Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5

Riepilogo

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Abstract

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

Introduzione

Per applicazioni terapeutiche gene è di grande importanza per evitare effetti collaterali citotossici e immunogenici causate da espressione di proteine ​​virali, il transgene stesso o da proteine ​​virali in arrivo. Adenovirus (adv) sono ampiamente utilizzati per introdurre DNA esogeno in un'ampia varietà di cellule per studiare l'impatto di espressione del transgene ^1,2. La versione più avanzata di AdV è rappresentato da adenovirus ad alta capacità (HCAdV) privi di tutte le sequenze codificanti virali ^3,4 e offrendo così una capacità di confezionamento fino a 35 kb in combinazione con bassa immunogenicità e bassa tossicità ^5-8. Grazie alla loro elevata capacità di confezionamento consentono consegna di grandi o più transgeni utilizzando una singola dose di vettore. Pertanto, essi rappresentano uno strumento prezioso per la comunità di ricerca.

A differenza di prima o di seconda generazione AdV privi dei geni precoci E1 e / o E3 che possono essere facilmente prodotti utilizzando kit commerciali, vector costruzione genoma e virus produzione di HCAdV è più complessa. Il sistema per la costruzione di genomi HCAdV si basa sulla pAdFTC plasmide portando un genoma HCAdV privo di tutte le sequenze codificanti virali e il plasmide shuttle pHM5 ^9-12. Ogni gene di interesse di fino a 14 basi chilo (kb) può essere clonato nel pHM5 navetta vettore in cui il sito di clonaggio multiplo è affiancato da riconoscimento / fendendo siti degli enzimi di homing Pi- Sce I e I-Ceu I. Pertanto, un gene clonato di interesse può essere rilasciato da PI- consecutivo Sce I e I-Ceu io digerisce per successivo inserimento diretto nelle stesse siti di restrizione presenti nel genoma HCAdV contenuta nel pAdFTC plasmide. Nel pAdFTC il sito di inserimento del transgene situato tra il PI- Sce I e I-Ceu io Decolleté siti è fiancheggiato da riempimento del DNA e le sequenze non codificanti adenovirali necessari per il confezionamento genoma tali ripetizioni terminali come il 5 'e 3' invertita (ITR)ad entrambe le estremità e il segnale di confezionamento a valle del 5'ITR. Il DNA addizionale Stuffer fornisce dimensione ottimale del genoma HCAdV finale che vanno da 27 a 36 kb di assicurare imballaggio efficiente durante la produzione di virus. Poiché pAdFTC è una grande plasmide con un massimo di 45 kb (dipende dalla dimensione del transgene inserito) e l'utilizzo di endonucleasi homing con siti di riconoscimento di DNA lunghe comparabilmente presenta forte legame al DNA, più fasi di pulizia sono necessari durante il trasferimento del transgene dal pHM5 a pAdFTC. Si raccomanda la gestione attenta evitando forze di taglio.

I ITRs del genoma HCAdV si affiancano Not I siti di riconoscimento dell'enzima di restrizione situati immediatamente a monte ea valle 5'ITR del 3'ITR ^12. Pertanto, HCAdV può essere sganciato Non io digerisco per la successiva trasfezione del genoma virale nel linea cellulare produttore HCAdV. Si noti che l'utilizzo di enzima di restrizione Not I per relfacilità del genoma virale dal pAdFTC plasmide implica che il transgene introdotto non privo di siti di riconoscimento Not I DNA. Le cellule produttrici basate cellule HEK293 (116 celle) stabilmente esprimono Cre ricombinasi. Per l'amplificazione virus 116 cellule sono co-infettati con un virus helper (HV) che fornisce tutti i geni ADV necessari per la replica e l'imballaggio in trans ^3,4. L'alta tensione è un AdV prima generazione con un segnale di imballaggio floxed che viene rimossa durante l'amplificazione virus Cre ricombinasi espressa in 116 cellule ^4. Questo assicura che i genomi prevalentemente HCAdV contenenti un segnale di imballo integro sono encapsidated.

Pre-amplificazione del HCAdV viene eseguita effettuando passaggi passaggio in serie in 116 cellule coltivate su una superficie in piastre di coltura dei tessuti. Dopo ogni passaggio particelle virali sono rilasciate dalle cellule infette conducendo tre consecutivi passaggi di congelamento-scongelamento. Con ogni passaggio un numero crescente di cellule sono infettati con1/3 di lisato cellulare dal passaggio precedente. Infine lisato dall'ultima fase di pre-amplificazione viene utilizzato per infettare cellule produttrici coltivate in sospensione in un pallone filatore per larga scala di amplificazione. Virioni sono purificati dalle cellule sospensione eseguendo ultracentrifugazione in una densità di cloruro di cesio gradiente ^4,12. Con questa procedura particelle vuote e particelle completamente assemblati vengono separati in due bande distinte. Per concentrare ulteriormente il HCAdV particelle viene eseguita una seconda fase ultracentrifugazione non graduale. Successivamente il gruppo risultante contenente il HCAdV viene raccolto e dializzato contro tampone fisiologico. Preparazioni vettore finali sono caratterizzati in relazione al numero di particelle virali assoluti, particelle infettive e livelli di contaminazione HV. Particelle virali assoluti possono essere determinati mediante lisi particelle virali e misurare l'assorbanza a 260 nm o eseguendo quantitativa real-time PCR (qPCR) ^12. Infettività del purparticelle virali da norme possono essere determinate misurando qPCR genomi HCAdV presenti all'interno delle cellule infettate 3 ore dopo l'infezione.

