גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

Summary

פיתחנו מבחן גירוי בעיניים אשר מנצל מודל רקמת האפיתל שלושה כמו קרנית-ממדי משוחזר אנושי (RHCE). המבחן הוא מסוגל להבחין בין גירוי העיני וחומרים מאכלים (קטגוריות GHS 1 ו -2 משולבים) ואלה שאינם דורשים תיוג (GHS אין קטגוריה).

Abstract

כדי לעמוד בתיקון השביעי לחקיקת הוראת הקוסמטיקה והאיחוד האירופי REACH של האיחוד האירופי, שיטות חלופיות שאינם בעלי חיים תוקף להערכה אמינה ומדויקת של רעילות עינית באדם יש צורך. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו מבחן גירוי בעיניים (EIT) אשר מנצל מודל תלת ממדים משוחזר אדם אפיתל כמו קרנית (RHCE) רקמה המבוסס על תאים אנושיים רגילים. EIT הוא מסוגל להפריד חומרים מגרים עיניות וחומרים מאכלים (קטגוריות GHS 1 ו -2 משולב) ואלה שאינם דורשים תיוג (GHS אין קטגוריה). המבחן מנצל שני פרוטוקולים נפרדים, אחד מיועד לכימיקלים נוזליים ופרוטוקול שני, דומה למאמרי מבחן מוצקים. מודל חיזוי EIT משתמש תקופת יחידה חשיפה (30 דקות לנוזלים, 6 שעות למוצקים) וכדאיות רקמות חתך בודד (60.0% כפי שנקבע על ידי assay MTT). על סמך התוצאות עבור 83 כימיקלים (44 נוזלים ומוצקים 39) EIT השיג 95.5 / 68.2 / 81.8 וsens%itivity / סגוליות ודיוק (SS ו) לנוזלים, 100.0 / 68.4 / 84.6% ואס-אס ולמוצקים, ו97.6 / 68.3 / 83.1% ולאס-אס וכולל. EIT יתרום באופן משמעותי לסיווג הפוטנציאל לגירוי העיני של מגוון רחב של כימיקלים נוזליים ומוצקים, ללא שימוש בבעלי החיים כדי לעמוד בדרישות רגולציה בדיקות. שיטת EpiOcular EIT יושמה בשנת 2015 להנחיות מבחן ה- OECD כTG 492.

Introduction

מוצרים צריך, כגון מוצרי קוסמטיקה, חומרי ניקוי, חומרי ניקוי ביתיים וכוללים מגוון רחב של חומרים כימיים העלולים לגרום לניזק רציני אם הם לפנות לעיניים. לכן, בדיקה של סוכנים אלה לגירוי בעיניים נדרשת על ידי הרשויות הרגולטוריות בארה"ב ובאיחוד האירופי כדי להבטיח את בטיחות צרכן ^1. הערכת פוטנציאל הגירוי בעיניים של תערובות וניסוחים גם דרישה לעמידה בREACH (רישום, הערכה, אישור, והגבלה של כימיקלים) חקיקה לתיוג של מרכיבים קוסמטיים תחת קוסמטיקת הנחיית האיחוד האירופי להובלת כימיקלים, ול התיוג של חומרי הדברה ומוצרים ביתיים ^2. נכון לעכשיו, סוכנויות רגולציה דורשות הערכת סיכונים עינית באמצעות השיטה המתואמת הגלובלי של סיווג ותיוג של כימיקלים (GHS) ^3. GHS מתבסס בעיקר על מבחן הגירוי בעיני דרייז, assay הגירוי בעיניים הנפוץ ביותר שבו חומרים זרים ומילxtures הציג ישירות לתוך שק הלחמית של העין ארנב ^4. על פי סיווג GHS, קטגוריה GHS 1 (חומרים מאכלים עיני) מתייחסת לבדיקת כימיקלים שגורמים לפגיעה ראשונית חמורה לרקמות העין או הנזק חמור לעין והראייה שאינה הפיך במלואו בתוך 21 ימים לאחר חשיפת ^3.5. GHS קטגוריה 2 מתייחסת לבדיקת כימיקלים שמייצרים שינויים משמעותיים בעיניים כי הם הפיכים לחלוטין בתוך 21 ימים מחשיפה. כימיקלים מבחן שאינם מאכלים או חומרים מגרים מכונים קטגוריה GHS לא.

במשך יותר מ -40 שנים, בדיקת עיני ארנב דרייז זכתה לביקורת על החוסר של שחזור, הערכת יתר של תגובות אנושיות, והשימוש בבעלי החיים ^5-8. חששות אלה עודדו את הצעות רבות לעידון, צמצום, והחלפת in vivo המבחן ^9. הצורך בחלופות שאינן בעלי חיים תוקף התחזק עוד יותרעל ידי אימוץ התיקון השביעי לקוסמטיקת ההוראה, שאסר על השימוש בבעלי החיים בהערכת הבטיחות של מוצרי קוסמטיקה (בשנת 2005) ומרכיבים (בשנת 2009) ^2.

מאז 1996, מודל הרקמה כמו קרנית-שוחזר כבר בשימוש נרחב על ידי תעשיית הקוסמטיקה להעריך את פוטנציאל הגירוי של חומרי גלם, ניסוחים מבוססי פעילי שטח, ונוסף תערובות המיועדות לשימוש ב, או בקרבת, עין ^10-13. שימוש במודל רקמת RHCE מאפשר יישום מקומי ישיר של החומר למבחן על פני השטח הרקמה בצורה מקורית, החייה. בדרך זו, ניתן לבדוק ניסוחים מסיסים שאינם מים מבלי לדלל אותם עם ממסים. בתגובה לשל ECVAM EURL (המעבדה ההפניה איחוד האירופי מרכז האירופי לתיקוף השיטות חלופיות) בקשה לשיטה נרחבת ישימה, פשוטה, וכלכלית מבחן גירוי בעיניים (EIT) אשר מנצל Singlזמן חשיפת דואר, והוא מסוגל להפריד בין חומרים מגרים ומאכלים עיני מחומרים שאינם דורשים תיוג פותח (איור 1) ^14. על סמך התוצאות עבור 83 כימיקלים (44 נוזלים ו -39 מוצקים), EIT השיג 95.5 / 68.2 / ו81.8% רגישות / סגוליות ודיוק (SS ו) לנוזלים, 100.0 / 68.4 / ו84.6% SS ולמוצקים, ו97.6 / 68.3 / 83.1% ולאס-אס וכולל.

