Клонирование и крупномасштабное производство высокопроизводительного аденовирусные векторы на основе типа аденовируса человека 5

Резюме

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Аннотация

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

Введение

Для терапевтического применения генных это имеет большое значение, чтобы избежать цитотоксические и иммуногенные побочных эффектов, вызванных экспрессии вирусных белков, самой трансгена или на входящих вирусных белков. Аденовирусные векторы (ADV) широко используются для введения чужеродной ДНК в самых разнообразных клетках, чтобы исследовать воздействие трансгенной экспрессии ^1,2. Наиболее продвинутая версия ADV представлена ​​высокопроизводительных аденовирусных векторов (HCAdV), лишенных все вирусные кодирующие последовательности ^3,4, и тем самым, предлагающих емкость упаковки до 35 кб в сочетании с низкой иммуногенности и низкой токсичностью ^5-8. Из-за их высокой вместимости тары они позволяют доставки больших или нескольких трансгенов с помощью одного вектора дозу. Таким образом, они представляют собой ценный инструмент для научного сообщества.

В отличие от первого или второго поколения AdV хватает ранних генов Е1 и / или Е3, которые могут быть легко получены с использованием коммерческих наборов, VECTor строительство генома вируса и производство HCAdV является более сложным. Система для строительства HCAdV геномов на основе плазмиды, несущей pAdFTC HCAdV геном, лишенный всех вирусных кодирующих последовательностей и трансфер плазмиды pHM5 ^9-12. Любой интерес ген до 14 килограмм базами (кб) может быть клонирован в вектор трансфер pHM5, в котором сайт множественного клонирования в окружении признания / рассекая сайты самонаведения эндонуклеаз Пи сю I и I-Сеу I. Таким образом, клонированный ген интереса может быть выпущен подряд PI-сю I и I-I Céu переваривает для последующего направленного вставки в тех же сайтов рестрикции, присутствующих в геноме HCAdV, содержащейся в плазмиде pAdFTC. В pAdFTC сайт трансгенной инсерции расположен между PI-сю I и I-я Céu сайты расщепления в окружении извитости ДНК и некодирующих последовательностей аденовирусных, необходимых для генома упаковки, такие как 5 'и 3' инвертированные концевые повторы (СПУ)на обоих концах и упаковочной сигнала ниже по потоку от 5'ITR. Дополнительное извитости ДНК обеспечивает оптимальную размер конечного HCAdV генома в пределах от 27 до 36 кб, чтобы обеспечить эффективную упаковку в процессе производства вируса. Так pAdFTC большой плазмиды до 45 кб (в зависимости от размера вставленного трансгена) и использование наведения эндонуклеаз со сравнительно сайтов ДНК длиной распознавания проявляет сильное к ДНК, несколько шагов очистки необходимы во время передачи трансгена от pHM5 чтобы pAdFTC. Осторожное обращение избежать сдвига силы рекомендуется.

РМЭ о HCAdV генома в окружении я не сайтов рестрикции распознавания, расположенных непосредственно перед 5'ITR и ниже по течению от 3'ITR ^12. Таким образом, HCAdV может быть освобожден от Not I переварить для последующего трансфекции вирусного генома в HCAdV производителем клеточной линии. Обратите внимание, что использование фермента рестрикции Not I для отнпростота вирусного генома из плазмиды pAdFTC означает, что вставлен трансген лишена сайтов узнавания не я ДНК. Клеток-продуцентов НЕК293 клеток, основанные (116 клеток) стабильно выразить Cre рекомбиназу. Для амплификации вируса клетки 116 с сочетанной инфекцией вируса-помощника (HV), обеспечивающей все гены, необходимые для ADV репликации и упаковки в транс ^3,4. Гибридного является первым поколения AdV с floxed упаковки сигнал, который удаляется во амплификации вируса по Cre рекомбиназой выраженной в 116 клеток ^4. Это гарантирует, что преимущественно HCAdV геномы, содержащие целостности упаковки сигнала encapsidated.

Предварительно усиление HCAdV выполняется путем проведения последовательных шагов пассирования в 116 клетки, выращенные на поверхности в культуре ткани блюд. После каждого прохода вирусные частицы высвобождаются из инфицированных клеток путем проведения трех последовательных шагов замораживания-оттаивания. С каждым прохождение большее число клеток, инфицированных1/3 из клеточного лизата из предыдущего прохода. Наконец лизата с последней стадии предварительной амплификации используют для инфицирования клеток-продуцентов выращивают в суспензии в вращаемой колбе при больших масштабах амплификации. Вирионы очищали из клеток суспензии, выполняя ультрацентрифугирования в цезия плотности хлорида градиента ^4,12. С помощью этой процедуры пустые частицы и полностью собранные частицы делятся на два различных диапазонах. Для дальнейшего сосредоточить HCAdV частиц второй без постепенного шаг ультрацентрифугирование выполняется. Впоследствии в результате полосу, содержащую HCAdV собирают и диализуют против физиологическом буфере. Конечный вектор препараты характеризуются относительно числа абсолютных вирусных частиц, инфекционных частиц и уровня загрязнения HV. Абсолютные вирусные частицы могут быть определены путем лизиса вирусных частиц и измерением оптической плотности при 260 нм или при выполнении количественный ПЦР в реальном времени ^(КПЦР) 12. Инфекционность Пурвирусные частицы маньяков может быть определена путем измерения КПЦР HCAdV геномов, присутствующих в инфицированных клетках 3 ч после инфицирования.