Protocollo

1. Costruzione di ricombinante HCAdV Genomi basato sul plasmide pAdFTC

Nota: Tutti i plasmidi sono stati descritti in precedenza ^11,12 e sono disponibili su richiesta. La procedura di clonazione è schematicamente illustrato nella figura 1.

1. Clonare un gene di interesse (GOI) inclusi il promotore e poliadenilazione segnale (pA) nella navetta plasmide pHM5, utilizzando una strategia di clonazione di scelta, per generare pHM5-GOI.
   NOTA: Dal momento che pAdFTC è relativamente grande plasmide, sono raccomandati protocolli di preparazione plasmide classici per evitare sheering del DNA plasmide utilizzando kit commerciali di purificazione plasmide che si basano sulle membrane di silice. I- Ceu I e PI -Sce fortemente legano al DNA e cambiare la mobilità elettroforetica di DNA digerito. Pertanto, è necessaria una estrazione con fenolo-cloroformio e EtOH precipitazioni (punto 1.3) prima di elettroforesi su gel di agarosio.
2. Digest 20 mg di PHM5-GOI e 10 ug di pAdFTC da I-CeuI (10 U) per 3 ore a 37 ° C in un volume totale di 100 microlitri di linearizzare plasmidi (~ 2,8 kb + sequenza GOI ORF e ~ 31kb, rispettivamente).
3. Purificare plasmidi linearizzati mediante estrazione con fenolo-cloroformio seguita da etanolo (EtOH) precipitazioni ^13.
   1. Aggiungere 100 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e mescolare delicatamente invertendo il tubo più volte. Centrifugare per 2 minuti a 15.000 x g.
   2. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, aggiungere 20 ml di acetato di sodio (pH 5, 3 m) e 400 ml di ghiaccio freddo EtOH (99,8%) e mescolare energicamente sospensione. Centrifugare per 10 minuti a 15.000 x g.
   3. Rimuovere il surnatante, aggiungere 300 ml di 70% EtOH e centrifugare per 2 minuti a 15.000 x g. Quindi rimuovere il surnatante e pellet di DNA asciugare all'aria. Sciogliere il pellet in 10- 20 ml di dH ₂ O. Do pellet di DNA non asciugare troppo a lungo, dato che sarà più difficile ottenere il DNA in soluzione.
4. Digest I-Ceu I -digested pHM5-GOI e pAdFTC plasmide dal punto 1.3) per almeno 3 ore o O / N con l'enzima di restrizione PI -Sce I (10 U) a 37 ° C in un volume totale di 50 microlitri e successivamente purificare I -CeuI e PI -Sce ho digeriti plasmidi usano estrazione con fenolo-cloroformio seguita da EtOH precipitazioni (vedi punto 1.3). Sciogliere il DNA in 20 ml di nucleasi dH gratis ₂ O.
5. Indipendente dorsale pHM5 plasmide (2.8 kb) e il governo indiano (dal punto 1.4) su un gel preparativo e gel purificano l'GOI utilizzando un gel-commerciale e PCR-kit di pulizia. Un gel di agarosio rappresentante del digest è mostrato in Figura 2A.
6. Defosforilare I- Ceu I e PI -Sce I-digerito pAdFTC (dal punto 1.4) con Calf Intestinal fosfatasi alcalina CIP (10 U) per 1 ora a 37 ° C in un volume totale di 25 microlitri e purificare defosforilato plasmide pAdFTC mediante estrazione con fenolo-cloroformio e successiva EtOH precipitation (passo 1,3). Eluire il DNA in 20 ml di nucleasi dH gratis ₂ O.
7. Eseguire l'elettroforesi su gel analitico da una aliquota del plasmide defosforilato pAdFTC (dal punto 1.6) e il governo indiano frammento purificato (dal punto 1.5) per analizzare se digest sono complete e le dimensioni dei frammenti attesi sono corrette (~ 31 kb per pAdFTC linearizzata ).
   Nota: La dimensione del GOI è variabile a seconda delle dimensioni della cassetta di espressione del transgene. Stimare le concentrazioni relative dei rispettivi frammenti per la successiva legatura. Un gel di agarosio rappresentante di frammenti purificati è illustrata nella Figura 2B.
8. Impostare la reazione di ligasi in un volume totale di 20 microlitri con 400 U di T4 ligasi DNA ed un rapporto molare di vettore di inserire di 1: 3.
   NOTA: In accordo con il gel di agarosio mostrato in Figura 2B solito legare in un volume totale di 20 microlitri con da 2 a 6 microlitri vettoriale, 8- a 12 microlitriinserire e 400 U di T4 ligasi DNA. Poiché la concentrazione di DNA è solitamente basso dopo diversi passaggi phenolization, utilizzare il più possibile in modo DNA che nessun ulteriore H ₂ O deve essere aggiunta per raggiungere il volume finale di 20 ul. Legare a 16 ° CO / N e successivamente eseguire estrazione con fenolo-cloroformio seguita da precipitazione EtOH (passo 1.3).
   1. Eluire DNA in 15 microlitri di nucleasi dH libera ₂ O e digerire la reazione legatura purificato con l'enzima di restrizione Swai (10 U) per 2 ore a 25 ° C in un volume totale di 20 microlitri. Poi concentrare e purificare il DNA, effettuando estrazione con fenolo-cloroformio seguita da EtOH precipitazioni (punto 1.3). Eluire il DNA in 10 ml di nucleasi dH gratis ₂ O.
9. Trasforma 2 ml di purificato Swa ho digerito prodotto legatura mediante elettroporazione in DH10B o DH5α electrocompetent E. coli e selezionare i cloni per 16-24 ore a 37 ° C su-ampicillina contenente LBpiastre (50 mg / ml ampicillina). Selezionare 5- 10 cloni e preparare plasmide DNA mini-preparati utilizzando lisi alcalina seguita da estrazione con fenolo-cloroformio e successiva precipitazione EtOH (passo 1.3) ^13.
10. Eseguire un digest analitico di plasmide mini-preparati seguita da elettroforesi su gel di agarosio per verificare la dimensione dei frammenti di DNA. Enzimi di restrizione proposti sono, per esempio I-Ceu I e PI- Sce io rilasciare l'inserto, Spe I o Hinc II (Figura 2C).
11. Amplificare un clone corretto in terreno LB contenente ampicillina (50 mg / ml di ampicillina) ed eseguire una preparazione Midi- o maxi-plasmide utilizzando qualsiasi kit di purificazione del plasmide disponibile in commercio.