בשינה 2007, בחסות הקוסמטיקה אירופה (לשעבר Colipa) בחסות ECVAM EURL מחקר מראש אימות רבת-מעבדה העריך את הרלוונטיות ואמינות של EIT במטרה להביא אותו לאימות פורמאלית ^15. במחקר זה, 298 ניסויים עצמאיים בוצעו בשבע מעבדות עצמאיות. תוצאות המחקר הראו הסכם 99.7% בתחזית עם מקדמים נמוכים של וריאציה בכל המעבדות משתתפות ^15. כתוצאה מכך, בשנת 2010 הפרוטוקול EIT נכנס EURL ECVAM רשמיתכנית אימות. מחקר האימות מנוצל 104 כימיקלים מבחן מקודדים, כוללים חומרים אישיים ותערובות כימיות, אשר נתונים התייחסות in vivo (נתונים גירוי בעיני דרייז) היו זמינים. בהתבסס על ההצלחה של עבודה זו, קו מנחה טיוטת מבחן OECD הוגש בשנת 2014. זה צפוי כי EIT יתרום באופן משמעותי לסיווג פוטנציאל לגירוי עיני של מגוון רחב של חומרים על פי שיטת הסיווג ותיוג של האו"ם GHS.

Protocol

1. הכנת RHCE הרקמות לטיפול - יום 0

1. עם קבלת ערכת אפיתל כמו קרנית-האנושי המסחרי (RHCE), לבדוק את כל מרכיבי הערכה לשלמות (לפרטים ערכה לראות תקן Assay ערכת הרכיבים (טבלת 1) וציוד וחומרים הנדרשים לביצוע assay EIT (הטבלה 2). ביום יום הקבלה, לאזן רקמות (במכל 24 גם המשלוח שלה) לRT במשך 15 דקות.

הסכום	מגיב	תנאים	מקור	תיאור	תאריך תפוגה
1	צלחת 24 גם אטומה של רקמות EpiOcular (OCL-200)	2-8 מעלות צלזיוס	MatTek	מכיל 24 TissUES של תרבית תאים מוסיף, חבילה על agarose	72 שעות
בקבוק 1, 200 מיליליטר	EpiOcular Assay בינוני (OCL-200-ASY)	2-8 מעלות צלזיוס	MatTek	בינוני מבוסס DMEM	21 ימים
בקבוק 1, 100 מיליליטר	Ca ++ Mg ++ -חינם Dulbecco's-PBS (DPBS)	RT	סיגמא אולדריץ, D5652, או equiv.	המשמש לשטיפה מוסיף	1 שנה
4	6-גם צלחות	RT	פלקון	משמש לשמירה על רקמות במהלך פרוטוקול assay	NA
2	12-גם צלחות	RT	פלקון	שימוש במהלך פרוטוקול assay	NA
2	24 גם צלחות	RT	פלקון	משמש לביצוע assay MTT	NA
בקבוקון 1, 0.5 מיליליטר	מתיל אצטט (CAS # 79-20-9)	RT	סיגמא אולדריץ, חתול # 186,325	משמש כמחשב בassay	1 חודש

טבלת 1: תקן רכיבי ערכת Assay.

ציוד / חומרים	נחוץ ל:
חממת humidified (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 90 ± 10% לחות)	רקמות דוגרות לפני ובמהלך מבחני
הזרימה למינרית	עבודה בטוחה בתנאים סטריליים
משאבת ואקום (אופציונאלי)	Aspirating בינוני ופתרונות
פוטומטר צלחת-קורא (ל96-גם צלחות)	הקריאה OD
שייקר צלחת	תמציתיון של formazan
מלקחיים סטריליות, קצוות קהים	טיפול מוסיף רקמה
לעצור שעונים	עיתוי היישום של חומרי בדיקה וצעדים בעיתוי אחרים בפרוטוקול
אמבט מים (37 ± 1 ° C)	תקשורת מתחממת ופתרון MTT
מכתש ועלי	טחינת מוצקים גרעיניים
פיפטה תזוזה חיובית (50 μl)	יישום של חומרים והשעיות צמיגים וחצי מוצקים
טפטפות מתכוונן (200-2 μl מיליליטר)	יישום של חומרים נוזליים, בינוני assay וMTT
טיפים מעוקרים מראש (200 μl ו -20 μl), Rainin החתול # HR-200F וHR-20F (או שווה ערך)	יישום של חומרים נוזליים, בינוני assay וMTT
טיפים פתח רחב-מעוקר מראש (250 μl), Rainin החתול # HR-250WS (או equivalent)	יישום של חומרים והשעיות צמיגים וחצי מוצקים
8 עוז / 220 מיליליטר הדגימה מכולות, פלקון חתול # 3,540,200 (או שווה ערך)	שטיפת רקמות
מזרקים חד-שימוש סטרילי (למשל 1 מיליליטר tuberkulin מזרק Omnifix-F, B. Braun Melsungen AG, חתול. מס '9161406V)	משלוח ~ 50 מ"ג חומרים מוצקים (לא חובה)
טד פלה מייקר מרית / כף, טד פלה Inc, חתול # 13504 (או שווה ערך, מגרדת כף או עצם חדה, למשל Aesculap, לא: FK 623)	משלוח ~ 50 מ"ג חומרים מוצקים
Ca ++ Mg, ++ ופר פוספט של Dulbecco החופשי (Ca ++ Mg ++ חינם-DPBS): סיגמא אולדריץ, D5652 חתול # (או שווה ערך)	רקמות שטיפה במהלך assay
תרבות כיתה מים ללא יונים, רקמות סטריליים (איכות ביולוגית או שווה ערך)	השתמש כNC
96-גם צלחות שטוחות תחתונה, פלקון (או שווה ערך)	לקריאת OD
חילופי קצה כותנה (סטרילי)	לייבוש שטח הרקמות (אופציונאלי)
סקוטש או Parafilm	כיסוי צלחות במהלך חילוץ formazan
ערכת assay MTT-100	מכיל מגיב MTT-Thiazolyl הכחול tetrazolium ברומיד (Sigma # M-5655) וisopropanol תמצית.

