Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

Resumo

Nós desenvolvemos um teste de irritação nos olhos que utiliza um modelo de tecido tridimensional epitelial córnea-like humana reconstruída (RHCE). O teste é capaz de discriminar entre irritante ocular e materiais corrosivos (GHS Categorias 1 e 2 combinados) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria).

Resumo

Para cumprir com a Emenda Sétimo à legislação Directiva Cosméticos e REACH EU EU, são necessários que não envolvam animais métodos alternativos validados para avaliação confiável e precisa de toxicidade ocular no homem. Para endereçar esta necessidade, nós desenvolvemos um teste de irritação ocular (TIE), que utiliza um modelo tridimensional humana reconstruída córnea epitelial semelhante (rhce) de tecido que é baseado em células humanas normais. O IET é capaz de separar irritantes e corrosivos oculares (GHS categorias 1 e 2 combinado) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria). O teste utiliza dois protocolos distintos, um concebida para produtos químicos líquidos e um segundo protocolo, similar para artigos de teste sólidos. O modelo de previsão IET utiliza um único período de exposição (30 minutos para os líquidos, para 6 h de sólidos) e uma única viabilidade do tecido de corte (60,0% como determinado pelo ensaio de MTT). Com base nos resultados de 83 produtos químicos (44 líquidos e sólidos 39) IET alcançado 95,5 / 68,2 / 81,8% e sensitivity / especificidade e precisão (SS & A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / 84,6% e SS & A para sólidos, e 97,6 / 68,3 / e 83,1% para SS & A global. O EIT contribuirá significativamente para a classificação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de produtos químicos líquidos e sólidos sem a utilização de animais para atender aos requisitos regulamentares de teste. O método EpiOcular EIT foi implementada em 2015 para as Directrizes de Ensaio da OCDE como TG 492.

Introdução

Produtos de consumo, como cosméticos, detergentes e produtos de limpeza domésticos incluem uma variedade de produtos químicos que podem induzir sérios danos se entrar em contato com os olhos. Portanto, o teste desses agentes para irritação dos olhos é exigido pelas agências reguladoras dos EUA e da UE para garantir a segurança dos consumidores ^1. Uma avaliação do potencial de irritação ocular de misturas e formulações é também um requisito para o cumprimento REACH (Registo, Avaliação, Autorização e Restrição de Produtos Químicos) legislação para a rotulagem dos ingredientes cosméticos no âmbito da Directiva Cosméticos da UE para o transporte de produtos químicos, e para a rotulagem dos pesticidas e produtos domésticos ^2. Atualmente, as agências reguladoras requerem avaliação de perigo ocular usando o Sistema Globalmente Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos (GHS) ^3. GHS é baseada principalmente no teste de irritação ocular de Draize, o ensaio de irritação ocular mais amplamente utilizado em que substâncias estranhas e mixtures são introduzidos directamente no saco conjuntival do olho do coelho ^4. Segundo a classificação GHS, GHS Categoria 1 (substâncias corrosivas oculares) refere-se a testar produtos químicos que causam lesão inicial grave para os tecidos oculares ou sérios danos aos olhos e visão que não é totalmente reversível nos 21 dias após a exposição ^3,5. GHS Categoria 2 se refere a testar substâncias químicas que produzem mudanças significativas no olho que são totalmente reversível nos 21 dias de exposição. Produtos químicos de teste que não são corrosivos ou irritantes são referidos como GHS n Categoria.

Por mais de 40 anos, o teste de olho de coelho Draize tem sido criticado por sua falta de reprodutibilidade, superestimação da resposta humana, bem como a utilização de animais vivos ^5-8. Estas preocupações têm incentivado muitas propostas de aperfeiçoamento, redução e substituição do ensaio in vivo ^9. A necessidade de alternativas à experimentação animal validados foi reforçadapela adopção da sétima alteração à Directiva Cosméticos, que proibiu a utilização de animais na avaliação da segurança dos produtos cosméticos (em 2005) e ingredientes (em 2009) ^2.

Desde 1996, o modelo de tecido córnea semelhante reconstruído tem sido amplamente utilizada na indústria cosmética para avaliar o potencial de irritação de matérias-primas, as formulações à base de surfactante, e misturas que são concebidos para serem utilizados no composto, ou nas imediações do, olho ^10-13. A utilização do modelo de tecido rhce permite a aplicação tópica directa do material de teste sobre a superfície do tecido, na sua forma nativa, não diluído. Desta forma, as formulações não solúveis em água podem ser controlados sem a sua diluição com solventes. Em resposta a EURL do ECVAM (Laboratório de Referência da União Europeia Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos) pedido de um método amplamente aplicável, simples e econômica do Irritação dos olhos Test (EIT), que utiliza um single tempo de exposição e é capaz de separar substâncias irritantes oculares e corrosivos a partir de materiais que não necessitam de marcação foi desenvolvido (Figura 1) ^14. Com base nos resultados de 83 produtos químicos (44 líquidos e 39 de sólidos), o IET alcançado 95,5 / 68,2 / e 81,8% de sensibilidade / especificidade e precisão (SS & A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / e 84,6% SS & A para sólidos, e 97,6 / 68,3 / e 83,1% para SS & A global.