2. Rilascio di HCAdV-genomi di pAdFTC plasmidi e preamplificazione di HCAdV Vettori nel Line Producer cellulare 116

1. Digest 20 mg del plasmide adenovirale di produzione basato pAdFTC contenente il governo indiano clonato dal punto 1.11) inun volume totale di 100 microlitri con Not I (20 U) a 37 ° C per> 2 ore ed eseguire estrazione con fenolo-cloroformio due volte seguiti da EtOH precipitazione. Sciogliere in 20- 30 ml dH sterili ₂ O.
2. Controllare un'aliquota 1:10 diluito digerito pAdFTC-GOI-DNA mediante elettroforesi su gel. Un frammento 9 kb per il backbone plasmide e, a seconda delle dimensioni del GOI, un secondo frammento di DNA per il genoma HCAdV (dimensioni: 28- 36 kb) è rilevabile.
   NOTA: un esempio rappresentativo del non io digest viene visualizzato in figura 2D. DNA linearizzato può essere conservato per diversi giorni a 4 ° C oa -20 ° C per diverse settimane.
3. Prima di procedere con il protocollo, assicurarsi che il virus helper AdNG163R-2 è stato amplificato ^4.
   Nota: Le cellule trasfettate con pAdFTC derivato vettori HCAdV sono organismi geneticamente modificati classificati come livello di biosicurezza 2 (BSL-2), si prega di utilizzare la corretta gestione dei rifiuti e il contenimentomisure, tra cui dispositivi di protezione individuale, e il lavoro sotto BSL-2 cappe a flusso laminare.
4. Culture 116 cellule in MEM Eagle Medium supplementato con 10% FBS e igromicina B (100 mcg / ml). Seed passaggio basso (sotto passaggio 10) 116 celle (~ 0.4x ¹⁰ 6 celle) in 60 millimetri piatto di coltura tissutale un giorno prima trasfezione in modo che essi raggiungono 50- 80% di confluenza il giorno successivo.
5. Trasfettare linearizzato genoma HCAdV dal punto (2,1) in 116 celle utilizzando metodi, come trasfezione fosfato di calcio o altri reagenti di transfezione disponibili in commercio (Figura 3A). 16- 18 ore dopo la trasfezione, rimuovere con attenzione il supporto, aggiungere 3 ml di mezzo fresco (MEM, 5% FBS) e infettare le cellule con l'HV AdNG163R-2 ⁴ applicando 5 unità di trasduzione (TU) per cella (da un confluente 60 mm piatto di coltura di tessuti contiene ~ 3.2x ¹⁰ 6 cellule, aggiungere ~ 1.6x ¹⁰ 7 TU di HV).
   1. Spostare delicatamente il piatto ogni 20 minuti durante la prima ora dopo l'infezione perassicurare una distribuzione pari HV. Coltivare cellule infette a 37 ° C e 5% CO _2. In caso di efficace effetto di amplificazione virus citopatico (CPE) causate da replicazione del virus (le cellule sono arrotondati e vagamente attaccate o staccate dal piatto di coltura tissutale) è osservabile 48 ore post-infection.If CPE è osservato in precedenza la quantità di HV deve essere ridotto. Se CPE inizia più tardi, più virus helper deve essere utilizzato.
6. Celle di raccolta tra cui surnatante a 48 ore dopo l'infezione da vampate di calore al largo delle cellule dalla piastra di coltura con il terreno di coltura. Le cellule che sono sospesi nella loro terreno di coltura sono chiamati passaggio 0 (P0). Split P0 in due frazioni.
   1. Da 0,5 ml delle cellule staccate Centrifugare le cellule per 3 minuti a 2000 xg e rimuovere medie dal pellet cellulare, che viene poi utilizzato per isolare DNA genomico (gDNA) per l'analisi basata qPCR del processo di amplificazione. Pellet cellulari Conservare a -20 ° C, fino al procedimento.
   2. Da 2.5ml delle cellule staccate rilasciare particelle virali mediante congelamento (a -80 ° C o in azoto liquido) e scongelamento (a temperatura ambiente o in un bagno d'acqua 37 °) le cellule che sono resupended nelle medie tre o quattro volte. Questa frazione è di chiamata lisato di P0.
7. Assicurarsi che i piatti di coltura di tessuti con 116 celle coltivati ​​a 90- 95% di confluenza con MEM-media integrato con FBS (10%) e igromicina B (100 mg / ml) e HV sono disponibili per i seguenti passi passaging.
8. Mescolare 1 ml di terreno fresco (MEM, 5% FBS) con 2,5 ml di lisato dal passaggio precedente (passaggio 2.6.2) ad un volume finale di 3,5 ml, aggiungere HV applicando 2 TU per cella (dato un tessuto 60 mm piatto di coltura ad una confluenza del 90- 95% contiene ~ 3.2x ¹⁰ 6 cellule, aggiungere ~ 6.4x ¹⁰ 6 TU di HV). (Figura 3B). Rimuovere con attenzione il mezzo da un piatto 60 mm di 116 cellule e aggiungere la miscela virale alle cellule. Ripetere il punto 2.6) - 2.8) due volte per ottenere lisati di passaggioetà P1 e P2.
9. Mescolare 17,5 ml mezzi freschi (MEM, 5% FBS) con 2,5 ml del lisato da P2 e aggiungere HV applicando 2 TU per cella (dato un piatto di coltura tissutale 150 mm ad una confluenza del 80- 100% contiene ~ 2x 10 ⁷ cellule, aggiungere ~ 4x ¹⁰ 7 TU della HV). Rimuovere il mezzo da un piatto 150 mm di 116 cellule e infettare le cellule con il composto virale. Coltivare cellule infette a 37 ° C e 5% CO _2.
10. 48h dopo l'infezione delle cellule raccolto come descritto nel punto 2.6) per ottenere il passaggio P3 (Figura 3B).
    1. Ripetere il punto 2.6) 1.
    2. Dalla restante 19,5 ml di particelle virali rilascio P3 dalle cellule resupended mediante congelamento e scongelamento tre o quattro volte. Questa frazione è di chiamata lisato di P3.
       Nota: Alcuni vettori eventualmente potrebbero richiedere passaggi supplementari in 150 mm piatti fino a quando non vengono amplificati a sufficienza. Pertanto efficacia del processo di pre-amplificazione deve essere monitorato durante passaggio serialeinvecchiamento. qPCR analisi basata del processo di amplificazione può essere eseguito come descritto nel paragrafo 3 (vedi anche figura 4A). Pre-amplificazione HCAdV trasportano una cassetta di espressione per la proteina fluorescente verde (GFP) può essere facilmente valutata osservando il segnale flourecscent GFP usando un microscopio a fluorescenza (Figura 4B).