טבלה 2: ציוד וחומרים הנדרשים לביצוע EIT.

2. בתנאים סטריליים, פתח את שקית הניילון המכילה את צלחת 24 גם עם רקמות RHCE ולהסיר את הגזה סטרילית. בדוק את כל הרקמות לבועות אוויר בין agarose ג'ל ולהכניס. אל תשתמשו בתרבויות עם בועות אוויר מתחת לכיסוי ההוספה <50% מהאזור להוסיף, הרקמות פגומות, או WHI רקמות פרק מכוסה לחלוטין בנוזל.
3. תווית 6 הצלחות גם עם מאמר המבחן או קודי בקרה וזמני חשיפה. 1.0 מיליליטר aliquot של assay בינוני (מסופק עם הערכה), טרום חימם עד כ 37 מעלות צלזיוס, לתוך הבארות של 6-גם צלחות שכותרתו מראש.
4. שימוש במלקחיים סטרילי כדי להסיר כל להכניס המכיל את רקמת RHCE ולמקם את הכנס בצלחת 6-גם שהכותרת. במהלך שלב זה, להסיר כל agarose משלוח שנותר ששומר על הצדדים החיצוניים של להכניס את ידי סופג בעדינות על נייר סינון סטרילי. לשחרר את כל בועות אוויר שנלכדו מתחת מוסיף.
5. טרום דגירה רקמות RHCE ב6-גם צלחות לתנאים סטנדרטיים תרבות (SCC, אווירת humidified עם 5 ± 1% CO ₂ ב 37 ± 1 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1.
6. אחרי שעה 1, להחליף את Assay בינוני עם 1.0 מיליליטר של טרי Assay בינוני prewarmed עד 37 ° C דגירה רקמות RHCE בתנאי SCC (לילה = O / N) (HR 16-24).

"> 2 קדם-טיפול ove_title -. יום 1

1. לאחר O / הדגירה N, תחול 20 μl של Ca ^{2 +} Mg ^{2 +} בופר פוספט של -חינם-Dulbecco (DPBS, ובלבד) באמצעות מכשיר pipetting מתאים. אם DPBS לא התפשט על פני הרקמות, לטפוח בעדינות להוסיף על הצלחת כדי להבטיח שDPBS מרטיב את כל פני השטח של הרקמות.
2. דגירה רקמות RHCE בSCC במשך 30 ± 2 דקות.
   הערה: שלב זה הוא הכרחי ללחות רקמה ולחקות בתנאי vivo.

3. נהלי חשיפה מבחן חומר

1. החל כל מאמר מבחן ובקרות לשכפל רקמות RHCE (n = 2). הליך מינון מאמר מבחן שונה לנוזלים ומוצקים. מריחה להחיל 50 μl מאמרי מבחן נוזל בעזרת פיפטה. החשיפה לנוזלים הזמן הוא 30 דקות. החל 50 מ"ג של מאמרי מבחן מוצקים באמצעות כפית מפולסת (מכוילת להחזיק 50 מ"ג של נתרן כלורי). לשעברposure זמן למוצקים הוא 6 שעות.
   הערה: נוזלים מוגדרים כחומרי נוזל (למשל, נוזלים, ג'ל, ומשחות) שיכול להיות מיושמים תוך שימוש במכשיר pipetting. מוצקים מוגדרים כחומרים שאינם נוזל (למשל, אבקות, חומרי שרף או שעווה) שלא ניתן ליישם באמצעות פיפטה.
   1. אם מצבו הגופני של מאמרי מבחן לא קל לקבוע, למקם את צלוחיות עם מאמר מבחן באמבט מים במשך 15 דקות (37 מעלות צלזיוס). עקוב פרוטוקול EIT לנוזלים למי מאמרי מבחן שנוזל על 37 מעלות צלזיוס.
   2. השתמש פיפטה תזוזה חיובית לחומרים צמיגים במיוחד.
2. מנה הביקורת השלילית ובקרות חיוביות ראשונה ולאחר מכן מינון מאמרי מבחן.
   1. החל 50 μl של הבקרה השלילית (NC) והבקרה החיובית (PC) לרקמות RHCE בעזרת פיפטה סטנדרטית. NC הוא מים מיוננים סטרילי; המחשב הוא מתיל אצטט (CAS # 79-20-9). החל NC והמחשב למשך 30 דקות כאשר מבחןing מאמרי מבחן נוזליים ובמשך 6 שעות כאשר בודקים מאמרי מבחן מוצקים.