Em 2007, um estudo de pré-validação multi-laboratório patrocinado pela Cosmetics Europa (anteriormente Colipa), sob os auspícios do ECVAM EURL avaliada a relevância ea fiabilidade do IET, com o objetivo de trazê-lo para validação formal ^15. Neste estudo, 298 ensaios independentes foram realizados em sete laboratórios independentes. Os resultados do estudo demonstraram concordância de 99,7% na previsão com baixos coeficientes de variação entre todos os laboratórios participantes ^15. Como resultado, em 2010 o protocolo EIT entrou formal EURL ECVAMprograma de validação. O estudo de validação utilizados 104 produtos químicos de teste codificados, incluindo substâncias individuais e misturas químicas, para os quais os dados de referência in vivo (dados de irritação ocular de Draize) estavam disponíveis. Baseado no sucesso deste trabalho, uma diretriz projecto de ensaio da OCDE foi apresentado em 2014. Prevê-se que o IET contribuirá significativamente para a classificação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de materiais de acordo com o sistema de classificação e rotulagem GHS da ONU.

Protocolo

1. Preparação de RHCE Tecidos para Tratamento - Dia 0

1. Após o recebimento do kit epitelial comercial córnea humana (RHCE), verifique todos os componentes do kit para a integridade (para detalhes kit ver Padrão Assay Kit Componentes (Tabela 1) e equipamentos e materiais necessários para realizar o ensaio EIT (Tabela 2). Em o dia da recepção, equilibrar tecidos (em seu recipiente de 24 poços de envio) para RT por 15 min.

Quantidade	Reagente	Condições	Fonte	Descrição	Data de validade
1	Selada placa de 24 poços de tecidos EpiOcular (OCL-200)	2-8 ° C	MatTek	Contém 24 tissues de cultura de células insere, pacote de agarose	72 hr
1 garrafa, 200 ml	EpiOcular Meio de Ensaio (OCL-200-ASY)	2-8 ° C	MatTek	Meio baseado em DMEM	21 dias
1 garrafa, 100 ml	Ca ++ Mg ++ Dulbecco Livre-PBS (DPBS)	RT	Sigma-Aldrich, D5652, ou equiv.	Utilizada para a lavagem inserções	1 ano
4	As placas de 6 poços	RT	Falcão	Usado para a manutenção de tecidos durante o protocolo de ensaio	N / D
2	As placas de 12 poços	RT	Falcão	Usado protocolo de ensaio durante	N / D
2	As placas de 24 poços	RT	Falcão	Utilizado para realizar um ensaio MTT	N / D
1 frasco, 0,5 ml	Acetato de metilo (CAS # 79-20-9)	RT	Sigma-Aldrich, Cat # 186325	Usado como PC no ensaio	1 mês

Tabela 1: Componentes do Kit de ensaio padrão.

Equipamentos / Material	Necessário para:
Incubador humidificado (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 90 ± 10% de humidade)	Incubando tecidos antes e durante os ensaios
Câmara de fluxo laminar	Trabalho seguro em condições estéreis
Bomba de vácuo (opcional)	Aspiração soluções de médio e
Fotómetro leitor de placas (para placas de 96 poços)	Leitura de DO
Agitador de placas	Extratoion de formazan
Estéreis, pinças gumes sem corte	Manipulação de inserções de tecidos
Cronómetros	Prazo para a aplicação de materiais de teste e outras etapas cronometradas no protocolo
Banho-maria (37 ± 1 ° C)	Aquecem meios de comunicação e solução de MTT
Almofariz e pilão	Moagem sólidos granulares
Pipeta de deslocamento positivo (50 ul)	A aplicação de materiais viscosos e suspensões e semi-sólidas
Pipetas ajustáveis ​​(200 ul-2 ml)	A aplicação de materiais líquidos, e meio de ensaio MTT
Pré-esterilizadas pontas (200 ul e 20 ul), Cat # Rainin HR-200F e HR-20F (ou equivalente)	A aplicação de materiais líquidos, e meio de ensaio MTT
Dicas de largura de orifícios pré-esterilizados (250 ul), Cat Rainin # HR-250Ws (ou equivalent)	A aplicação de materiais viscosos e suspensões e semi-sólidas
8 oz / 220 ml de amostra recipientes, Cat Falcon # 3540200 (ou equivalente)	Enxaguar tecidos
Seringas estéreis de uso único (por exemplo, 1 ml tuberkulin seringa Omnifix-F, B. Braun, Cat. No. 9161406V)	Entrega de ~ 50 mg materiais sólidos (opcional)
Ted Pella micro espátula / colher, Ted Pella Inc., Cat # 13504 (ou equivalente, afiado colher cureta ou osso, por exemplo, Aesculap, No: FK 623)	Entrega de ~ 50 mg de materiais sólidos
Ca ++ e Mg ++ salina tamponada com fosfato de Dulbecco livre (Ca ++ Mg ++-DPBS): Sigma-Aldrich, Cat # D5652 (ou equivalente)	Enxaguamento tecidos durante ensaio
Estéril água deionizada, cultura de tecidos grau (qualidade biológica ou equivalente)	Usar como NC
Placas de 96 poços de fundo plano, Falcon (ou equivalentes)	Para a leitura OD
Swaps com ponta de algodão (estéril)	Para a secagem da superfície do tecido (opcional)
Fita adesiva ou Parafilm	Cobrindo placas durante a extração formazan
Kit de ensaio de MTT-100	Contém o MTT-tetrazólio azul de tiazolilo (Sigma # H-5655) e isopropanol extracto.

Tabela 2: Equipamentos e materiais necessários para executar o IET.