3. Monitoraggio del processo di amplificazione con Quantitative-Real Time PCR (qPCR) (vedi anche figura 4A).

1. Isolare gDNA dal pellet cellulari da ciascun passaggio del preamplifaction (passi 2.6) - 2.10) utilizzando qualsiasi kit commerciale isolamento del DNA per l'isolamento di gDNA da cellule coltivate o un altro metodo di scelta. Per ottenere risultati ottimali di PCR utilizzare gDNA più fresco possibile. In caso contrario, gDNA possono essere conservati a -20 ° C fino a nuovo uso.
2. Per determinare il numero di genomi HCAdV presente nelle cellule del rispettivo passaggio di analisi qPCR generare una curva standard utilizzando 10 ^{1 <}/ sup> - 10 ⁹ copie di un plasmide portare il governo indiano contenuti nel genoma HCAdV.
3. Analizzare la stessa quantità di gDNA da P0 P3 (passo 2.6- 2.10) applicando qPCR con 400 Nm di primer specifici per il governo indiano contenuti nel genoma HCAdV. Per lo svolgimento di istruzioni dei rispettivi prodotti chimici qPCR del produttore follow qPCR. Impostare il programma qPCR come segue: pre-incubazione a 95 ° C per 10 minuti, in 40 cicli di amplificazione di 95 ° C per 10 s, 55- 60 ° C per 15 s e 72 ° C per 20 s. Sulla base della curva standard il numero di genomi HCAdV nella reazione può essere interpolata.