חשיפה מאמר מבחן 4. - יום 1

1. לטיפול במאמרי מבחן נוזליים, בצע את לוח הזמנים של התזמון נתון בטבלה 3. השאר דקות במרווחי 1 בין יישומי כל מאמר מבחן על מנת להבטיח חשיפה שווה לכל הרקמות.
   1. לאחר דקות 30 ± 2 DPBS טיפול מראש, מריחה להחיל 50 μl של NC ומחשב, וכל מאמר מבחן נוזל מריחה על רקמות RHCE באמצעות מכשיר pipetting מתאים.
   2. החל 50 μl של מאמר מבחן הנוזל ישירות על הרקמה כדי לכסות את פני השטח העליונים. חותך את נקודת קצה פיפטה הצרה להרחיב את פתח לחומרים צמיגים. לחומרים צמיגים מאוד, להחיל את מאמר מבחן למכשיר מינון (גליל בראשות שטוח בקוטר מעט פחות מהקוטר הפנימי של להכניס את הרקמה או נעץ פלסטיק), להפוך את ד המינוןevice ולמקם אותו על הרקמה, כך שמאמר המבחן באופן שווה אנשי קשר פני השטח הרקמות.
   3. אם מאמר מבחן לא התפשט על פני הרקמות, לטפוח בעדינות להכניס לוודא כי הוא מתפשט על פני השטח כל הרקמה. הנדסת הפצה של מאמרי המבחן (למשל, עם קצה פיפטה) אינו מומלצת שכן הוא עלול לגרום נזק לרקמות.
   4. דגירה הרקמות בSCC במשך 30 ± 2 דקות.
2. לטיפול במאמרי מבחן מוצקים - יום 1, בצע את לוח הזמנים של התזמון נתון בטבלה 4 השאר 2 דקות במרווחים בין היישומים של כל מאמר מבחן על מנת להבטיח חשיפה שווה לכל הרקמות..
   1. לאחר דקות 30 ± 2 DPBS טיפול מראש, תחול 50 μl של NC ומחשב מקומי על רקמות RHCE באמצעות מכשיר pipetting מתאים.
   2. ליישום מאמר מבחן מוצק, להסיר את מוסיף (n = 2) מהבאר ומניחה אותם על משטח סטרילי (למשל, את המכסה של בוקרצלחת ultiwell) כדי להימנע ממאמר מבחן שפיכה לתוך המדיום.
   3. בעזרת כף מפולסת, מריחה להחיל כ -50 מ"ג של מאמר המבחן על פני השטח הרקמות; לוודא כי פני השטח של הרקמה מכוסה לחלוטין על ידי מאמר המבחן. אם מאמר המבחן לא התפשט על פני הרקמות, לנער את הכנס בעדינות מצד לצד כדי לוודא שהרקמה מכוסה לחלוטין על ידי מאמר המבחן. הנדסת הפצה של מאמרי המבחן (למשל, עם קצה פיפטה) אינו מומלצת שכן הוא עלול לגרום נזק לרקמות.
      1. במידת הצורך, לטחון אבקות גבישים עם מכתש ועלי כדי להבטיח מגע טוב יותר בין מאמר המבחן והרקמות.
      2. לחלופין, אבקות מקום ישירות על תרבית הרקמה בתוך הכנס באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם הראש שלו מנותקות. אבקות דברים לתוך המזרק כאשר הבוכנה נמשכת בחזרה ולאחר מכן להחיל על ידי לחיצה על הבוכנה כלפי מטה.
      3. אם הקיר החיצוני של להכניס אותו גontaminated למשל, על ידי אבקות, לנגב את החלקיקים עם גזה סטרילית.
   4. לאחר מינון, להחזיר את הרקמות ל6-גם צלחות המכילות מדיום התרבות לדגור על SCC במשך 6 שעות ± 15 דקות.

5. שטיפה

1. להכין סט של שלוש כוסות נקיות (150 מיליליטר קיבולת) למאמר מבחן ולמלא כל אחד מהם עם של DPBS 100 מיליליטר. לכל מאמר בדיקה, לנצל סט של שלוש כוסות שונה.
2. בסוף חשיפת 30 ± 2 דקות לחומרים נוזליים או 6 שעות ± 15 דקות חשיפה לחומרים מוצקים, להסיר ולסלק את מכשיר המינון אם זה היה בשימוש.
3. הרם את מוסיף מכיל רקמת RHCE מתוך המדיום ידי אחיזה בקצה העליון של "הצווארון" פלסטיק עם מלקחיים בסדר. שימוש במלקחיים מעוקלים כדי להקל על טיפול וdecanting. יש לשטוף את הרקמות שתיים בכל פעם על ידי לחיצה כפולה מוסיף יחד על ידי צווארוניהם באמצעות מלקחיים. להיות זהיר not לפגוע ברקמות עם המלקחיים.
4. למזוג מאמרי מבחן או בקרות ממשטח הרקמה על חומר סופג נקי (מגבת נייר, גזה, וכו ')
5. טובלים את מוסיף לכוס הראשונה של DPBS, מערבולת בתנועה מעגלית בDPBS לכ -2 שניות, להרים מוסיף, כך שהם בעיקר מלאים עם DPBS, ולמזוג את הנוזל חזרה לתוך הכוס. חזור על תהליך זה שלוש פעמים בכוס הראשונה.
6. יש לשטוף את מוסיף בכוסות השניה ושלישית של פעמים DPBS שלוש כל אחד באותו אופן.
7. למזוג כל נוזל שנותר בכנס על החומר הסופג. סובב את התותב לזווית 45 מעלות (סוף פתוח למטה) משוער ולגעת בשפה העליונה לחומר הסופג.
   הערה: אם לא ניתן להסיר את כל חומר הבדיקה הגלוי, שטיפה לא יותר צריך לעשות כדי למנוע נזק לרקמות עקב טיפול מוגזם.

6. לאחר להשרות

1. לאחר השטיפה,לטבול מייד רקמות ב 5 מיליליטר של assay בינוני חימם בעבר לRT בצלחת 12 גם שכותרתו מראש.
2. דגירה רקמות דקות 12 ± 2 לחומרים נוזליים או 25 ± 2 דקות לחומרים מוצקים שקועים בRT כדי להקל על הסרת כל מאמר מבחן שיורי.

7. לאחר דגירה

1. בסופו של הפוסט-משרים תקופה טבילה, למזוג Assay בינוני מהרקמות ולמחוק מוסיף על חומר סופג.
2. העבר מוסיף לצלחת 6-גם שכותרתו מראש המכילה 1 מיליליטר של חם Assay בינוני.
   1. דגירה הרקמות במשך 120 דקות ± 15 בSCC לחומרי בדיקת נוזל.
   2. דגירה הרקמות במשך 18 ± 0.25 שעות בSCC לחומרי בדיקה מוצקות.