2. Sob condições estéreis, abrir o saco de plástico contendo a placa de 24 poços com os tecidos rhce e remover a gaze estéril. Inspecione todos os tecidos para as bolhas de ar entre o gel de agarose e inserir. Não use culturas com bolhas de ar sob a cobertura de inserção> 50% da área de inserção, tecidos defeituosos, ou tecidos whi CH estão completamente cobertos com o líquido.
3. Rotular as placas de 6 poços, com o artigo de teste ou códigos de controlo e tempos de exposição. Alíquotas de 1,0 ml de Meio de Ensaio (fornecido com o kit), pré-aquecida a cerca de 37 ° C, em poços de placas de 6 poços pré-rotulados.
4. Use fórceps estéreis para remover cada inserção contendo o tecido rhce e colocar o inserto no marcado de 6 poços da placa. Durante este passo, remover qualquer remanescente de agarose transporte que adere aos lados exteriores da peça inserta por transferência suave sobre papel de filtro estéril. Libertar quaisquer bolhas de ar presas embaixo das inserções.
5. Pré-incubar os tecidos rhce em placas de 6 poços para condições de cultura padrão (SCC atmosfera humidificada, com 5 ± 1% de CO ₂ a 37 ± 1 ° C) durante 1 h.
6. Após 1 h, substituir o Meio de Ensaio com 1,0 ml de Meio de Ensaio fresco pré-aquecido a 37 ° C e incuba-se os tecidos em condições rhce SCC (durante a noite = S / N) (16-24 h).

. ove_title "> 2 Pré-tratamento - Dia 1

1. Após o S / N de incubação, aplicam-se 20 ul de ^Ca2 + ^Mg2 + Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, livre de-(DPBS, fornecido) utilizando um dispositivo de pipetagem apropriado. Se o DPBS não se espalha através dos tecidos, bata suavemente a inserção na placa para assegurar que os DPBS molha a superfície de tecido inteiro.
2. Incubar os tecidos RHCE na SCC para 30 ± 2 min.
   Nota: Este passo é necessário para a hidratação do tecido e para imitar as condições in vivo.

3. Os procedimentos de ensaio de materiais de exposição

1. Aplicar cada artigo de teste e os controlos para duplicar tecidos rhce (n = 2). O procedimento do teste de dosagem de artigo que é diferente para líquidos e sólidos. Topicamente aplicar 50 ul de artigos de teste líquida usando uma pipeta. O tempo de exposição para líquidos é de 30 min. Aplicar 50 mg de artigos de teste sólidas usando uma colher nivelada (calibrado para conter 50 mg de cloreto de sódio). O exposure tempo para sólidos é de 6 horas.
   Nota: Os líquidos são definidos como substâncias de fluido (por exemplo, líquidos, géis, e cremes) que pode ser aplicada utilizando um dispositivo de pipetagem. Os sólidos são definidos como substâncias não-fluidos (por exemplo, pós, materiais resinosos ou cerosos) que não podem ser aplicadas usando uma pipeta.
   1. Se o estado físico de artigos de teste não é fácil de determinar, colocar os frascos com o artigo de teste em um banho de água durante 15 minutos (37 ° C). Siga o protocolo EIT para líquidos para os artigos de teste que liquefazem a 37 ° C.
   2. Usar uma pipeta de deslocamento positivo para materiais particularmente viscosos.
2. Dosear o controlo negativo e controlo positivo primeiro e, em seguida, a dose do artigos de teste.
   1. Aplicar 50? L do controlo negativo (CN) e o controlo positivo (PC) para os tecidos rhce usando uma pipeta padrão. O NC é estéril água deionizada; o PC é o acetato de metilo (CAS # 79-20-9). Aplique o NC e PC durante 30 minutos quando testeing artigos de teste líquidos e durante 6 horas ao testar artigos de teste sólidos.