4. Grande Amplificazione scala di HCAdV Vettori in 116 cellule Crescere in sospensione

1. Aggiungere 900 ml di preriscaldata (37 ° C) MEM fresco supplementato con 10% FBS e igromicina B (100 mg / ml) in un pallone di coltura 3 l filatore (Figura 3B).
2. Rimuovere media di almeno 10 singoli 150 mm piatti di coltura tissutale con 116 cellule coltivate ad una confluenza del 90- 100% e lavare le cellule con 10 ml di fresca pre-riscaldato (37 ° C) MEM supplementato con FBS (10%) e igromicina B (100 mcg / ml) usando una pipetta sierologica. Pipetta su e giù più volte per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Trasferire le cellule direttamente nel pallone filatore già contenente 900 ml dal punto 4.1).
   Nota: Non utilizzare tripsina / EDTA come può influire negativamente crescita delle cellule in sospensione. Dopo la rimozione del mezzo di trasferire immediatamente le cellule nel pallone filatrice. Non gestire più di due piastre di coltura tissutale alla volta. Il più lungo il tempo di attesa dopo l'aggiunta di mezzi freschi e più difficile sarà per distaccato le cellule dal piatto di coltura di tessuti.
3. Per garantire una ottimale crescita cellulare Incubare filatore beuta su un agitatore magnetico in una coltura tissutale incubatore per 24 ore a 37 ° C e 5% CO _2. Regolare l'agitatore magnetico a 70 rpm per evitare attaccamento di cellule alle superfici di vetro.
4. Monitorare la crescita cellulare in filatore pallone di coltura di esaminare se le cellule coltivate in pallone di coltura filatore sono vitali e se crescono a una quantità sufficiente. Ogni volta prima di aggiungere fresco trasferimento medio 2 ml dal bioreattore a un piatto di coltura di tessuto 60 mm. Osservare morfologia cellulare al microscopio.
   Nota: Le cellule che formano cespi che galleggiano nel terreno di coltura indicano la crescita e la vitalità (si veda anche la Figura 4C) ottimale. Dopo 24 ore formano colonie sulla superficie del piatto di coltura tissutale. 30- 50% di confluenza indica densità ottimale.
5. 24 ore dopo aver impostato il pallone di coltura filatore aggiungere 500 ml di mezzi freschi (MEM, il 10% FBS) integrato con igromicina B (100 mg / ml). 24 ore più tardi ripetere questo passaggio.
6. 72 ore dopo aver impostato la cultura filatore, aggiungere 1,000 ml di MEM mezzi freschi (10% FBS) con igromicina B (100 mcg / ml) con conseguente un volume totale di 3 L di sospensione cellulare.
7. 24 ore dopo aver raggiunto avolume di tre litri, raccolto 116 cellule in sospensione mediante centrifugazione per 10 min a 500 xg a RT. Scartare il surnatante. Mantenere il pallone di coltura filatrice svuotato sotto il cofano coltura di tessuti.
8. Pellet cellulari Risospendere in MEM fresco integrato con 5% di FBS pipettando su e giù per circa 8- 10 volte per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Il volume del mezzo dipende dal fatto lisato dal punto 2.10) 2. (19.5 ml, vedere il punto 4.8) 1. opzione a) o di un magazzino virale purificata di HCAdV dal punto 5.9) 2. (diversi microlitri depanding sul titolo virale, vedere il punto 4.8) 2., l'opzione b) viene utilizzato per l'infezione delle cellule. Utilizzare un volume totale di 150 ml.
   1. Opzione A: Per l'infezione di 116 cellule in sospensione con lisato da P3 (amplificazione primario) le cellule di trasferimento dal punto 4.8) per una bottiglia di stoccaggio da 250 ml dotato di una sterile ancoretta magnetica o un pallone filatore 250ml piccola scala e co-infettare le cellule con il virus all'interno del lisato da P3 (punto 2.10.2) e 2 TU di HV per cella. Assumendo una densità di 3x10 ⁵ cellule per ml, il numero totale di cellule è 9x ¹⁰ 8 cellule. Così aggiungere 1.8x ¹⁰ 9 TU della HV.
   2. Opzione b: per infezione di 116 cellule in sospensione con purificata magazzino virale, le cellule di trasferimento dal punto 4.8) ad una bottiglia di stoccaggio da 250 ml dotato di una sterile ancoretta magnetica o un pallone filatore 250ml piccola scala e co-infettare le cellule con le particelle virali 100 per cella di HCAdV precedentemente purificato (dal punto 5.9) 2.). Così aggiungere 9x 10 ¹⁰ VP secondo titolo fisica (misurata mediante assorbimento a 260 nm; punto 6) del HCAdV purificata e 1,8x ¹⁰ 9 TU della HV.
9. Mescolare la miscela di cellule-virus da SEP 4.8.1) o 4.8.2) su un agitatore magnetico in incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO _{2 per} 2 ore a 60 rpm. Assicurarsi che la bottiglia di archiviazione non è completamente chiuso per permettere la circolazione dell'aria.
10. 2 hr post-infezione trasferire il volume totale della miscela di cellule-virus indietro nel culto filatore 3 lpallone ure e aggiungere 1.850 ml di fresca pre-riscaldato (37 ° C) MEM multimediale integrata con 5% FBS ad un volume totale di 2 L e incubare nell'incubatore coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO _{2 per} 48 ore a 70 rpm.
11. Celle di raccolta per centrifugazione per 10 min a 890x g a RT in 500 ml provette da centrifuga. Rimuovere medio e risospendere le cellule pellet in un volume totale di 28 ml di DPBS. Pipettare su e giù per ottenere una sospensione omogenea. Congelare la sospensione cellulare-virus in azoto liquido o a -80 ° C fare in modo che la sospensione è completamente congelato. Conservare la sospensione cellulare-virus a -80 ° C fino a partire purificazione virus.