протокол

1. Конструирование рекомбинантных геномов HCAdV на основе плазмиды pAdFTC

Примечание: Все плазмиды были описаны ранее ^11,12 и доступны по запросу. Процедура клонирования схематически показано на фиг.1.

1. Клонирование гена интереса (ГОИ) в том числе и промоутер сигнал полиаденилирования (рА) в шаттле плазмиды pHM5, используя стратегию клонирования выбора, чтобы произвести pHM5-ГОИ.
   Примечание: С pAdFTC является относительно большой плазмиды, классические протоколы плазмидной ДНК рекомендуется, чтобы избежать sheering плазмидной ДНК с помощью коммерческих наборов очистки плазмидной, основанные на силикагеле, мембран. I-я Ceu П.И. -Sce я сильно связываются с ДНК и изменить электрофоретической подвижности переваренной ДНК. Таким образом, извлечение фенола и хлороформа EtOH осадков (шаг 1.3) необходимо до электрофореза в агарозном геле.
2. Дайджест 20 мкг PHM5-ПИ и 10 мкг pAdFTC от I-CeuI (10 U) в течение 3 часов при 37 ° С в общем объеме 100 мкл для линеаризации плазмиды (~ 2,8 т.п.н. + ПИ ORF последовательность и ~ 31kb, соответственно).
3. Очищают линеаризованные плазмиды с использованием экстракции фенол-хлороформ с последующей этанола (EtOH) осаждения ^13.
   1. Добавить 100 мкл фенола: хлороформ: изоамиловый спирт и аккуратно перемешать с помощью переворачивания пробирки несколько раз. Центрифуга в течение 2 мин при 15000 х г в.
   2. Передача супернатант в новую пробирку, добавить 20 мкл ацетата натрия (рН 5, 3 м) и 400 мкл охлажденного льдом этанола (99,8%) и смешивают подвески энергично. Центрифуга течение 10 мин при 15000 х г в.
   3. Удалить супернатант, добавить 300 мкл 70% этанола и центрифугируют в течение 2 мин при 15000 х г в. Затем снимите супернатант и сухой воздух осадок ДНК. Растворите таблетку в 10- 20 мкл ЦТ _{2 O.} Не сушите шарик ДНК слишком долго, как это будет труднее получить ДНК в растворе.
4. Дайджест I-Ceu я -digested pHM5-ГОИ и pAdFTC плазмиды со стадии 1.3), по крайней мере 3 часа или O / N с рестриктазы PI -Sce I (10 U) при 37 ° С в общем объеме 50 мкл, а затем очистить I -CeuI П.И. -Sce я переваривается плазмиды, используя добычу фенол-хлороформ с последующим осаждением этанола (см шаг 1,3). Растворите ДНК в 20 мкл нуклеазы свободной _дН 2 O.
5. Отдельная pHM5 плазмиды костяк (2,8 кб) и ГОИ (с шага 1.4) на препаративной агарозном геле и гель-очищения ГОИ, используя коммерческий гель-ПЦР и комплект очистки. Представитель агарозном геле дайджеста показано на рисунке 2А.
6. Дефосфорилировать I- Ceu я П. И. -Sce I-переваривается pAdFTC (с шага 1.4) с щелочной фосфатазой кишечника теленка (CIP 10 U) в течение 1 ч при 37 ° С в общем объеме 25 мкл и очистить дефосфорилируется плазмиды pAdFTC экстракцией фенол-хлороформ и последующей EtOH прecipitation (шаг 1.3). Элюции ДНК в 20 мкл нуклеазы свободной _дН 2 O.
7. Выполнение гель-электрофореза аналитическую из аликвоты дефосфорилированного pAdFTC плазмиды (со стадии 1.6), и очищенный ГОИ-фрагмента (со стадии 1.5), чтобы проанализировать дайджесты ли полное и размеры ожидаемых фрагментов верны (~ 31 Кб для линеаризованной pAdFTC ).
   Примечание: Размер ГОИ варьируется в зависимости от размера кластера экспрессии трансгена. Оценить относительную концентрацию соответствующих фрагментов для последующего лигирования. Представитель агарозном геле очищенных фрагментов показан на фиг.2В.
8. Настройка реакции лигирования в общем объеме 20 мкл с использованием лигазы 400 ед Т4 ДНК и молярное соотношение вектора для вставки 1: 3.
   Примечание: по согласованию с агарозном геле, показанной на фиг.2В, мы обычно лигируют в общем объеме 20 мкл с 2 до 6-мкл вектора, от 8 до 12 мклвставлять и 400 ед ДНК-лигазы Т4. При увеличении концентрации ДНК, как правило, с низким после нескольких шагов обработка карболовой кислотой, использовать столько ДНК, сколько возможно, так что никакого дополнительного _H 2 O не должен быть добавлен, чтобы достичь конечный объем 20 мкл. Перевязывать при 16 ° CO / N, а затем выполнять извлечение фенол-хлороформ с последующим осаждением этанола (этап 1.3).
   1. Элюции ДНК в 15 мкл нуклеазы свободной дН _{2 O} и переварить очищенного реакции лигирования с помощью фермента рестрикции SwaI (10 U) в течение 2 ч при 25 ° С в общем объеме 20 мкл. Затем сконцентрироваться и очистить ДНК, выполняя извлечение фенол-хлороформ с последующим осаждением этанола (этап 1.3). Элюции ДНК в 10 мкл нуклеазы свободной _дН 2 O.
9. Преобразование 2 мкл очищенной SWA переваренного продукт лигирования путем электропорации в DH10B или DH5 & alpha; Электрокомпетентные E. палочка и отбора клонов в течение 16 до 24 часов при 37 ° С на ампициллин-LB, содержащейПластины (50 мг / мл ампициллина). Выбор 5- 10 клонов и подготовить мини-препараты плазмидной ДНК с помощью щелочного лизиса с последующей экстракцией фенол-хлороформ и последующей EtOH осадков (шаг 1,3) ^13.
10. Выполнение аналитический дайджест плазмиды мини-препаратов с последующим электрофорезом в агарозном геле, чтобы проверить размер фрагментов ДНК. Предлагаемые ферменты рестрикции например I-Ceu я и PI-сю я выпуская вставку, SPE I или II Hinc (рис 2С).
11. Амплификации клона правильное в ампициллин, содержащий LB среде (50 мг / мл ампициллина) и выполнить Миди или Макси-плазмиду, используя любой препарат коммерчески доступного набора для очистки плазмид.