4. Teste o artigo de exposição - Dia 1

1. Para o tratamento de artigos de teste líquido, seguir o esquema de temporização dada na Tabela 3. Deixar 1 min intervalos entre as aplicações de cada artigo de teste para assegurar a igualdade de exposição a todos os tecidos.
   1. Após a 30 ± 2 min dPBS pré-tratamento, aplicar topicamente 50 ul de NC e PC, e cada artigo de teste líquido topicamente para os tecidos RHCE usando um dispositivo de pipetagem adequada.
   2. Aplicar 50? L do artigo de teste de líquido directamente para o tecido a cobrir a superfície superior. Cortar o ponto estreito da ponta da pipeta para alargar o orifício para materiais viscosos. Para materiais muito viscosos, aplicar o artigo de teste para um dispositivo de doseamento (de um cilindro dirigido plana de diâmetro ligeiramente inferior ao diâmetro interior do inserto de tecido ou um pino de plástico), inverter a dosagem device e colocá-lo sobre o tecido de modo que o artigo de teste uniformemente contatos de superfície do tecido.
   3. Se o artigo do teste não se espalhou pelo tecido, bata suavemente a inserção ter certeza de que ele se espalha na superfície do tecido inteiro. Espalhando mecânica dos artigos de teste (por exemplo, com uma ponta de pipeta) não é recomendada, pois pode danificar os tecidos.
   4. Incubar os tecidos na SCC para 30 ± 2 min.
2. Para o tratamento de artigos de teste sólidas - Dia 1, seguir o esquema de temporização dada na Tabela 4 Deixar 2 minutos de intervalo entre as aplicações de cada artigo de teste para assegurar a igualdade de exposição a todos os tecidos..
   1. Após a 30 ± 2 min DPBS pré-tratamento, aplicam-se 50 ul de NC e PC topicamente sobre os tecidos rhce utilizando um dispositivo de pipetagem apropriado.
   2. Para a aplicação do artigo de teste sólido, remover os insertos (n = 2) a partir do bem e coloque-os sobre uma superfície estéril (por exemplo, a tampa de AMplaca ultiwell) para evitar um artigo de teste derrame para o meio.
   3. Usando uma colher nivelada, aplicar topicamente aproximadamente 50 mg do produto em estudo sobre a superfície do tecido; certificar-se de que a superfície do tecido é completamente coberta pelo artigo de teste. Se o artigo do teste não se espalhou pelo tecido, agitar suavemente a inserção de lado a lado para garantir que o tecido está completamente coberta pelo artigo de teste. Espalhando mecânica dos artigos de teste (por exemplo, com uma ponta de pipeta) não é recomendada, pois pode danificar os tecidos.
      1. Se necessário, moer pós cristalinos com um almofariz e pilão para garantir um melhor contato entre o artigo de teste e o tecido.
      2. Alternativamente, lugar em pó diretamente sobre a cultura de tecidos no interior da inserção, utilizando uma seringa de 1 ml com a cabeça cortada. Pós material para dentro da seringa quando o êmbolo é puxado para trás e, em seguida, aplicar pressionando o êmbolo para baixo.
      3. Se a parede externa do elemento de inserção contaminated por exemplo, através de pós, limpe as partículas com uma gaze estéril.
   4. Após a administração, os tecidos voltar para as placas de 6 poços contendo meio de cultura e incuba-se a SCC durante 6 h ± 15 min.

5. Enxágue

1. Preparar um conjunto de três taças limpo (150 ml de capacidade) por artigo de teste e encher cada um deles com 100 ml de DPBS. Para cada artigo de teste, utilizam um conjunto diferente de três taças.
2. No final da exposição de 30 min ± 2 para materiais líquidos ou 6 h ± exposição de 15 min para os materiais sólidos, remover e descartar o dispositivo de doseamento se fosse usado.
3. Levantar as pastilhas que contêm o tecido rhce para fora do meio de agarrar a borda superior do "colar" de plástico com uma pinça fina. Use uma pinça curva para facilitar o tratamento e decantação. Lavar os tecidos dois de cada vez, mantendo as inserções duplicados em conjunto por seus colares usando uma pinça. Tenha cuidado nOT a danificar os tecidos com a pinça.
4. Decantar os artigos de teste ou controles de superfície do tecido sobre um material absorvente limpo (papel toalha, gaze, etc.)
5. Mergulhar as inserções no primeiro béquer de DPBS, redemoinho em um movimento circular no DPBS durante aproximadamente 2 segundos, levantar as pastilhas de modo a que na sua maioria são preenchidos com DPBS, e decanta-se o líquido para dentro da proveta. Repetir este processo três vezes no primeiro copo.
6. Lavar as inserções nos segundo e terceiro provetas de DPBS três vezes cada um da mesma maneira.
7. Decantar o líquido remanescente no inserto sobre o material absorvente. Gire a inserção de um valor aproximado de 45 ° de ângulo (extremidade aberta para baixo) e tocar o lábio superior para o material absorvente.
   Nota: Se não é possível remover todo o material de teste visível, enxaguar qualquer parte deve ser realizado para evitar danos nos tecidos devido a um manuseamento excessivo.

6. Pós-embeber

1. Depois de enxaguar,mergulhar imediatamente tecidos em 5 ml de Meio de Ensaio previamente aquecida à temperatura ambiente em um pré-rotulados placa de 12 poços.
2. Incubar os tecidos durante 12 ± 2 minutos para materiais líquidos ou 25 ± 2 min para materiais sólidos imersos em RT para facilitar a remoção de qualquer artigo de teste residual.

7. Pós-incubação

1. No final do período de pós-Soak imersão, decanta-se o Meio de Ensaio dos tecidos e apagar os insertos para um material absorvente.
2. Transferir as inserções na placa de 6 poços pré-marcado contendo 1 ml de Meio de Ensaio quente.
   1. Incubar os tecidos para 120 ± 15 min a SCC para materiais de teste líquidos.
   2. Incubar os tecidos durante 18 ± 0,25 h a SCC para materiais de teste sólidas.