8. MTT הכדאיות Assay - יום 1 (פרוטוקול לנוזלים) ויום 2 (פרוטוקול למוצקים)

1. בצע את assay MTT לאחר פוסט-הדגירה של 12077; 15 דקות לנוזלים ו -18 ± 0.25 שעות למוצקים, בהתאמה.
2. הכן 1.0 מ"ג / מיליליטר פתרון MTT וaliquot 0.3 מיליליטר של הפתרון לכל גם צלחת 24 גם שכותרתו מראש.
   1. השתמש בערכה המסחרית MTT (לוח 5):
   2. 2 שעות לפני השימוש, להפשיר להתרכז MTT ב RT. לשלב 2 מיליליטר של תרכיז MTT ו8 מיליליטר של diluent MTT לייצר 1.0 מ"ג / מיליליטר פתרון MTT.
   3. אחסן את פתרון MTT על 4 מעלות צלזיוס בחושך עד לשימוש. אין לאחסן את פתרון MTT יותר מיום 1.
3. בסוף הדגירה ההודעה, להסיר את כל הכנס מצלחת 6-היטב ובעדינות למחוק בחומר סופג.
4. מניחים את מוסיף לצלחת 24 היטב המכילה 0.3 מיליליטר של תמיסת MTT. לשחרר את כל בועות אוויר שנלכדו מתחת מוסיף. דגירה את הצלחת 180 ± 10 דקות ב SCC.
5. חילוץ MTT
   1. לאחר 180 דגירה ± 10 דקות בפתרון MTT, להסיר כל הוספהמצלחת 24 גם ולמחוק את החלק התחתון של להכניס בחומר סופג.
   2. למאמרים שאינם צבען בדיקת נוזל (מיצוי שקוע): העבר מוסיף לצלחת 24 גם שכותרתו מראש המכילה 2.0 מיליליטר של פתרון extractant (isopropanol), כך שהוא מטביע את הכנס.
   3. למוצקים וצבעים נוזליים (חילוץ כדי למנוע זיהום של פתרון extractant-שקוע שאינו): העבר מוסיף לצלחת 6-גם שכותרתו מראש המכילה 1.0 מיליליטר של פתרון extractant (isopropanol) כך שזה לא להטביע את הכנס.
      הערה: בצע חילוץ שאינו שקוע זהה עבור הפקדים שליליים וחיוביים המקבילים.
6. לאטום את הצלחות (למשל, עם parafilm בין כיסוי הצלחת והקצה העליון של הבארות או עם אוטם צלחת סטנדרטי). מקם את הצלחות על צלחת שייקר מסלולית וללחוץ על 2 עד 3 שעות על RT כדי לחלץ את MTT.
   1. לחלופין, לבצע את החילוץ O / N ב 2-876; C בחושך בלי ללחוץ.
7. למאמרים שאינם צבען בדיקת נוזל (מיצוי שקוע): בתום תקופת ההפקה, למזוג נוזל מכל להכניס בחזרה לתוך הבאר וזורקים מוסיף עם רקמות RHCE.
   1. מערבבים את הפתרון לחלץ ולהעביר שני 200 aliquots μl לתוך הבארות המתאימות של צלחת 96-היטב שכותרתו מראש על פי תצורת הצלחת (איור 2).
8. למוצקים וצבעים נוזליים (חילוץ שאינו שקוע): בתום תקופת ההפקה, לבטל את הרקמות (לוודא שלא לנקב את הרקמות).
   1. להוסיף 1.0 מיליליטר של פתרון extractant לבאר כל צלחת 24-המכילה גם הפתרון שחולץ מן הרקמות. מערבבים את פתרון extractant ולהעביר שני 200 aliquots μl לתוך הבארות המתאימות של צלחת 96-היטב שכותרתו מראש על פי תצורת הצלחת (איור 2).
9. לקבוע tהוא צפיפות אופטית (OD) של הדגימות שחולצו באורך גל יחיד בין 550 ו590 ננומטר (צריך להיות עקבי בתוך מעבדה) על קורא צלחת או ספקטרופוטומטר.
   1. במקרה של פתרונות עכורים תמצית הנגרמים על ידי מוצקים מסיסים, צנטריפוגות הפתרונות לפני מדידת OD (להתקרר צנטריפוגות כדי 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע אידוי). במקרה שטיפה אינו מסירה את מאמר המבחן (ת"א) ות"א מפריעה להפחתת MTT, יש להשתמש בבקרות נוספות. עיין SOP מפורט לתיקון להפחתת MTT ^16.
   2. במקרה ת"א מוצגת לי, או לפתח צבע שיכול לקיים אינטראקציה עם מדידת MTT, בדיקה נוספת יש לבצע כדי לקבוע את כמות הצבע מחויבת, ולאחר מכן חילצה מן הרקמות. עיין SOP מפורט לתיקון למאמרי מבחן צבעוני ^16.

9. חישובים לבדיקת הכדאיות רקמות (לוח 6 ואיור 3) & #160;

1. חישובים כלליים
   1. לחשב את ערך OD הממוצע של הבארות ריקות שליטה (OD BLK) עבור כל ניסוי.
   2. לחסר OD Blk מכל ערך OD של אותו הניסוי (BLK תיקן נתונים).
   3. לחשב את הערך הממוצע של שני aliquots לכל רקמות (OD = המתוקן).
2. לחשב את כדאיות אחוזים מכל אחד משתי הרקמות לשכפל לכל שליטה ומאמר מבחן ביחס לשליטה הממוצעת השלילית (שליטה של ​​100%).
   כדאיות (%) = [רקמות שטופלו / שליטה מתוקנת OD OD תיקן שלילית] x 100%
3. חישוב ההפרש של הכדאיות (הבדל הכדאיות בין שתי רקמות לשכפל).
4. לחשב את הכדאיות הממוצעת מאמר מבחן (כדאיות ת"א) ולסווג את מאמר בדיקה על פי מודל החיזוי.

מודל חיזוי 10. (איור 3)

1. אם כדאיות הרקמות שטופלה ת"א היא> 60.0 ביחס למטופלים-NC נ 'הרקמהiability, לתייג את מאמר המבחן כאינו מטרד (NI) (GHS אין קטגוריה).
2. אם כדאיות הרקמות שטופלה ת"א היא ≤ 60.0 ביחס לכדאיות רקמות שטופלה NC, לתייג את מאמר מבחן כמטרד (I) (קטגוריות GHS 1 ו -2).
   הערה: תוצאות בדיקת EIT נחשבות מוסמכת אם:
   • OD EIT NC> 0.8 ו< 2.5;
   • כדאיות EIT מחשב הרקמה (%, ביחס לNC) הוא ≤50.0%;
   • ההבדל בין שתי הרקמות לשכפל (NC, מחשב, ומאמר מבחן) הוא <20.0%.