2. Выпуск HCAdV-геномов из pAdFTC плазмиды и предварительное усиление HCAdV векторы в клеточной линии 116 Производитель

1. Дайджест 20 мкг pAdFTC основе аденовируса производства плазмиды, содержащей клонированную ГОИ с шага 1.11) вобщий объем 100 мкл с помощью Not I (20 ЕД) при 37 ° С в течение 2 ч> и выполнять экстракции фенолом и хлороформом два раза с последующим осаждением EtOH. Растворите в 20-ти 30 мкл стерильной дН ₂ O.
2. Проверьте аликвоту разбавленного 1:10 переваренной pAdFTC-ГОИ-ДНК гель-электрофореза. A 9 кб фрагмент плазмиды для позвоночника и, в зависимости от размера ГОИ, второй ДНК-фрагмента для HCAdV генома (размер: 28- 36 Кб) можно обнаружить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Представитель пример я не дайджеста отображается на рисунке 2D. Линеаризованная ДНК можно хранить в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или при -20 ° С в течение нескольких недель.
3. Прежде чем приступить к протоколу, убедитесь, что помощник вирус AdNG163R-2 был усилен ^4.
   Примечание: Клетки, трансфицированные pAdFTC получены HCAdV векторов генетически модифицированные организмы, классифицируемые как уровень биологической безопасности 2 (BSL-2), пожалуйста, используйте правильную локализации и обращения с отходамимеры, включая средства индивидуальной защиты, и работы в рамках BSL-2 капюшонами ламинарного потока.
4. Культура клеток в 116 MEM Дульбекко среде с добавлением 10% FBS и гигромицину B (100 мкг / мл). Семя низкий проход (ниже канал 10) 116 клеток (~ 0.4x 10 ^{6 клеток)} в 60 мм блюдо культуры ткани за один день до трансфекции, чтобы они достигают 50- 80% слияния на следующий день.
5. Трансфекции геном линеаризованной HCAdV со стадии (2.1) в 116 клетках с помощью методов, таких как фосфат кальция трансфекции или других коммерчески доступных реагентов трансфекции (фиг.3А). 16 18 ч после трансфекции, осторожно снимите среду, добавить 3 мл свежей среды (MEM, 5% FBS) и инфицировать клетки с HV AdNG163R-2 ⁴ 5 применяющие преобразующие единиц (ТУ) на ячейку (поскольку сливной 60 мм тканевой культуры блюдо содержит ~ 3,2 • X 10 ^{6 клеток,} добавить ~ 1,6 10 ⁷ ТУ ВН).
   1. Аккуратно переместите блюду каждые 20 минут в течение первого часа после заражения вобеспечить равномерное распределение HV. Выращивают инфицированные клетки при 37 ° С и 5% СО _2. В случае эффективного влияния вируса усиления цитопатического (CPE), вызванных вирусом репликации (клетки округляются и свободно прикреплены или отдельно от ткани блюдо культуры) наблюдаема 48 ч наблюдается после infection.If CPE ранее количество HV должен быть снижена. Если CPE начинается позже, более помощник вирус должен быть использован.
6. Урожай клетки, включая надосадочной 48 ч после инфекции путем промывки от клеток от культуральной чашки с помощью культуральной среды. Клетки, которые суспендируют в их культуральную среду называют прохода 0 (P0). Сплит Р0 на две фракции.
   1. Из 0,5 мл клеток отдельных спином вниз клетки в течение 3 мин при 2000 х г и удалить носитель из клеточного осадка, который затем используется для выделения геномной ДНК (GDNA) для основе КПЦР анализа процесса амплификации. Магазин клеточные осадки при -20 ° С до дальнейшей обработки.
   2. От 2,5мл обособленных клетки высвобождают вирусные частицы путем замораживания (при -80 ° С или в жидком азоте) и оттаивания (при комнатной температуре или в водяной бане при 37 °) клетки, которые resupended в их средней три-четыре раза. Эта фракция, чем называемой лизата P0.
7. Обеспечить, чтобы культуры тканей блюда с 116 клеток, которые выращивали до 90- 95% слияния с помощью MEM-среду, дополненную FBS (10%) и к гигромицину B (100 мкг / мл) и HV доступны для следующих этапов пассирования.
8. Смешайте 1 мл свежей среды (MEM, 5% FBS) с 2,5 мл лизата из предыдущего прохода (этап 2.6.2) до конечного объема 3,5 мл, добавляют ВН применяя 2 ТУ на клетку (с 60 мм ткани культура блюдо на слияния в 90- 95% содержит 3,2 • X ~ 10 ^{6 клеток,} добавить ~ 6.4x 10 ⁶ ТУ ВН). (3В). Тщательно удалить носитель из 60 мм чашку 116 клеток и добавить вирусную смесь с клетками. Повторите шаг 2.6) - 2.8) два раза, чтобы получить лизаты проходвозраст P1 и P2.
9. Смешайте 17,5 мл свежей среды (MEM, 5% FBS) с 2,5 мл лизата от P2 и добавить HV применяя 2 ТУ на клетку (с 150 мм блюдо культуры ткани при сплошности из 80- 100%, содержит ~ 10 ⁷ 2x Клетки, добавить ~ 4x 10 ⁷ ТУ ВЛ). Удалить среду из 150 мм блюдо 116 клеток и инфицировать клетки с вирусной смеси. Выращивают инфицированные клетки при 37 ° С и 5% СО _2.
10. 48ч после заражения урожая клетки, как описано в шаге 2.6), чтобы получить проход Р3 (рис 3B).
    1. Повторите шаг 2.6) 1.
    2. Из оставшихся 19,5 мл Р3 выпуска вирусных частиц из клеток resupended замораживания и оттаивания три-четыре раза. Эта фракция, чем называемого лизата P3.
       Примечание: Некоторые векторы в конечном итоге могут потребоваться дополнительные проходы в 150 мм чашки, пока они не усиливаются в достаточной степени. Поэтому Effectivity процесса предварительного усиления необходимо контролировать во время серийного проходстарения. КПЦР основе анализа процесса усиления может быть выполнена, как описано в разделе 3 (смотри также рисунок 4А). Предварительно усиление HCAdV несущий экспрессионную кассету для зеленого флуоресцентного белка (GFP) может быть легко оценена путем наблюдения flourecscent сигнал GFP с помощью флуоресцентного микроскопа (фиг.4В).

3. Мониторинг процесса амплификации с использованием количественно-ПЦР в реальном времени (КПЦР) (см также рис 4А).

1. Изолировать GDNA из осадков клеток из каждого прохода preamplifaction (шаги 2.6) - 2.10), используя любой коммерческий набор для выделения ДНК изоляции гДНК из культивируемых клеток или другой метод выбора. Для получения оптимальных результатов ПЦР использовать GDNA как свежие, как это возможно. В противном случае гДНК можно хранить при -20 ° С до дальнейшего использования.
2. Чтобы определить количество HCAdV геномов в клетках соответствующего прохода по анализу КПЦР получения стандартной кривой, используя 10 ^{1 <}/ SUP> - 10 ⁹ копий плазмиды, несущей ГОИ, содержащиеся в HCAdV генома.
3. Анализ же количество гДНК от P0- P3 (шаг 2.6- 2.10) нанесение КПЦР с использованием 400 нМ праймеров, специфичных для ГОИ, содержащихся в HCAdV генома. Для проведения количественной ПЦР инструкции следовать производителя о соответствующих химических веществ КПЦР. Установите программу КПЦР следующим образом: предварительно инкубации при 95 ° С в течение 10 мин, усиления в 40 циклов при 95 ° С в течение 10 с, 55-60 ° С в течение 15 с и 72 ° С в течение 20 сек. На основании стандартной кривой количество HCAdV геномов в реакции, может быть интерполирован.