8. Viabilidade Ensaio MTT - Dia 1 (Protocolo para Liquids) e Dia 2 (Protocolo para sólidos)

1. Realizar o ensaio MTT após a pós-incubação de 12077; 15 min para líquidos e 18 ± 0,25 horas para sólidos, respectivamente.
2. Prepare / ml de solução e alíquota de 0,3 ml de solução de MTT a 1,0 mg em cada poço de uma pré-rotulados placa de 24 poços.
   1. Utilizar o kit comercial de MTT (Tabela 5):
   2. 2 horas antes do uso, o concentrado de MTT descongelar à temperatura ambiente. Combinar 2 ml do concentrado de MTT e 8 ml de diluente para produzir MTT / ml de solução de MTT 1,0 mg.
   3. Guardar a solução de MTT a 4 ° C no escuro até serem utilizadas. Não guarde a solução MTT por mais de 1 dia.
3. No final da Pós incubação, cada inserção de remover a placa de 6 poços e secar suavemente sobre um material absorvente.
4. Coloque as inserções para a placa de 24 poços contendo 0,3 mL de solução de MTT. Libertar quaisquer bolhas de ar presas embaixo das inserções. Incubar a placa durante 180 ± 10 min a SCC.
5. Extração MTT
   1. Depois de 180 ± 10 minutos de incubação na solução de MTT, remover cada inserçãoa partir da placa de 24 poços e secar a parte inferior do inserto sobre um material absorvente.
   2. Para artigos de teste líquido não submersos corante (extracção): Transferir as inserções em uma placa de 24 poços pré-marcado contendo 2,0 ml de uma solução de agente de extracção (isopropanol) para que submerge o inserto.
   3. Para sólidos e corantes líquidos (não-submersa de extracção a fim de evitar a contaminação da solução de extracção): Transferir as inserções em uma placa de 6 poços pré-marcado contendo 1,0 ml da solução de extractante (isopropanol), de modo que não se submergir a inserção.
      Nota: Execute o mesmo extração não-submersa para os controles positivos e negativos correspondentes.
6. Selar as placas (por exemplo, com parafilme entre a tampa e placa de rebordo superior dos poços ou com um vedante de placa padrão). Colocar as placas num agitador de placas orbital e agita-se durante 2 a 3 horas à temperatura ambiente para extrair o MTT.
   1. Como alternativa, realizar a extração de O / N a 2-876; C no escuro, sem tremer.
7. Para artigos de teste líquido não submersos corante (extracção): No final do período de extracção, decanta-se o líquido a partir de cada inserção de volta para dentro do poço e descartar as inserções com os tecidos rhce.
   1. Misturar a solução de extracto e transferir duas alíquotas de 200 ul para os poços apropriados de uma pré-rotulados placa de 96 cavidades de acordo com a configuração da placa (Figura 2).
8. Para sólidos e líquidos corantes de extracção (não submersa): No final do período de extracção, descartar os tecidos (a certeza de não perfurar os tecidos).
   1. Adicionar 1,0 ml de solução de extracção em cada poço da placa de 24 poços contendo a solução foi extraída a partir de tecidos. Misturar a solução de extractante e transferir dois 200 mL alíquotas para os poços apropriados de uma pré-rotulados placa de 96 cavidades de acordo com a configuração da placa (Figura 2).
9. Determinar tele densidade óptica (DO) das amostras extraídas em um único comprimento de onda entre 550 e 590 nm (deve ser consistente dentro de um laboratório) num leitor de placas ou um espectrofotómetro.
   1. No caso das soluções de extractos turvas causadas por sólidos insolúveis, centrifugar as soluções, antes da medição da DO (arrefecer a centrífuga a 4 ° C para evitar a evaporação). No caso de lavagem não remove o artigo de teste (TA) e a TA interfere com a redução do MTT, devem ser utilizados controlos adicionais. Por favor, consulte um SOP detalhado para corrigir a redução MTT ^16.
   2. No caso de um TA é mostrado para ter, ou para desenvolver cor que pode interagir com a medição de MTT, um teste adicional deve ser realizado para determinar a quantidade de cor ligado a, e em seguida extraiu-se a partir dos tecidos. Por favor, consulte um SOP detalhado para corrigir artigos tingidos de teste ^16.

9. Cálculos para o teste de viabilidade de tecido (Tabela 6 e Figura 3) & #160;

1. Cálculos gerais
   1. Calcular o valor médio dos poços de controlo em branco (OD preto) para cada experimento.
   2. Subtrair OD preto partir de cada valor OD da mesma experiência (o preto corrigido de dados).
   3. Calcular o valor médio das duas aliquotas de cada tecido (OD = corrigido).
2. Calcula-se a percentagem de viabilidade de cada um dos dois tecidos em replicado para cada controlo e artigo de teste em relação ao controlo negativo médio (controlo de 100%).
   Viabilidade (%) = [corrigido OD tecidos tratados / DO corrigidos controlo negativo] x 100%
3. Calcula-se a diferença de a viabilidade (a diferença entre dois tecidos viabilidade replicados).
4. Calcule o artigo teste de viabilidade média (viabilidade TA) e classificar o artigo de teste de acordo com o modelo de previsão.

10. previsão do modelo (Figura 3)

1. Se a viabilidade dos tecidos tratados com TA é> 60,0 em relação ao tratado-NC tecido vESPONSABILIDADE, rotular o artigo de teste como não-irritante (NI) (GHS Sem Categoria).
2. Se a viabilidade dos tecidos tratados com TA é ≤ 60,0 relação à viabilidade do tecido tratado com NC, rotular o artigo de teste de irritante (I) (GHS Categorias 1 e 2).
   Nota: Os resultados do teste do IET são considerados qualificado se:
   • o OD IET NC> 0,8 e <2,5;
   • a viabilidade dos tecidos IET PC (%, em relação ao NC) é ≤50.0%;
   • a diferença entre os dois tecidos replicadas (NC, PC, e o artigo de teste) é <20,0%.

Resultados

Resultados IET representativos realizados com 10 artigos de teste (TA) e controlos negativos e positivos estão apresentados na Tabela 6 e na Figura 3. A média de OD = 1,31 para o NC corresponde a 100% de viabilidade do tecido, portanto, o PC (média OD = 0,41) tinha a viabilidade do tecido relativa de 31,2%. Quando o protocolo IET foi realizado em 15 experiências independentes válidos em 7 laboratórios usando o protocolo de exposição líquido e em 8 experiências válidas independentes em 4 laboratórios, utilizando o protocolo de exposição contínua, a viabilidade média dos tecidos para o PC, utilizando o protocolo de líquido foi de 36,4 ± 4,0 e 32,3% ± 6,4% para o protocolo de sólidos. Em todos os casos, os resultados do controlo positivos estavam abaixo do valor de corte de 60,0% ^15.