תוצאות

תוצאות EIT נציג שנערכו עם 10 מאמרי מבחן (ת"א) ובקרות שליליות וחיוביות מוצגות בטבלה 6 ואיור 3. ממוצע OD = 1.31 עבור NC תואם 100% כדאיות רקמות, ולכן המחשב (כלומר OD = 0.41) היה כדאיות רקמות היחסית של 31.2%. כאשר פרוטוקול EIT בוצע ב -15 ניסויים בלתי תלויים בתוקף ב -7 מעבדות באמצעות פרוטוקול נוזל החשיפה וב -8 ניסויים בתוקף עצמאיים במעבדות 4, באמצעות פרוטוקול החשיפה המוצק, כדאיות רקמות הממוצעת למחשב באמצעות פרוטוקול הנוזל הייתה 36.4 ± 4.0 % 32.3 ו± 6.4% לפרוטוקול המוצקים. בכל המקרים, תוצאות הביקורת החיוביות היו מתחת לערך מנותק של 60.0% ^15.

כפי שניתן לראות באיור 3, TA1, TA2, TA4, TA7, והיה לי TA8 viabilities רקמה> 60.0% ולכן סווגו כ" NI ". TA3, TA5, TA6, היה TA9, וTA10 X viabilities הרקמה04; 60.0%, ולכן סווגו כ" אני ". ההבדל של כדאיות רקמות בין רקמות הכפולות היה <20.0% לכל TAS עם למעט TA2. לכן, תוצאות לכל מאמרי המבחן, עם יוצא מן הכלל של TA2, נחשבו "מוסמכת" שכן הם עמדו בכל קריטריוני EIT הקבלה (סעיף 10.2). בגלל שונות גבוהות בין רקמות הכפולות לTA2 בניסוי הראשוני, ניסוי שני היה צורך להשיג תוצאות EIT מוסמכים.

שיטת בדיקת EIT כפי שתואר כאן ניצול מודל רקמת RHCE שימשה להערכה של גירוי עיני במספר מחקרי תיקוף multilaboratory, כוללים אימות פורמאלית על ידי ECVAM EURL / קוסמטיקת אירופה ^15,17-19. בכל המחקרים, EIT הוצג להיות שחזור והיה מסוגל לזהות בצורה נכונה כימיקלים (שני חומרים ותערובות) לא דורש סיווג ותיוג לגירוי בעיניים או AC נזק לעיניים רציניcording להאו"ם GHS ^15,17-19. שיטת בדיקת EIT מילאה את הקריטריונים לקבלה של קבוצת ניהול האימות (VMG) לגירוי בעיניים לרגישות, סגוליות, ודיוק כולל וכרגע זה תלוי ועומד יישום רשמי כתחליף חלקי לארנב in vivo בדיקת דרייז ^19.

איור 1: תרשים של פרוטוקול EIT למאמרי מבחן נוזליים ומוצקים קיצורים: AM, בינוני assay;. SCC, תנאי תרבות סטנדרטיים; PBS, בופר פוספט של Dulbecco; RT, בטמפרטורת חדר.

איור 2:. תצורת הצלחת 96-היטב הסטנדרטית לבדיקת כדאיות רקמות MTT שני 200 aliquots μl הוא tra nsferred לבארות המתאימות של צלחת 96-היטב שכותרתו מראש. קיצורים: NC, שליטה שלילית; מחשב, שליטה חיובית; TA1-TA20, מאמרי מבחן 1-20; פתרון ריק, extractant. 96 תצורת צלחת MTT משמשת עם גיליון אלקטרוני Excel נועד לחשב את הכדאיות רקמות RHCE ותוצאות EIT.

איור 3: תוצאות שהושגו EIT למאמרי 10 מבחן, NC ובקרות מחשב באמצעות מודל רקמת RHCE הגרף מופק מגיליון האלקטרוני של Excel נועד להציג תוצאות EIT.. כימיקלים מבחן אשר הקטינו את הכדאיות רקמות ≤ 60.0% ביחס לNC מסווגים כמגרים ("אני", TA3, TA5, TA6, TA9, וTA10) וכימיקלים מבחן שהיו לי כדאיות רקמות> 60.0% מסווגות כאינם מגרים (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7, וTA8).

התחל זמן לצעדי עבודת פרוטוקול EIT (העבודה של יום אחד למפעיל אחד)
כל שורה המתאימה לזוג אחד של רקמות
סדר פעולות:	1	2	3	4	5	6	7
נוזלים:	PBS	ת"א חשיפה	פוסט משרים	פוסט Incub.	MTT תגובה	MTT הפקה	מדד
	30 דקות	30 דקות	12 דקות	120 דקות	180 דקות	120 דקות	OD
NC	09:00	09:30	10:00	10:12	00:12	15:12	לאחר
PC	09:01	09:31	10:01	10:13	00:13	15:13	17:30
מדד ת"א 1	09:02	09:32	10:02	10:14	00:14	15:14
מדד ת"א 2 </ Strong>	09:03	09:33	10:03	10:15	00:15	15:15
מדד ת"א 3	09:04	09:34	10:04	10:16	00:16	15:16
מדד ת"א 4	09:05	09:35	10:05	10:17	00:17	15:17
מדד ת"א 5	9:06	09:36	10:06	10:18	00:18	15:18
מדד ת"א 6	09:07	09:37	10:07	10:19	00:19	15:19
מדד ת"א 7	9:08	09:38	10:08	10:20	00:20	15:20
ng> ת"א-8	09:09	09:39	10:09	10:21	00:21	15:21
מדד ת"א 9	09:10	09:40	10:10	10:22	00:22	15:22
מדד ת"א 10	09:11	09:41	10:11	10:23	00:23	15:23

ng = "0">

טבלה 3:. לוח זמנים לדוגמא לבדיקה של מאמרי מבחן נוזל צעדי פרוטוקול כוללים מראש הרטבת הרקמות עם DPBS, יישום של מאמרים מבחן (TAS), שטיפה ופוסט-לספוג, תקופת הפוסט-דגירה, assay MTT, הפקה של MTT, ומדידה של MTT OD מוצגות בעמודות. פעמים לרקמות הכפולות מאורגנות בשורות. כל בדיקות assay 10 TAS והבקרות ניתן לסיים ביום אחד.