4. Крупномасштабная Усиление HCAdV векторы в 116 клеток, выращиваемых в суспензии

1. Добавить 900 мл предварительно нагретой (37 ° C) свежего MEM с добавлением 10% FBS и гигромицину B (100 мкг / мл) в 3 л колбе счетчик культуры (фиг.3В).
2. Удалить среду, по крайней мере 10 отдельных 150 мм чашках для тканевых культур с 116 клетки, выращенные на 90- сплошности из 100% и очистить от клеток с 10 мл свежего подогретого (37 ° С) МЕМ с добавлением FBS (10%) и к гигромицину B (100 мкг / мл) с помощью пипетки серологические. Внесите вверх и вниз несколько раз, чтобы получить однородную суспензию клеток. Перевести клеток непосредственно во вращающуюся колбу, уже содержащего 900 мл из шага 4.1).
   Примечание: Не используйте трипсин / ЭДТА, как это может негативно повлиять на рост клеток суспензии. После удаления среды немедленно передать клеток в вращаемой колбе. Не обрабатывать более двух чашках для тканевых культур одновременно. Чем дольше время ожидания после добавления свежей среды, тем труднее будет отдельно клеток от блюдо культуры ткани.
3. Для обеспечения оптимального роста клеток Инкубировать вращающийс сосуд на магнитную мешалку в культуральной инкубаторе ткани в течение 24 ч при 37 ° С и 5% СО _2. Регулировка магнитной мешалки до 70 оборотов в минуту, чтобы избежать прикрепление клеток к поверхности стекла.
4. Монитор рост клеток во вращающихся культуры колбу изучить ли клетки, выращенные в счетчик культуры колбу жизнеспособны и расти ли они достаточном количестве. Каждый раз перед добавлением свежей среды Transfer 2 мл из биореактора к 60 мм блюдо культуры ткани. Заметим, морфологии клеток под микроскопом.
   Примечание: клеток, образующих комки, плавающие в культуральной среде показывают оптимальный рост и жизнеспособность (смотри также фиг.4С). Через 24 часа они образуют колонии на поверхности чашки для культивирования тканей. 30- 50% слияния указывает оптимальную плотность.
5. 24 ч после настройки счетчик культуральной колбы добавляют 500 мл свежей среды (MEM, 10% FBS) с добавкой к гигромицину B (100 мкг / мл). 24 ч спустя повторить этот шаг.
6. 72 ч после настройки в счетчике культуру, добавить 1000 мл свежей MEM средах (10% FBS) с гигромицину B (100 мкг / мл), в результате общего объема 3 л клеточной суспензии.
7. 24 ч после достижения AVolume из трех литров, урожай 116 клеток суспензии центрифугированием в течение 10 мин при 500 х г при комнатной температуре. Удалите супернатант. Держите опустели счетчик культуры колбу под капот культуры ткани.
8. Ресуспендируют осадок клеток в свежей среде MEM с добавлением 5% FBS с помощью пипетки вверх и вниз относительно 8- 10 раз, чтобы получить гомогенную суспензию клеток. Объем среды зависит от того, лизат, полученный на стадии 2,10) 2. (19,5 мл, см шаг 4,8) 1. Вариант А) или очищенный вирусный запас HCAdV с шага 5.9) 2. (несколько мкл depanding на титра вируса, см шаг 4,8) 2., вариант Б) используется для заражения клеток. Использование общего объема 150 мл.
   1. Вариант А: Для инфекции 116 клеток суспензии с лизатом от P3 (главный усилительный) передачи клетки со стадии 4.8) к бутылке для хранения 250 мл, снабженную стерильной магнитной мешалкой или 250 мл малого масштаба вращающейся колбе и со-инфицировать клетки с Вирус в лизата от P3 (шаг 2.10.2) и 2 ТУ ВН на клетку. Если предположить, что плотность 3x10 ⁵ клеток на мл, общее количество клеток является 9x 10 ⁸ клеток. Таким образом, добавить 1.8x 10 ⁹ ТУ в HV.
   2. Вариант Б: К инфекции 116 клеток суспензии с очищенной вирусной акции, передача клетки, полученные на стадии 4.8) в хранилище бутылки 250 мл, снабженную стерильной магнитной мешалкой или 250 мл малого масштаба вращающейся колбе и со-инфицировать клетки с вирусными частицами 100 на клетку из ранее очищенных HCAdV (со стадии 5.9) 2.). Таким образом, добавление 9x 10 ¹⁰ VP в соответствии с физическими титра (измеренной по поглощению при 260 нм; этап 6) очищенного HCAdV и 1.8x ¹⁰ 9 ТУ в HV.
9. Размешайте клеток вируса смесь из Сен 4.8.1) или 4.8.2) в магнитной мешалкой в культуре ткани инкубаторе при 37 ° С и 5% _СО 2 в течение 2 ч при 60 оборотах в минуту. Убедитесь, что бутылка хранения не полностью закрыта для циркуляции воздуха.
10. 2 ч после заражения передать общий объем клеток вируса смеси обратно во вращающуюся культа 3 лЮр колбу и добавить 1850 мл свежей предварительно нагретой (37 ° C) MEM, дополненной 5% FBS до общего объема 2 л и инкубируют в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 48 ч при 70 мин.
11. Урожай клетки центрифугированием в течение 10 мин при 890x г при комнатной температуре в 500 мл центрифужные пробирки. Извлеките носитель и ресуспендируют осажденные клетки в общем объеме 28 мл DPBS. Пипетировать вверх и вниз до получения однородной клеточной суспензии. Замораживание клеток вирусной суспензии в жидком азоте или при температуре -80 ° С, убедившись, что подвеска полностью заморожена. Не хранить клетки-вирусной суспензии при -80 ° С до начала очистки вируса.