Como mostrado na Figura 3, a TA1, TA2, TA4, TA7, e tinha TA8 viabilidades dos tecidos> 60,0% e, portanto, foram classificados como "NI". TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10 teve viabilidades tecido X04; 60,0% e, portanto, foram classificados como "I". A diferença de viabilidade do tecido entre os tecidos foi duplicado <20,0% para todas as agências de viagens com uma exceção de TA2. Portanto, os resultados para todos os artigos de teste, com uma exceção de TA2, foram considerados "qualificados" desde que se conheceram todos os critérios de aceitação do IET (Seção 10.2). Devido a grande variabilidade entre tecidos em duplicado para TA2 na experiência inicial, uma segunda experiência foi necessária para obter resultados IET qualificados.

O método de ensaio EIT como aqui descrito, utilizando o modelo de tecido RHCE foi utilizado para a avaliação da irritação ocular em diversos estudos de validação multilaboratory, incluindo a validação formal pelo ECVAM EURL / Cosméticos Europa ^15,17-19. Em todos os estudos, o IET se mostrou reprodutível e foi capaz de identificar corretamente produtos químicos (ambas as substâncias e misturas) que não requer classificação e rotulagem da irritação ocular ou lesões oculares graves acgundo ONU GHS ^15,17-19. O método de ensaio EIT cumprido os critérios de aceitação do grupo de gestão de validação (VMG), para irritação dos olhos para a sensibilidade, especificidade e acurácia geral e atualmente encontra-se pendente implementação formal como um substituto parcial para o teste in vivo coelho Draize ^19.

Figura 1: Esquema do protocolo EIT para artigos de teste líquidos e sólidos abreviações utilizadas: AM, meio de ensaio;. SCC, condições de cultura padrão; PBS de Dulbecco tamponada com fosfato salino; RT, temperatura ambiente.

Figura 2:. A configuração da placa de 96 poços normalizada para o teste de viabilidade MTT tecido Duas alíquotas de 200 ul são transferred aos poços apropriados de uma pré-marcado com 96-poços. Abreviaturas utilizadas: NC, controle negativo; PC, controlo positivo; TA1-TA20, artigos de teste 1-20; Solução em branco, extrator. 96- configuração placa MTT é usado com planilha Excel projetado para calcular a viabilidade do tecido RHCE e os resultados do IET.

Figura 3: Resultados do IET obtida para 10 artigos de teste, NC e controles de PC usando o modelo de tecido RHCE O gráfico é gerado a partir de uma planilha do Excel projetado para apresentar os resultados do IET.. Produtos químicos de teste que reduziu a viabilidade do tecido ≤ 60,0% em relação ao NC são classificados como irritantes ("I", TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10) e produtos químicos de teste que tiveram a viabilidade do tecido> 60,0% são classificados como não-irritantes (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7, e TA8).

Tempo para as etapas de trabalho protocolo EIT (um dia de trabalho para um operador) começam
Cada linha corresponde a um par de tecidos
Pedido de passos:	1	2	3	4	5	6	7
Líquidos:	PBS	TA Exposição	Pós- Embeber	Pós- Incub.	MTT Reação	MTT Extração	Medida
	30 min	30 min	12 min	120 min	180 min	120 min	OD
NC	09:00	09:30	10:00	10:12	00:12	15:12	depois
PC	09:01	09:31	10:01	10:13	00:13	15:13	17:30
TA-1	09:02	09:32	10:02	10:14	00:14	15:14
TA-2 </ strong>	09:03	09:33	10:03	10:15	00:15	15:15
TA-3	09:04	09:34	10:04	10:16	00:16	15:16
AT 4-	09:05	09:35	10:05	10:17	00:17	15:17
TA-5	09:06	09:36	10:06	10:18	00:18	15:18
TA-6	09:07	09:37	10:07	10:19	00:19	15:19
TA-7	09:08	09:38	10:08	10:20	00:20	15:20
ng> TA-8	09:09	09:39	10:09	10:21	00:21	15:21
TA-9	09:10	09:40	10:10	10:22	00:22	15:22
TA-10	09:11	09:41	10:11	10:23	00:23	15:23

Tabela 3:. Cronograma de amostras para testes de artigos de teste líquidos etapas do Protocolo, incluindo o pré-molhar os tecidos com DPBS, Aplicação dos artigos de teste (TAS), lavagem e pós-estabilização, período de pós-incubação, MTT, Extração de MTT, e medição de OD MTT são apresentados nas colunas. Os tempos para os tecidos duplicados são organizados em fileiras. Todo o teste de ensaio de 10 assistentes técnicos e controles pode ser terminado em um dia.

