 참조)피펫을 겨.
9. 완충액 교환 수집 바이러스 입자를 투석.
   1. 길이가 약 8cm의 3 회 살균 DH ₂ O로 씻어 : 투석 튜브 (50,000 MWCO)의 스트립을 잘라. 그런 다음 플라스틱 클램프 투석 튜브의 한쪽을 닫고 1-ML 피펫을 사용하여 튜브로) 단계 5.8에서 수집 된 바이러스를 전송합니다. 튜브 내의 공기 방울을 피하고 플라스틱 클램프 투석 폐쇄와 반대편에 닫습니다.
   2. 4 ° Cwith 천천히 교반에서 2 시간 동안 투석 완충액 (10 mM 트리스 - 염산 (PH 7.5), 10 % 글리세롤 및 탈 H ₂ O 1 mM의의 MgCl ₂₎ 1L의 투석에. 2 투석 버퍼의 L 천천히 교반하면서 4 ° C에서 O / N을 투석과의 교류 투석 버퍼입니다. 또한 sucrosebuffer (140 mM의 염화나트륨, 5 mM의 나 ₂ HPO ₄ x2H ₂ O, 1.5 mM의 KH ₂ PO _4, 730 MM의 자당, 산도 7.8)를 사용합니다.
   3. 단계 5.9) 2에서 투석 바이러스 입자를 수집합니다. 1 ml의 피를 사용하여ipette. 원하는 소량 (25 ~ 100 μL)의 여러 분취 량을 준비하고 -80 ° C에서 정제 된 바이러스를 저장합니다.

6. 측정 광학 밀도의 최종 HCAdV의 준비의 물리적 역가 (OD)

1. 용해 완충액 (10 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.5) 475 μL와 단계 5.9) (2)에서 최종 벡터 제제의 25 μL 희석 된 10 mM EDTA (PH 8.0), 0.5 % SDS))는 부드럽게 20 분으로 흔들어 RT 및 최종적 15,000 × g으로 실온에서 2 분 동안 원심 분리.
2. 260 나노 미터 (A260)에서의 흡광도 값이 낮은 보통이므로, 상청액 100 μL를 사용하여 흡광도를 네 번 측정하고 네 개의 측정 값의 평균을 계산한다. 다음 식을 사용 mL의 바이러스 입자의 수를 (VP / ㎖ ^-1) 계산 : KB에서 VP / ㎖ ^-1 = (A260 평균) X (20) × (1.1 × ^10-12) × (36킬로바이트 / HCAdV 크기 ).
   주 : 절대 바이러스 입자 (OD 역가)의 전형적인 수율의 결과를도 7a에 나타낸다 . 경험 OD 역가 바이러스 입자의 수​​를 과대 평가 것을 보여준다. (OD)에 의해 측정 된 절대 바이러스 입자는 Q-PCR로 측정 감염성 바이러스 입자보다 100 배 높은 20이 될 수 있습니다. 보다 정확한 absolte 감염성 HCAdV 입자의 측정뿐만 아니라 HV 오염의 경우 Q-PCR은 7 절을 참조하십시오.

7. 총 입자, qPCR에 의한 최종 벡터 준비에 HCAdV과 HV 오염 수준의 감염성 단위 측정합니다. 적정 절차의 방식은 그림 6에 표시됩니다