5. Очистка и Диализ HCAdV

1. Чтобы приготовить вирусный лизат для хлорида цезия (CsCl) градиентов, заморозить клетки-вирусной суспензии, полученной на стадии 4.11) в жидком азоте и оттаивания в водяной бане при 37 ° С в четыре раза.
2. Центрифуга лизата вируса при 500 мкг в течение 8 мин при RТ и собирать надосадочную жидкость, содержащую HCAdV.
3. Ультрацентрифугирование готовить растворы CsCl, как follows.Weigh 37,5 г (1,5 ^г / см 3), 33,5 г (1,35 для г / см ^3), и 31,25 г (1,25 г / ^см 3) CsCl порошка, соответственно, и заполнить с дН _{2 O} до 25 мл.
   1. Stirr до решения становится ясно, и стерильный фильтр решения. Наконец удалить 1 мл каждого раствора и взвесить его на мелкой шкале, чтобы проверить погоду плотность является правильным. 1 мл должны весить 1,5 г, 1,35 и 1,25 г соответственно.
   2. Если плотность слишком высока отрегулировать его ступенчатым добавлением небольших объемов (мкл) стерильного _дН 2 O. После того ЦТ _{2 O} измерить плотность которых снова. При необходимости добавить еще дН _{2 O.}
   3. Повторите эту процедуру, пока плотность не является правильным. Если плотность слишком низка настроить его добавлением небольшого количества порошка CsCl. Стерильный фильтр снова и проверьте плотность. Если плотность слишком высокая отрегулируйте его надстройкаг дН _{2 O,} как описано выше. Если плотность еще слишком низок добавить мор CsCl, стерильный фильтр снова и проверить плотность. Повторите эту процедуру, пока плотность не является правильным.
4. Подготовка CSCL шаг градиенты в шести прозрачных Ультрацентрифуга труб. Осторожно и медленно пипетки решения CsCl в трубы с помощью следующий порядок: 0,5 мл 1,5 г / см ³ раствора CsCl, 3 мл 1,35 ^г / см3 раствора CsCl и 3,5 мл 1,25 ^г / см3 раствора CsCl (фиг.2С) ,
5. Наложение ~ 4,5 мл очищенной вектор супернатант из шага 5.2) в верхней части г / см ³ хлористого цезия слоя 1.25. Центрифуга градиентов в ультрацентрифуге помощью качели из ротора (SW-41) при 12 ° С в течение не менее 2 ч при 226000 х г (35 000 оборотов в минуту) с медленным ускорением и замедлением в отдельном HCAdV-генома, содержащая вирусные частицы из пустых частиц и ячейки мусора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При оптимальных условиях диффузного группа клеток мусора форм на верхнейтруб. Ниже два белые полосы можно наблюдать. Верхняя полоса содержит пустые частицы в то время как нижняя полоса равна HCAdV (рис 2С и 5А).
6. Тщательно удалить слои клеточного дебриса и пустых частиц и собирать 1 мл нижних зон из каждой пробирки и передачи вируса с чистой пипетки в стерильную пробирку на 50 мл. Добавьте до 24 мл 1,35 ^г / см3 CsCl решение собранных вирусных частиц и тщательно перемешать.
7. Заполните центрифужные пробирки с 1.35 г / ^см 3 CsCl вирусов решение верхней и центрифуги O / N (18- 20 ч) в 226000 мкг (35000 оборотов в минуту) при 12 ° С в ультрацентрифуге помощью качели из ротора (SW-41 ) медленно ускорения и замедления.
8. Соберите HCAdV присутствующих в видном нижней полосы. В качестве потенциального верхняя полоса содержит пустые частицы удалить верхние слои сверху с помощью пипетки (см рисунки 2C и 5B) Потом заберите нижнюю USI полосынг пипетки.
9. Диализировать собранные вирусные частицы для буфера обмена.
   1. Отрежьте полоску диализной трубке (MWCO: 50,000) около 8 см в длину, промойте его стерильным дН ₂ O в течение трех раз. Затем закройте одну сторону диализной трубки с пластиковым зажимом и передают собранную вирус с шага 5.8) в системе трубопроводов при использовании 1-мл пипетки. Избегайте пузырьков воздуха в трубки и закрыть его на другой стороне с пластиковых колпачков зажима диализа.
   2. Диализировать в 1 л буфера для диализа (10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10% глицерина и 1 мМ _MgCl 2 в деионизированной _H 2 O) в течение 2 часов при температуре 4 ° Cwith медленном перемешивании. Обмен буфера для диализа с 2 л буфера для диализа и диализ O / N при 4 ° С при медленном перемешивании. Можно также использовать sucrosebuffer (140 мМ NaCl, 5 мМ _Na 2 HPO ₄ x2h _{2 O,} 1,5 мМ KH _{2 PO 4 и} 730 мМ сахарозы, рН 7,8).
   3. Соберите Диализованные вирусных частиц из шага 5.9) 2. с использованием 1 мл рipette. Подготовьте несколько аликвот желаемых небольших объемах (25- 100 мкл) и хранить очищенный вирус при -80 ° С.