5. Purificazione e Dialisi di HCAdV

1. Per preparare lisato virale per cloruro di cesio (CsCl) gradienti, congelare sospensione cellulare-virus dal punto 4.11) in azoto liquido e scongelamento a bagnomaria a 37 ° C per quattro volte.
2. Centrifugare il lisato virale a 500 xg per 8 min a RT e raccogliere il surnatante contenente il HCAdV.
3. Per preparare soluzioni ultracentrifugazione CsCl come follows.Weigh 37,5 g (per 1,5 g / cm ^3), 33,5 g (per 1,35 g / cm ^3), e 31,25 g (per 1,25 g / cm ³⁾ di polvere rispettivamente CsCl e riempire con dH _{2 O} a 25 ml.
   1. Stirr fino soluzione diventa filtro trasparente e sterili le soluzioni. Infine rimuovere 1 ml di ciascuna soluzione e si pesa su una multa scala per verificare montone castrato la densità è corretto. 1ml dovrebbe pesare 1,5 g, 1,35 e 1,25 g rispettivamente.
   2. Se la densità è troppo alta regolarla graduale aggiunta di piccoli volumi (microlitri) di dH ₂ O. sterile Dopo l'aggiunta di _dH 2 O misura nuovamente il densitiy. Se necessario aggiungere più dH ₂ O.
   3. Ripetere la procedura fino a quando la densità è corretta. Se la densità è troppo bassa regolare aggiungendo piccole quantità di polvere CsCl. Filtro sterile di nuovo e controllare la densità. Se la densità è troppo alta registrarli da adding dH ₂ O come descritto prima. Se la densità è ancora troppo basso aggiungere mor CsCl, filtro sterile di nuovo e controllare la densità. Ripetere la procedura fino a quando la densità è corretto.
4. Preparare gradienti passo CsCl in sei tubi ultracentrifuga chiare. Cautela e lentamente pipettare soluzioni CsCl nelle provette con il seguente ordine: 0,5 ml di 1,5 g / cm ³ soluzione CsCl, 3 ml di 1,35 g / cm ³ soluzione CsCl e 3,5 ml di 1,25 g / cm ³ soluzione CsCl (Figura 2C) .
5. Overlay ~ 4,5 ml di surnatante eliminato vettore dal punto 5.2) sulla parte superiore del g / ^cm 3 CsCl strato 1.25. Centrifuga i gradienti in un'ultracentrifuga con uno swing fuori rotore (SW-41) a 12 ° C per almeno 2 ore a 226.000 xg (35.000 rpm) con lenta accelerazione e decelerazione per HCAdV genoma separato contenente particelle virali da particelle vuote e cellulare detriti.
   NOTA: In condizioni ottimali una banda diffusa di formes detriti cellulari in cimai tubi. Qui di seguito si possono osservare due bande bianche. La fascia superiore contiene particelle vuote mentre la banda inferiore è uguale al HCAdV (Figure 2C e 5A).
6. Rimuovere con attenzione gli strati di detriti cellulari e le particelle vuote e raccogliere 1 ml delle fasce più basse di ogni tubo e il virus di trasferimento con un puntale pulito in una provetta sterile da 50 ml. Aggiungere fino a 24 ml di 1,35 g / cm ^{3 Soluzione} CsCl alle particelle virali raccolti e miscelare accuratamente.
7. Riempire provette con 1,35 g / cm ^{3 Soluzione} CsCl-virus al O superiore e centrifugare / N (18- 20 h) a 226.000 xg (35.000 rpm) a 12 ° C in un'ultracentrifuga usando un'oscillazione fuori rotore (SW-41 ) con lenta accelerazione e decelerazione.
8. Raccogliere il HCAdV presente nella fascia inferiore prominente. Come un potenziale fascia superiore contiene particelle vuote rimuovere gli strati superiori dall'alto con una pipetta (vedi figure 2C e 5B) Quindi togliere la usi banda inferioreng una pipetta.
9. Dializzare le particelle del virus raccolti per lo scambio di buffer.
   1. Tagliare una striscia di tubo di dialisi (MWCO: 50.000) di circa 8 cm di lunghezza, lavarlo con dH _{2 O} sterile per tre volte. Quindi chiudere un lato del tubo di dialisi con una fascetta in plastica e trasferire il virus raccolto dal punto 5.8) in tubi con una pipetta 1 ml. Evitare bolle d'aria all'interno del tubo e chiuderlo sull'altro lato con un morsetto di plastica chiusure dialisi.
   2. Dializzare in 1 litro di tampone di dialisi (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glicerolo e 1 mM MgCl ₂ in deionizzata H _{2 O)} per 2 ore a 4 ° cwith lenta agitazione. Tampone di dialisi Exchange con 2 litri di tampone di dialisi e dializzare O / N a 4 ° C con lenta agitazione. In alternativa utilizzare un sucrosebuffer (140 mM NaCl, 5 mM Na ₂ HPO ₄ x2H ₂ O, KH saccarosio 1,5 mM mM ₂ PO ₄ e 730, pH 7,8).
   3. Raccogliere particelle di virus dializzati dal punto 5.9) 2. utilizzando un 1 ml di pipette. Preparare diverse aliquote di piccoli volumi desiderati (25- 100 mL) e conservare virus purificato a -80 ° C.