1. 6 또는 12 웰 조직 배양 플레이트에 시드 HEK293 세포가되도록 세포를 다음날에 90 % 포화 상태에 도달한다. 감염성 바이러스 입자의 수​​ (전염성 역가)을 결정하기 위해, 1 ㎕의 단계 5.9로부터의 정제 된 바이러스를 10 μL와 제 2 웰)로 다중 - 웰 플레이트에 웰 하나의 세포를 감염 3.
2. 수확 세포 3 시간 게시물 감염. 매체 제거하고 전체 잘 다루 트립신을 추가하고 3 부화7 ° C와 5 %의 5 분 CO _2. 피펫을 사용하여 트립신으로 세포를 세척하고 실온에서 3 분 동안 890 XG에서 세포를 스핀 다운.
3. DPBS 200 μL의 펠렛 세포를 재현 탁하고 무료 (비 감염성) 벡터 입자를 제거하기 위해 철저히 씻는다. 실온에서 890 XG에 3 분 동안 원심 분리기. 신선한 DPBS 200 μL에 뜨는에 resuspend 세포 펠렛을 폐기하십시오.
   참고 : 감염 역가의 정확한 결정의 경우, 치료 및 철저한 세척 트립신 세포 표면에서 모든 비 감염성 바이러스 입자를 제거하기 위해 매우 중요합니다.
4. 전체 바이러스 입자 수 (감염성 입자 및 비 감염성 입자 = 실제 역가)을 확인하려면, 수확은 그들의 문화 매체는 피펫을 사용하여 세포를 세척하여 트립신없이 두 우물에서 HEK293 세포를 감염되지 않은.
5. RT에서 890 XG에서 3 분 동안 세포를 스핀 다운. 매체를 취소하고 DPBS 200 μL에 펠렛 세포를 재현 탁. 스와bsequently 각각 직접 세포에 1 μL 정제 HCAdV 준비 10 μl를 추가합니다. gDNA를 분리 이후 Q-PCR에 대해 동일한 조건을 보장하기 위해, 배경과 같은 비 감염된 세포를 사용한다.
6. HEK293 단계 7.3에서 파생 된 세포) 7.5에서 gDNA를 격리)
   1. DPBS 3 초 동안 (단계 7.3 및 7.4), 200 μL에 재현 탁 소용돌이 세포는 SDS 용액 200 μl를 추가합니다. (10 mM 트리스 - 염산 (PH 7.5), 10 mM의 EDTA (PH 8.0), 0.5 % SDS)와 프로 테이나 제 K 20 ㎕를 (20 ㎎ / ㎖) 및 와류 현탁액 3 초. 55 ° C에서 12 (16) 시간을 품어 천천히 흔들. 그때의 RNAse 2 μL (20 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
   2. 15,000 X g에서 2 분 동안 이소 아밀 알코올과 원심 분리기 : 클로로포름 : 페놀의 350 μl를 추가합니다. 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 한 번이 단계를 반복합니다
   3. 새로운 튜브에 상청을 전송 초산 나트륨 50 μL (PH 5, 3 M) 및 1 ml의 빙 감기를 EtOH (99.8 %)를 첨가하고, 현탁액을 혼합한다. 원심 펌프15,000 XG에 10 분 동안 fuge 샘플은 게놈 DNA를 펠렛.
   4. 이어서, 상등액을 제거 15,000 x g에서 2 분 동안 70 %의 EtOH 500 ㎕의 원심 분리를 추가한다. , 뜨는을 제거 70 %의 EtOH 500 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 흔들어. 그리고 15,000 X g에서 2 분 동안 원심 분리.
   5. 뜨는 공기 건조 DNA 펠렛을 제거합니다. 이 용액을 gDNA를 얻기 어렵게되는 바와 같이, 장시간 건조하지 DNA 펠렛을한다. DH ₂ O의 120 μL의 DNA 펠렛을 재현 탁 떨고 동안 37 ℃에서 ~ 1 시간 동안 배양한다. DNA 용액이 점성이 나타나는 경우, 37 ℃에서 몇 시간 동안 흔들어, 또는 ~ 1 시간 동안 55 ° C에서 품어.
7. HCAdV 게놈에 포함 GOI 운반 플라스미드 10 카피 ⁸ - 감염성 HCAdV 입자 절대 HCAdV 입자를 결정하기 위해, 10 ^(1)의 표준 곡선을 생성한다.
8. 감염된 HEK293 (C)의 gDNA를 동일한 양을 분석함으로써 전체 입자 및 감염성 입자를 결정할단계 7.3) 및 7.4)에서 ELL 학생은 qPCR에가 HCAdV 게놈에 포함 된 GOI에 대한 특정 프라이머의 400 nm의를 사용하여 적용 할 수 있습니다.
9. 다음과 같이 PCR 프로그램을 설정합니다 미리 배양을 95 ℃에서 10 분, 증폭을 위해 10 초 동안 95 ° C의 40주기, 10 초, 55 ℃, 20 초, 72 ° C에서. 표준 곡선 (단계 7.7)에 기초하여, 반응의 아데노 바이러스 게놈 수를 보간.
10. 다음 formular를 사용하여 최종 벡터 준비 아데노 바이러스 게놈의 수를 계산한다 (HCAdV / 무게의 수를 반응에 gDNA를의 NG에) × (μL에 무게를 모든 세포의 DNA의 NG에 감염된 접시에 / 볼륨 바이러스) .
    참고 : 절대 및 감염성 바이러스 입자 수익률의 일반적인 범위는 1 × ⁷ -1x10 ⁸ 바이러스 입자 / μL 주위. 여기서 보여보다 10 배는 더 높거나 더 낮은 역가가 정상으로 간주 할 수있다. 높은 역가가 개선 될 것이다. 절대 HCAdV의 partic의 비율에 대하여레 전염성 HCAdV 입자에, 경험은 절대 HCAdV 입자의 약 5-10 %의 감염 (그림 7A) 것을 보여준다.
11. HV와 오염 수준을 결정하기 위해, HV 게놈에 존재하는 유전자가 아데노 바이러스 후기 3 (L3)의 부분을 증폭함으로써 qPCR을 수행. 표준 곡선 (단계 7.7)을 생성하는 아데노 바이러스 후기 유전자 3 (L3)을 운반하는 플라스미드를 사용한다.
12. 이 반응에서 프라이머 L3 400 nm의 적용 순방향 5'-AGA AGC TTA TCC GCA GTT ACT CGA GTT GG-3 '와 L3 역방향 5'-ATA GTT CAT AGC TTG CAG GGT ATG GAT GG-3'와 함께 내지 300nm L3 특정 프로브의 5'-식구-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-탐라-3 '.
13. 다음과 같이 PCR 프로그램을 설정 사전 인큐베이션 / 활성화를 95 ° C에서 10 분, 증폭을 위해 15 초 1 분 동안 60 ° C, 95 ° C, 40 사이클 동안. PCR은 qPCR에 반응에 mastermix 어떤 보편적 인 프로브를 사용합니다. 표준 곡선 (단계 7.7)에 기초하여, In의 수를 계산최종 벡터 준비 fectious HV 입자. HV 입자의 전형적인 수율에 대한 (그림 7A)를 참조하십시오.
14. 마지막 벡터 제제의 품질을 평가하는 HV 오염 수준 HCAdV 절대 감염성 입자의 비율을 계산한다.
    참고 : 지금 남아있는 HV의 작은 부분을 배제 할 수 없습니다 때까지. 일반적 HV 오염의 비율은 허용 감염성 입자 이하인 ~ 5 %, (도 7b)이다. 가능한 한 적은 HV 바람직하다 물론 같이 벡터 제제는 동물 실험으로 사용하는 경우에는 특히.