6. Измерение физической Титр Заключительных HCAdV препаратов по оптической плотности (ОП)

1. Развести 25 мкл конечного препарата вектор из шага 5.9) 2 475 мкл буфера для лизиса (10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА (рН 8,0), 0,5% SDS)), осторожно встряхивают в течение 20 мин при РТ и, наконец, центрифуги в течение 2 мин при комнатной температуре при 15000 х г в.
2. Так как значения поглощения при 260 нм (А260), как правило, низкой, Измерить поглощение четыре раза с использованием 100 мкл супернатанта и рассчитать среднее значение четырех измерений. Рассчитать количество вирусных частиц на мл (VP / мл ^-1), используя следующую формулу: Vp / мл ^{-1 =} (средний A260) х (20) х (1,1 х 10 ¹²⁾ х (36 кб размер / HCAdV в кб ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты типичного урожая абсолютных вирусных частиц (ОД) титр показаны на рис 7А . Опыт показывает, что ОД титр переоценивает количество вирусных частиц. Абсолютные вирусные частицы, измеренные OD может быть 20- 100 раз выше, чем инфекционных вирусных частиц, измеренных д-PCR. Для более точного измерения absolte и инфекционных частиц HCAdV, а также загрязнения HV по Q-ПЦР, обратитесь к разделу 7.

7. Измерение всех частиц, Инфекционные Подразделения HCAdV и уровней загрязнения в HV конечный вектор подготовки по кПЦР. Схема титрование показано на рисунке 6