e_content ">

התחל זמן לצעדי פרוטוקול EIT (2 ימים עבודה למפעיל אחד)
כל שורה המתאימה לזוג אחד של רקמות
יום 1					יום 2 (היום הבא)
סדר פעולות:	1	2	3	4	5	6	7
מוצקים:	PBS	ת"א חשיפה	פוסט משרים	פוסט Incubaction	MTT תגובה	MTT הפקה	מדד
	30 דקות	6 שעות	26 דקות	18 שעות	180 דקות	120 דקות	OD
NC	09:00	09:30	15:30	15:56	09:56	00:56	לאחר
PC	09:02	09:32	15:32	15:58	09:58	00:58	15:30
מדד ת"א 1	09:04	09:34	15:34	16:00	10:00	13:00
מדד ת"א 2	9:06	09:36	15:36	16:02	10:02	13:02
מדד ת"א 3	9:08	09:38	15:38	16:04	10:04	13:04
מדד ת"א 4	09:10	09:40	15:40	16:06	10:06	13:06
מדד ת"א 5	09:12	09:42	15:42	16:08	10:08	13:08
מדד ת"א 6	09:14	09:44	15:44	16:10	10:10	13:10
מדד ת"א 7	09:16	09:46	15:46	16:12	10:12	13:12
ת"א-8	09:18	09:48	15:48	16:14	10:14	13:14
מדד ת"א 9	09:20	09:50	15:50	16:16	10:16	13:16
מדד ת"א 10	09:22	09:52	15:52	16:18	10:18	13:18

לוח 4: לוח זמנים לדוגמא לבדיקה של מאמרי מבחן מוצקים. צעדי פרוטוקול כוללים רקמות עם DPBS, יישום של מאמרים מבחן, שטיפה ופוסט-לספוג, תקופת הפוסט-דגירה, assay MTT, הפקה של MTT, ומדידה של MTT OD מוצגות בעמודות הרטבה מראש. פעמים לרקמות הכפולות מאורגנות בשורות. Assay כל בדיקת 10 TAS ובקרות מתבצע על פני תקופה של יומיים.

הסכום	מגיב	תנאי אחסון	מקור	תיאור	תאריך תפוגה
בקבוקון 1, 2 מיליליטר	להתרכז MTT (MTT-100-CON)	מוגן מפני אור (-20ºC)	MatTek	תרכיז הקפוא MTT	2 חודשים
בקבוקון 1, 8 מיליליטר	diluent MTT	2-8 ו# 186; ג	MatTek	לדילול להתרכז MTT לפני השימוש בassay MTT	2 חודשים
בקבוק 1, 60 מיליליטר	Isopropanol (CAS # 67-63-0)	RT	סיגמא אולדריץ	פתרון Extractant	NA

לוח 5: MTT-100 רכיבי ערכת Assay.

קוד N °	רקמה	הנתונים גולמיים		נתונים מתוקנים ריקים		אומר של OD	% מכדאיות
	n	Aliq. 1	Aliq. 2	Aliq. 1	Aliq. 2
NC	1	1.316	1.352	1.316	1.352	1.334	101.6
	2	1.277	1.309	1.277	1.309	1.293	98.4
PC	1	.379	.397	.379	.397	.388	29.6
	2	.419	.442	.419	.442	.431	32.8
TA1	1	1.213	1.244	1.213	1.244	1.229	93.5
	2	1.355	1.355	1.355	1.355	1.355	103.2
TA2	1	1.210	1.122	1.210	1.122	1.166	88.7
	2	.828	.837	.828	.837	.833	63.4
TA3	1	.167	0.168	.167	0.168	.167	12.7
	2	0.138	.136	0.138	.136	0.137	10.4
TA4	1	1.137	1.160	1.137	1.160	1.149	87.4
	2	1.262	1.191	1.262	1.191	1.227	93.4
TA5	1	0.610	.621	0.610	.621	.616	46.9
	2	.480	.484	.480	.484	.482	36.7
TA6	1	.502	.513	.502	.513	.508	38.7
	2	.396	.407	.396	.407	.402	30.6
TA7	1	1.048	1.050	1.048	1.050	1.049	79.9
	2	1.149	1.150	1.149	1.150	1.150	87.5
TA8	1	1.032	1.034	1.032	1.034	1.033	78.7
	2	.941	.935	.941	.935	.938	71.4
TA9	1	0.022	0.022	0.022	0.022	0.022	1.7
	2	0.144	0.149	0.144	0.149	0.147	11.2
TA10	1	0.150	0.150	0.150	0.150	0.150	11.4
	2	.254	.255	.254	.255	.255	19.4

	אומר	DIF.	אומר של	DIF.	Dif. / 2	סיווג
	של OD	של OD	viabilities [%]	של viabilities
NC	1.314	0.041	100.0	3.12	1.56	NI	מוסמך
PC	0.410	.043	31.2	3.23	1.62	אני	מוסמך
TA1	1.292	0.127	98.3	9.63	4.81	NI	מוסמך
TA2	0.999	0.333	76.1	25.36	12.68	NI	D> 20
TA3	0.152	0.030	11.6	2.32	1.16	אני	מוסמך
TA4	1.188	0.078	90.4	5.94	2.97	NI	מוסמך
TA5	.549	0.134	41.8	10.16	5.08	אני	מוסמך
TA6	.455	0.106	34.6	8.07	4.03	אני	מוסמך
TA7	1.100	0.101	83.7	7.65	3.82	NI	מוסמך
TA8	.986	0.095	75.0	7.23	3.62	NI	מוסמך
TA9	0.085	0.125	6.4	9.48	4.74	אני	מוסמך
TA10	.203	0.105	15.4	7.95	3.98	אני	מוסמך

לוח 6:. תוצאות שהושגו EIT במשך 10 מאמרי בדיקה, בקרת NC ומחשב השולחנות לדרבןuced ידי גיליון אלקטרוני של Excel נועד לחשב את הכדאיות רקמות ותוצאות EIT. כימיקלים מבחן אשר הקטינו את הכדאיות רקמות ≤ 60.0% ביחס לNC מסווגים כמגרים ("אני", TA3, TA5, TA6, TA9, וTA10) וכימיקלים מבחן שהיו לי כדאיות רקמות> 60.0% מסווגות כאינם מגרים (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7, וTA8).