6. Misurare il titolo fisica dei preparativi finali per HCAdV densità ottica (OD)

1. Diluire 25 ml di preparazione vettore finale dal punto 5.9) 2 con 475 ml di tampone di lisi (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0), 0,5% SDS)), agitare delicatamente per 20 min a RT ed infine centrifugare per 2 minuti a temperatura ambiente a 15.000 x g.
2. Dal momento che i valori di assorbanza a 260 nm (A260) sono generalmente bassi, misurare l'assorbanza quattro volte con 100 ml di surnatante e calcolare il valore medio delle quattro misure. Calcolare il numero di particelle virali per ml (vp / ml ^-1) con la seguente formula: VP / ml ^-1 = (A260 media) x (20) x (1,1 x 10 ¹²⁾ x (36 kb formato / HCAdV in kb ).
   NOTA: I risultati di una resa tipica di particelle virali assoluti (OD titolo anticorpale) sono mostrati nella Figura 7A . L'esperienza dimostra, che il titolo OD sovrastima il numero di particelle virali. Particelle virali assoluti misurati da OD possono essere 20- 100 volte superiore rispetto particelle virali infettive misurati da q-PCR. Per una misurazione più precisa delle particelle HCAdV absolte e infettive e la contaminazione HV da q-PCR riferimento alla sezione 7.

7. Misurare totale di particelle, Unità Infettive del HCAdV e livelli di contaminazione HV in Finale vettore Preparazione per qPCR. Un schema del procedimento di titolazione è mostrato in figura 6

1. Seed cellule HEK293 in 6 o 12 piastre di coltura di tessuti e cellule in modo che raggiungano il 90% di confluenza il giorno successivo. Per determinare il numero di particelle virali infettive (titolo infettiva), infettare le cellule di un pozzetto in una piastra a più pozzetti con 1 ml e un secondo pozzo con 10 ml di virus purificato dal punto 5.9) 3.
2. Celle di raccolta posta infezione 3 ore. Rimuovere medie e aggiungere tripsina per coprire l'intero pozzetto e incubare a 37 ° C e 5% CO _{2 per} 5 min. Lavare via le cellule con la tripsina con una pipetta e centrifugare le cellule a 890 xg per 3 minuti a temperatura ambiente.
3. Risospendere le cellule pellet in 200 ml di DPBS e lavarli accuratamente per rimuovere liberi (non infettiva) particelle di vettore. Centrifugare per 3 minuti a 890 xga RT. Scartare il surnatante e risospendere pellet cellulari in 200 ml di DPBS fresco.
   Nota: Per l'esatta determinazione del titolo infettiva, è fondamentale per rimuovere tutte le particelle virali non infettive dalle superficie delle cellule dalla tripsina trattamento e lavaggio accurato.
4. Per determinare il numero totale di particelle virali (particelle infettive e particelle non infettive = titolo fisico), il raccolto non infettato cellule HEK293 da due pozzi senza tripsina da vampate di calore fuori le cellule con il loro terreno di coltura con una pipetta.
5. Centrifugare le cellule per 3 min a 890 xg a RT. Eliminare il medio e sospendere nuovamente le cellule appallottolati in 200 ml di DPBS. Subsequently aggiungere 1 ml e 10 ml di preparazione HCAdV purificata direttamente alle cellule, rispettivamente. Utilizzare cellule non infette come sfondo, per assicurare le stesse condizioni per l'isolamento e la successiva gDNA q-PCR.
6. Isolare gDNA da cellule HEK293 derivati ​​dalle fasi 7.3) e 7.5)
   1. Vortex cellule risospese in 200 ml di DPBS (passo 7.3 e 7.4) per 3 secondi, aggiungere 200 ml di soluzione di SDS. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0), 0,5% SDS) e 20 ml proteinasi K (20 mg / ml) e la sospensione vortex per 3 sec. Incubare 12- 16 ore a 55 ° C e agitare lentamente. Poi aggiungere 2 ml di RNasi A (20 mg / ml) e incubare per 30 min a 37 ° C.
   2. Aggiungere 350 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e centrifugare per 2 minuti a 15.000 x g. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e ripetere questo passaggio una volta
   3. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, aggiungere 50 ml di acetato di sodio (pH 5, 3 M) e 1 ml di ghiaccio freddo EtOH (99,8%) e mescolare sospensione. Centricampioni Fuge per 10 minuti a 15.000 xg a pellet DNA genomico.
   4. Quindi rimuovere il surnatante, aggiungere 500 ml di 70% EtOH e centrifugare per 2 minuti a 15.000 x g. Rimuovere il surnatante, aggiungere 500 ml di 70% EtOH e agitare per 30 minuti a temperatura ambiente. Poi centrifugare per 2 minuti a 15.000 x g.
   5. Rimuovere il surnatante e pellet di DNA asciugare all'aria. Do pellet di DNA non secco per un lungo periodo di tempo, in quanto sarà più difficile ottenere gDNA in soluzione. Risospendere il pellet di DNA in 120 ml di dH ₂ O e incubare per 1 ora a ~ 37 ° C sotto agitazione. Se soluzione di DNA appare viscosa, agitare per diverse ore a 37 ° C, o incubare a 55 ° C per 1 ora ~.
7. Per determinare infettive HCAdV-particelle e assolute HCAdV-particelle, generare una curva standard di 10 ^{AGOSTO 1-10} copie di un plasmide portare il governo indiano contenuti nel genoma HCAdV.
8. Determinare le particelle totali e particelle infettive, analizzando le stesse quantità di gDNA di infetti HEK293 cells dal punto 7.3) e 7.4) si applicano qPCR con 400 Nm di primer specifici per il governo indiano contenuti nel genoma HCAdV.
9. Impostare il programma PCR come segue: pre-incubazione a 95 ° C per 10 minuti, in 40 cicli di amplificazione di 95 ° C per 10 sec, 55 ° C per 10 sec e 72 ° C per 20 sec. Sulla base della curva standard (passo 7.7), interpolare il numero totale di genomi adenovirali nella reazione.
10. Calcolare il numero di genomi adenovirali nella preparazione vettore finale utilizzando il seguente formulario: (Numero di HCAdV / peso in ng di gDNA nella reazione) x (peso in ng di DNA di tutte le cellule nel piatto infetto virus / volume in microlitri) .
    NOTA: L'intervallo tipico di particelle virali e infettive rendimenti assoluti sono circa 1x10 ⁷ -1x10 ⁸ virale particelle / ml. I titoli che sono dieci volte superiori o inferiori mostrato qui possono essere considerati come normale. I titoli più alti sarebbe un miglioramento. Per quanto riguarda il rapporto tra HCAdV partic assolutoles alle particelle HCAdV infettive, l'esperienza dimostra che circa il 5- 10% di particelle HCAdV assoluti sono infettive (Figura 7A).
11. Per determinare i livelli di contaminazione con HV, eseguire qPCR amplificando una parte del gene adenovirale ritardo 3 (L3) presenti nel genoma HV. Utilizzare un plasmide che trasportano il gene adenovirale tardi 3 (L3) per generare una curva standard (passo 7.7).
12. In questa reazione applicare 400 Nm del primer L3 forward 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'e L3 inversa 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3' insieme con 300 Nm della sonda specifica per L3 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
13. Impostare il programma PCR come segue: preincubazione / attivazione a 95 ° C per 10 min, amplificazione durante 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min. Utilizzare qualsiasi sonda universale PCR Mastermix per la reazione qPCR. Sulla base della curva standard (passo 7.7), calcolare il numero di ininfettive particelle HV nella preparazione vettore finale. Vedere (Figura 7A) per le rese tipiche di particelle ad alta tensione.
14. Infine calcolare il rapporto di particelle infettive assoluti dei HCAdV a livelli di contaminazione HV per valutare la qualità della preparazione vettoriale.
    NOTA: Finora una piccola porzione del restante HV non può essere esclusa. Di solito la percentuale di contaminazione HV è ~ 5% di particelle infettanti o meno, che è accettabile (Figura 7B). Naturalmente il meno possibile HV è auspicabile, soprattutto se il preparato vector sta per essere utilizzato per esperimenti sugli animali.