1. Семенной НЕК293 в 6 или 12 пластин культуры ткани также, чтобы клетки достигают 90% слияния на следующий день. Чтобы определить количество инфекционных вирусных частиц (инфекционный титр), инфицировать клетки одного хорошо мульти-луночный планшет с 1 мкл и второй скважины с 10 мкл очищенного вируса от шага 5.9) 3.
2. Урожай клетки после заражения 3 ч. Удалить среднего и добавить трипсин, чтобы покрыть всю лунку и инкубировать в 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 5 мин. Промойте от клетки с помощью трипсина с помощью пипетки и спином вниз клетки при 890 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре.
3. Ресуспендируют гранулированных клеток в 200 мкл DPBS и тщательно вымойте их, чтобы удалить свободные (без инфекционных) векторных частиц. Центрифуга в течение 3 мин при 890 мкг при комнатной температуре. Удалите супернатант и ресуспендирования гранул клеток в 200 мкл свежей DPBS.
   Примечание: Для точного определения инфекционного титра, важно, чтобы удалить все не-инфекционных вирусных частиц из клеток поверхностей путем обработки трипсином и тщательное мытье.
4. Чтобы определить общее число частиц вируса (инфекционные частицы, так и не инфекционные частицы = физическое титр), урожай неинфицированных клеток НЕК293 из двух скважин без трипсина путем промывки от клеток с их питательная среда с помощью пипетки.
5. Спин вниз клетки в течение 3 мин при 890 х г при комнатной температуре. Откажитесь от среды и ресуспендирования клеток в гранулированные 200 мкл DPBS. Суbsequently добавить 1 мкл и 10 мкл очищенного препарата HCAdV непосредственно к клеткам, соответственно. Использовать не инфицированные клетки в качестве фона, чтобы обеспечить одинаковые условия для изоляции GDNA и последующей д-PCR.
6. Изолировать GDNA из НЕК293 клетках, полученных из шагов 7.3) и 7.5)
   1. Вихревые клетки ресуспендировали в 200 мкл DPBS (шаг 7,3 и 7,4) в течение 3 сек, добавьте 200 мкл раствора SDS. (10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА (рН 8,0), 0,5% SDS) и 20 мкл протеиназы К (20 мг / мл) и суспензию вихревого в течение 3 сек. Выдержите 12- 16 ч при 55 ° C и встряхните медленно. Затем добавляют 2 мкл РНКазы А (20 мг / мл) и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
   2. Добавить 350 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт и центрифуги в течение 2 мин при 15000 х г в. Перенести супернатант в новую пробирку и повторить этот шаг сразу
   3. Передача супернатант в новую пробирку, добавить 50 мкл ацетата натрия (рН 5, 3 м) и 1 мл охлажденного льдом этанола (99,8%) и смешивают суспензию. CentriFuge образцы в течение 10 мин при 15000 х г для осаждения геномной ДНК.
   4. Затем удалить супернатант, добавить 500 мкл 70% этанола и центрифугируют в течение 2 мин при 15000 х г в. Удалить супернатант, добавить 500 мкл 70% этанола и встряхивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем центрифуги в течение 2 мин при 15000 х г в.
   5. Удалить супернатант и сухой воздух-ДНК гранул. Не сухие гранулы ДНК в течение длительного времени, как это будет труднее получить GDNA в растворе. Ресуспендируют гранул ДНК в 120 мкл _дН 2 O и инкубировать в течение ~ 1 ч при 37 ° С при встряхивании. Если раствор ДНК появляется вязкая, встряхнуть его в течение нескольких часов при 37 ° С, или инкубировать при 55 ° С в течение ~ 1 ч.
7. Для определения инфекционных HCAdV-частицы и абсолютные HCAdV-частиц, получения стандартной кривой 10 ¹ - 10 ⁸ копий плазмиды, несущей ГОИ, содержащихся в HCAdV генома.
8. Определите общее частиц и инфекционные частицы, анализируя те же суммы гДНК зараженных HEK293 Слоктей с шагом 7.3) и 7.4) применяются КПЦР с использованием 400 нМ праймеров, специфичных для ГОИ, содержащихся в HCAdV генома.
9. Установите программу ПЦР следующим образом: предварительно инкубации при 95 ° С в течение 10 мин, усиление в 40 циклов при 95 ° С в течение 10 сек, 55 ° С в течение 10 сек и 72 ° С в течение 20 сек. На основании стандартной кривой (шаг 7,7), интерполируют общее количество аденовирусных геномов в реакции.
10. Рассчитать количество аденовирусных геномов в окончательной подготовки вектора используя следующий формуляр: (Количество HCAdV / вес в нг гДНК в реакции) х (вес в нг ДНК всех клеток в инфицированной блюдо / вирус объем в мкл) ,