Discussion

יש לנו הצגתי את מבחן העין גירוי (איור 1) שפותח עבור דגם רקמת EpiOcular. EIT הוא מסוגל להפריד חומרים מגרים עיניות וחומרים מאכלים (קטגוריות GHS 1 ו -2 משולב) מחומרים שאינם דורשים תיוג (GHS אין קטגוריה) עם רמה גבוהה של רגישות וסגוליות ^17. EIT כפי שהוצג במסמך זה אינו מפלה בין קטגוריה GHS 1 מקטגוריה 2 כימיקלים. EIT קבל תוקף לסיווג ותיוג של פוטנציאל גירוי העיני של מגוון רחב של כימיקלים, כולל מרכיבים קוסמטיים ותרופות. בשיתוף עם אחרים בבדיקות מבחנה, EIT ישמש כתחליף למבחן גירוי בעיני ארנב in vivo.

EIT משתמש בשני פרוטוקולים דומים אך שונים לחומרים נוזליים ומוצקים, המשתנים באורך של חשיפה ותקופות שלאחר החשיפה דגירה (איור 1). נקודת הסיום בשימוש בEITהיא כדאיות רקמות, שנקבעה על ידי assay MTT, אשר שימש בעבר בדגמי תוקף אנושי אפיתל רקמת ^20,21. כדי לבצע assay זה, אין צורך בציוד מיוחד מלבד ציוד תרבית תאים סטנדרטי. בשל הרמה הגבוהה של שחזור רקמות לרקמה, n = 2 רקמות במקום בדרך כלל מומלץ n = 3 משמשים. היכולת להשתמש n = 2 רקמות היא היבט קריטי של הפרוטוקול, שכן הוא מאפשר למפעיל מנוסה לעבד שתי רקמות בו זמנית, ובכך לצמצם את השונות של assay שיכול להתעורר כתוצאה מהטיפול של רקמות אדם שונה ^14. כמו כן, על ידי השימוש בn = 2 רקמות למאמר בדיקה, IRRITANCY של 10 חומרי בדיקה של אותו מצב פיזי (נוזל או מוצק), יחד עם הבקרות החיוביות ושליליות, ניתן להעריך באמצעות ערכה אחת (24 רקמות).

נקודות מפתח אחרות המבטיחות אמין סיווג של חומרי מפרטים לביקורת החיובית substance (כדאיות רקמות ≤50.0%), שחזור בין רקמות כפולות (הבדל <20.0%), וקריאת OD בקרה שלילית (> 0.8 ו< 2.5).

בעת ביצוע בדיקת EIT, חשוב לדבוק בפרוטוקול תוקף ולמינון הציע ולוחות זמני שטיפה (לוחות 3 ו -4), מאז סטייה מהפרוטוקול או השינויים בתקופות הדגירה עלולה לגרום לתוצאה שונה. כמו כן, סטיות מרגע 3 שעות לדגירת MTT יגרמו קריאות MTT שונות ועשויות להשפיע על תוצאת assay.

מדי פעם, כימי בדיקה יכולה להיות אופטיות או אחרות תכונות שעלולים להפריע לassay כדאיות רקמות MTT או הפחתת גורם MTT. לדוגמא, כימי בדיקה עשויים להפחית באופן ישיר למוצר MTT תגובה כחול-סגול, או עשוי להיות חומר בצבע שסופג אור באותו הטווח כמו formazan MTT (~ 570 ננומטר). עם זאת, כימיקלים מבחן אלה יהיו יחסי ציבורesent בעיה היחיד, אם בזמן של assay MTT, כמות מספקת של החומר עדיין קיימת ב( או נספג על ידי) הרקמה. כדי למנוע הפרעה זו, נהלי שטיפה נרחבים ישולבו פרוטוקול EIT. אם שטיפה אינו מסיר את ת"א ות"א מפריעה להפחתת MTT, יש להשתמש בבקרות נוספות כדי לזהות ונכון עבורו. בקצרה, אם הפחתת MTT הישירה של חומר כימי בדיקת חשד, 50 μl (או 50 מ"ג למוצקים) של הכימיקל בשאלה טופחו במשך 3 שעות עם פתרון MTT עובד בSCC (NC, 50 μl של מים ללא יונים סטרילי, צריך להיות לרוץ במקביל). אם פתרון MTT הופך לכחול-סגול, מאמר המבחן הוא בחזקת צמצמו את MTT. במקרה זה בדיקה פונקציונלית באמצעות פקדי רקמות נהרגו הקפאה צריכה להתבצע כדי להעריך אם חומר הבדיקה מחייב לרקמות ומובילות להפחתת אות MTT שווא. אם יש ירידה ניכרו בMTT החשוף-ת"א שליטת הרקמה נהרגה,(ביחס לכמות ברקמת קיימא מטופל), כדאיות הרקמות הממוצעת של מאמר המבחן חייבת להיות מתוקנת על ידי הפחתת הכדאיות הממוצעת של השליטה נהרגה.

EIT טועה בצד של בטיחות, כפי שהודגם על ידי השכיחות הנמוכה של סיווגים שליליים כוזבים ^14,15,18. חשוב לציין, שאף אחד מהכימיקלים GHS קטגוריה 1, שהנם מאכל לעין ואשר מייצג את המפגע העיני החמור ביותר, סווגו כלא מעצבן בassay זה ^14,15,18,19. לבסוף, אחד היתרונות הגדולים של RHCE בשיטת בדיקת מבחנה היא האפשרות של בדיקת נוזל מסודר וחומרים מוצקים (דבר שאינו אפשרי עם תרבויות דו-ממדיים, שקועות תא).

EIT יתרום באופן משמעותי בקביעת פוטנציאל הגירוי העיני של מגוון רחב של חומרים על פי שיטת הסיווג ותיוג של האו"ם GHS. ההחלפה של בעלי חיים כדי לקבוע oרעילות cular הייתה מטרה של מחקר טוקסיקולוגי במשך שנים רבות. שיטת בדיקת EIT השלימה מחקר אימות פורמלי נתמך על ידי EURL ECVAM בשנת 2014 וEIT EpiOcular יושם להנחיות מבחן ה- OECD כOECD TG 492 בשנת 2015.