Risultati

Sono mostrati esempi qui rappresentativi per la clonazione, l'amplificazione e la purificazione di preparati HCAdV. Una panoramica della strategia di clonazione (figura 1) ed esempi rappresentativi per la clonazione e il rilascio del genoma HCAdV da enzima di restrizione digerire sono forniti (Figura 2). Un modello di restrizione tipico dopo il rilascio della cassetta GOI-espressione da pHM5 da PI- Sce I e I-Ceu io digerisco e estra...

Discussione

Il protocollo presentato qui permette la purificazione di vettori HCAdV basati su adenovirus umano di tipo 5 basato su procedure descritte in precedenza ^4,12. Il genoma HCAdV all'interno del plasmide pAdFTC è privo di tutti i geni di adenovirus e porta solo le 5'- e 3'ITR e il segnale di confezionamento. In questa strategia l'HV AdNG163R-2 ⁴ offre tutti i geni necessari per la produzione di virus efficiente in trans. Questo offre una capacità di confezionamento di fino a ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	restriction digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restriction digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	selection of CRE expressing 116 cells
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 cell culture medium
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle	Sigma	CLS430281-24EA	infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask	Bellco	1965-61030	growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes	Beckmann Coulter	344059	density gradient centrifugation
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes	Thermo	66383	dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305	tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 touch	Biorad		qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carl Roth	A156.1	purification of DNA
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	density gradient centrifugation
sodium acetate 99%	Carl Roth	6773.2	DNA precipitation
LB medium	Carl Roth	X968.3	bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure	Carl Roth	9065.5	DNA precipitation and washing
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	lysis  buffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	lysis  buffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	dialysis buffer
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	dialysis buffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional dialysis buffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional dialysis buffer
sucrose	Carl Roth	9286.1	optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	optional dialysis buffer
1.5-ml tubes	sarstedt	72,730,005	storage of virus preparations at -80 °C