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Hora de início para as etapas do protocolo do IET (2 dias trabalhar para um operador)
Cada linha corresponde a um par de tecidos
Dia 1					Dia 2 (dia seguinte)
Pedido de passos:	1	2	3	4	5	6	7
Sólidos:	PBS	TA Exposição	Pós- Embeber	Pós- Incubaction	MTT Reação	MTT Extração	Medida
	30 min	6 hr	26 min	18 hr	180 min	120 min	OD
NC	09:00	09:30	15:30	15:56	09:56	12:56	depois
PC	09:02	09:32	15:32	15:58	09:58	12:58	15:30
TA-1	09:04	09:34	15:34	16:00	10:00	13:00
TA-2	09:06	09:36	15:36	16:02	10:02	13:02
TA-3	09:08	09:38	15:38	16:04	10:04	13:04
AT 4-	09:10	09:40	15:40	16:06	10:06	13:06
TA-5	09:12	09:42	15:42	16:08	10:08	13:08
TA-6	09:14	09:44	15:44	16:10	10:10	13:10
TA-7	09:16	09:46	15:46	16:12	10:12	13:12
TA-8	09:18	09:48	15:48	16:14	10:14	13:14
TA-9	09:20	09:50	15:50	16:16	10:16	13:16
TA-10	09:22	09:52	15:52	16:18	10:18	13:18

Tabela 4: calendário amostra para o teste dos artigos em ensaio sólidos. Etapas do Protocolo, incluindo o pré-molhar os tecidos com DPBS, Aplicação dos artigos de teste, Enxaguar e Pós-molhe, período de pós-incubação, MTT, Extração de MTT, e Mensuração de MTT OD são apresentados em colunas. Os tempos para os tecidos duplicados são organizados em fileiras. Todo o ensaio testando 10 ATs e controles é realizado ao longo de um período de dois dias.

Quantidade	Reagente	Condições de armazenamento	Fonte	Descrição	Data de validade
1 frasco, 2 ml	Concentrado de MTT (MTT-100-CON)	Protegido da luz (-20ºC)	MatTek	Congelado concentrado MTT	2 meses
1 frasco, 8 ml	MTT diluente	2-8 &# 186; C	MatTek	Para a diluição de concentrado de MTT antes da utilização no ensaio de MTT	2 meses
1 garrafa, 60 ml	Isopropanol (CAS # 67-63-0)	RT	Sigma-Aldrich	Solução de extracção	N / D

Tabela 5: Componentes do MTT-100 kit de ensaio.

Código N °	Tecido	Dados não tratados		Dados corrigidos em branco		média de OD	% De viabilidade
	n	Aliq. 1	Aliq. 2	Aliq. 1	Aliq. 2
NC	1	1.316	1.352	1.316	1.352	1.334	101.6
	2	1.277	1.309	1.277	1.309	1.293	98,4
PC	1	0,379	0,397	0,379	0,397	0,388	29,6
	2	0,419	0,442	0,419	0,442	0,431	32,8
TA1	1	1.213	1.244	1.213	1.244	1.229	93,5
	2	1.355	1.355	1.355	1.355	1.355	103.2
TA2	1	1.210	1.122	1.210	1.122	1.166	88,7
	2	0,828	0,837	0,828	0,837	0,833	63,4
TA3	1	0,167	0,168	0,167	0,168	0,167	12,7
	2	0,138	0,136	0,138	0,136	0,137	10,4
TA4	1	1.137	1.160	1.137	1.160	1.149	87,4
	2	1.262	1,191	1.262	1,191	1.227	93,4
TA5	1	0.610	0,621	0.610	0,621	0,616	46,9
	2	0,480	0,484	0,480	0,484	0,482	36,7
TA6	1	0,502	0,513	0,502	0,513	0,508	38,7
	2	0,396	0,407	0,396	0,407	0,402	30,6
TA7	1	1.048	1.050	1.048	1.050	1.049	79,9
	2	1.149	1.150	1.149	1.150	1.150	87,5
TA8	1	1.032	1.034	1.032	1.034	1.033	78,7
	2	0,941	0,935	0,941	0,935	0,938	71,4
TA9	1	0,022	0,022	0,022	0,022	0,022	1.7
	2	0,144	0,149	0,144	0,149	0,147	11.2
TA10	1	0,150	0,150	0,150	0,150	0,150	11,4
	2	0,254	0,255	0,254	0,255	0,255	19,4

	significar	Dif.	média de	Dif.	Dif. / 2	Classificação
	de OD	de OD	viabilidades [%]	de viabilidades
NC	1.314	0,041	100.0	3.12	1.56	NI	qualificado
PC	0.410	0,043	31,2	3.23	1.62	EU	qualificado
TA1	1.292	0,127	98,3	9.63	4.81	NI	qualificado
TA2	0.999	0,333	76,1	25.36	12,68	NI	D> 20
TA3	0,152	0,030	11,6	2.32	1.16	EU	qualificado
TA4	1.188	0,078	90,4	5,94	2.97	NI	qualificado
TA5	0,549	0,134	41,8	10.16	5.08	EU	qualificado
TA6	0,455	0,106	34,6	8,07	4.03	EU	qualificado
TA7	1.100	0,101	83,7	7,65	3,82	NI	qualificado
TA8	0,986	0,095	75,0	7,23	3.62	NI	qualificado
TA9	0,085	0,125	6.4	9.48	4,74	EU	qualificado
TA10	0,203	0,105	15,4	7.95	3.98	EU	qualificado

Tabela 6:. Resultados do IET obtidos por 10 artigos de teste, controles NC e PC As mesas estão produced por uma planilha do Excel projetado para calcular a viabilidade do tecido e os resultados do IET. Produtos químicos de teste que reduziu a viabilidade do tecido ≤ 60,0% em relação ao NC são classificados como irritantes ("I", TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10) e produtos químicos de teste que tiveram a viabilidade do tecido> 60,0% são classificados como não-irritantes (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7, e TA8).