    ПРИМЕЧАНИЕ: типичный диапазон для абсолютные и инфекционные вирусные частицы урожайности около 1x10 ⁷ -1x10 ⁸ вирусных частиц / мкл. Титры, которые в десять раз выше или ниже показано здесь можно рассматривать как нормальное. Более высокие титры будет улучшение. Что касается соотношения абсолютного HCAdV участнле инфекционных частиц HCAdV, опыт показывает, что примерно 5 10% абсолютных частиц HCAdV являются инфекционные (7А).
11. Для определения уровней загрязнения с HV, выполнить КПЦР путем амплификации часть аденовирусного гена конце 3 (L3), присутствующих в геноме HV. Использование плазмиды, несущей аденовирусного гена конце 3 (L3), и получения стандартной кривой (этап 7.7).
12. В этой реакции применяют 400 нм L3 праймеров вперед 5'-AGA AGC TTA ГПК ТСС GTT GTT АКТ CGA GG-3 'и L3 обратной 5'-ATA AGC ТТГ КПП GTT ATG CAG ГГТ GAT GG-3 "вместе с 300 нМ в L3-специфического зонда 5'-Фам-CCA ССС ГТГ TGT АКК TGG TGG АСА-Tamra-3 ".
13. Установите программу ПЦР следующим образом: предварительная инкубация / активации при 95 ° С в течение 10 мин, в течение 40 усиления циклов 95 ° С в течение 15 сек и 60 ° С в течение 1 мин. Используйте любой универсальный датчик ПЦР Mastermix для реакции КПЦР. На основе стандартной кривой (шаг 7.7), вычислить количество вfectious частицы HV в окончательной подготовки вектора. См (7А) для типичных доходности для высоковольтных частиц.
14. Наконец рассчитать соотношение абсолютных инфекционных частиц HCAdV до уровней загрязнения HV, чтобы оценить качество подготовки вектора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: До сих небольшая часть оставшегося HV не может быть исключена. Обычно процент загрязнения HV составляет ~ 5% от инфекционных частиц или менее, что является приемлемым (7В). Конечно, как менее HV, насколько это возможно, желательно, особенно если препарат вектор будет использоваться для экспериментов на животных.

Результаты

Здесь типичные примеры для клонирования, амплификации и очистки HCAdV препаратов приведены. Обзор стратегии клонирования (Рисунок 1) и типичные примеры для клонирования и выпуск HCAdV генома ограничением фермента переварить предоставляются (рисунок 2). Т...

Обсуждение

Протокол, представленные здесь позволяет очистку HCAdV векторов на основе аденовируса человека типа 5 на основе описанных выше процедур ^4,12. HCAdV генома в плазмиды pAdFTC лишена всех аденовирусов генов и только несет 5'- и 3'РМЭ и сигнал упаковки. В рамках этой стратегии ВЛ ^AdNG163R-2 4...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	restriction digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restriction digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	selection of CRE expressing 116 cells
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 cell culture medium
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle	Sigma	CLS430281-24EA	infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask	Bellco	1965-61030	growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes	Beckmann Coulter	344059	density gradient centrifugation
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes	Thermo	66383	dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305	tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 touch	Biorad		qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carl Roth	A156.1	purification of DNA
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	density gradient centrifugation
sodium acetate 99%	Carl Roth	6773.2	DNA precipitation
LB medium	Carl Roth	X968.3	bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure	Carl Roth	9065.5	DNA precipitation and washing
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	lysis  buffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	lysis  buffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	dialysis buffer
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	dialysis buffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional dialysis buffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional dialysis buffer
sucrose	Carl Roth	9286.1	optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	optional dialysis buffer
1.5-ml tubes	sarstedt	72,730,005	storage of virus preparations at -80 °C