결과

복제, 증폭 및 HCAdV 준비 정화용 여기에 대표적인 예는 표시됩니다. 효소 소화 제한에 의해 복제 전략의 개요 (그림 1)과 복제에 대한 대표적인 예와 HCAdV 게놈의 릴리스는 (그림 2)이 제공된다. 소화 나는 PI- SceI 제한 I 및 I-CEU에 의해 pHM5에서 GOI-발현 카세트 및 후속 페놀 - 클로로포름 추출 및 EtOH로 침전의 출시 후 일반적인 제한 패턴 <...

토론

여기에 제시된 프로토콜은 전술 한 절차에 기초 ^4,12 인간 아데노 바이러스 형 5에 기초 HCAdV 벡터들의 정화를 허용한다. pAdFTC 플라스미드 내의 HCAdV 게놈은 모든 아데노 바이러스 유전자의 결여 만 5'- 및 3'- LTR에 및 포장 신호를 전달한다. 이 전략에서 HV AdNG163R-2 ^(4)는 트랜스 효율적인 바이러스 생산에 필요한 모든 유전자를 제공한다. 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 기...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	restriction digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restriction digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	selection of CRE expressing 116 cells
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 cell culture medium
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle	Sigma	CLS430281-24EA	infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask	Bellco	1965-61030	growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes	Beckmann Coulter	344059	density gradient centrifugation
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes	Thermo	66383	dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305	tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 touch	Biorad		qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carl Roth	A156.1	purification of DNA
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	density gradient centrifugation
sodium acetate 99%	Carl Roth	6773.2	DNA precipitation
LB medium	Carl Roth	X968.3	bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure	Carl Roth	9065.5	DNA precipitation and washing
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	lysis  buffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	lysis  buffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	dialysis buffer
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	dialysis buffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional dialysis buffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional dialysis buffer
sucrose	Carl Roth	9286.1	optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	optional dialysis buffer
1.5-ml tubes	sarstedt	72,730,005	storage of virus preparations at -80 °C