Discussão

Nós apresentamos o Olho Irritação Test (Figura 1), que foi desenvolvido para o modelo de tecido EpiOcular. O IET é capaz de separar irritantes e corrosivos oculares (GHS Categorias 1 e 2 combinados) a partir de materiais que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria) com alto grau de sensibilidade e especificidade ^17. O IET, tal como apresentado aqui não discrimina entre GHS Categoria 1 de Categoria 2 produtos químicos. O EIT foi validado para a classificação e rotulagem de irritação ocular potencial de uma vasta gama de produtos químicos, incluindo cosméticos e farmacêuticos ingredientes. Em conjunto com outros testes in vitro, o IET irá servir como um substituto para o ensaio de irritação in vivo do olho de coelho.

O IET utiliza dois protocolos similares mas distintas de materiais líquidos e sólidos, os quais variam no tempo de exposição e períodos de incubação de pós-exposição (Figura 1). O endpoint utilizado na EITé a viabilidade do tecido, determinada pelo ensaio de MTT, que tenha sido previamente usado em modelos validados de tecidos epiteliais humanos ^20,21. Para realizar este ensaio, não é necessário nenhum equipamento especial além de equipamentos de cultura de células padrão. Devido ao nível elevado de reprodutibilidade de tecido-a-tecido, n = 2 tecidos, em vez de o habitualmente recomendado n = 3 são utilizados. A capacidade de utilizar n = 2 tecidos é um aspecto crítico do protocolo, uma vez que permite que um operador experiente para processar simultaneamente dois tecidos, minimizando assim a variabilidade do ensaio que podem surgir devido ao diferente tratamento dos tecidos individuais ^14. Além disso, usando n = 2 tecidos por artigo, o teste de irritação de 10 substâncias de teste do mesmo estado físico (sólido ou líquido), juntamente com os controlos positivos e negativos, pode ser avaliada utilizando um kit (24 tecidos).

Outros pontos-chave que garantem classificação confiável de materiais estão as especificações para o controlo positivo substance (a viabilidade do tecido ≤50.0%), reprodutibilidade entre os tecidos duplicados (diferença <20,0%), e leituras de controle negativo (> 0,8 e <2,5).

Ao realizar o teste IET, é importante para aderir ao protocolo e validado para a dosagem sugerida e enxaguamento horários (Tabelas 3 e 4), uma vez que o desvio a partir do protocolo ou alterações nos períodos de incubação pode resultar em resultado alterada. Da mesma forma, os desvios do tempo de 3 horas para MTT incubação irá resultar em leituras diferentes MTT e pode afetar o resultado do ensaio.

Ocasionalmente, um produto químico de teste pode ter propriedades ópticas ou outras que possam interferir com o ensaio de viabilidade de tecido ou a redução de MTT causa de MTT. Por exemplo, um produto químico de teste pode reduzir directamente o MTT em azul-violeta do produto de reacção, ou pode ser uma substância que absorve a luz colorida no mesmo intervalo de formazano de MTT (~ 570 nm). No entanto, esses produtos químicos de teste vai present um problema apenas, se no momento do ensaio MTT, uma quantidade suficiente do material ainda está presente no (ou absorvidas por) o tecido. Para evitar esta interferência, procedimentos de lavagem extensivos são incorporados ao protocolo de TIE. Se a lavagem não remove o TA eo TA interfere com a redução do MTT, controles adicionais devem ser usadas para detectar e corrigir para ele. Resumidamente, se houver suspeita de redução MTT direta da substância química de ensaio, 50 jul (ou 50 mg de sólidos) do produto químico em questão é incubada durante 3 horas com uma solução de MTT a trabalhar na SCC (NC, 50 mL de água deionizada estéril, deve ser executados simultaneamente). Se a solução MTT fica azul-roxa, o artigo de teste se presume ter reduzido o MTT. Neste caso, um teste de funcionamento utilizando os controlos de tecidos mortos a criodessecagem, devem ser realizadas para avaliar se a substância de ensaio é obrigatório para o tecido e que conduz a uma redução do MTT sinal falso. Se houver redução MTT apreciável no TA-exposto, controlo de tecido morto(em relação à quantidade no tecido viável não tratada), a viabilidade dos tecidos significativo do artigo de teste deve ser corrigida subtraindo a viabilidade média do controlo morto.

O IET erra no lado da segurança, como demonstrado pela baixa incidência de falsos negativos classificações ^14,15,18. É importante ressaltar que nenhum dos GHS Categoria 1 produtos químicos, que são corrosivos para o olho e que representam o mais sério perigo ocular, foram classificadas como não-irritante neste ensaio ^14,15,18,19. Finalmente, uma das principais vantagens do método de ensaio rhce em vitro, é a possibilidade de testar puro líquido e matérias sólidas (as quais não é possível com culturas de células, submersas bidimensionais).

O EIT contribuirá significativamente para a determinação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de materiais de acordo com o sistema de classificação e rotulagem GHS. A substituição dos animais para determinar otoxicidade cular tem sido uma meta da pesquisa toxicológica por muitos anos. O método de ensaio EIT concluiu um estudo de validação formal apoiado por EURL ECVAM em 2014 eo EpiOcular EIT foi implementada nas Orientações de ensaio da OCDE como a OCDE TG 492 em 2015.