복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

요약

우리는 세 가지 차원 재구성 된 인간의 각막과 같은 상피 (RHCE) 조직 모델을 활용하여 눈 자극 테스트를 개발했습니다. 시험은 안구 자극과 부식성 물질 (GHS 분류 1과 결합 2) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 구별 할 수있다.

초록

유럽​​ 연합 (EU) 화장품 지침 및 EU REACH 법령에 일곱 번째 수정 조항을 준수하기 위해, 사람의 안구 독성의 안정적이고 정확한 평가를위한 검증 된 비 동물 대체 방법이 필요하다. 이러한 필요를 해결하기 위해, 우리는 눈 자극 테스트 정상적인 인간 세포에 기반 삼차원 재구성 인간 각막 상피​​ 형상 (RHCE) 조직 모델을 이용한다 (EIT)를 개발 하였다. EIT는 안구 자극 및 부식 (GHS 분류 1과 2 결합) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 분리 할 수​​있다. 시험은 두 개의 별도의 프로토콜, 액체 화학 물질과 고체 시험 기사에 대한 두 번째, 유사한 프로토콜에 대한 설계를 사용합니다. EIT 예측 모델은 단일 노광 시간 (30 분 액체, 고체 6 HR) 및 단일 조직 생존력 컷오프 (MTT 분석에 의해 결정된 바와 같이 60.0 %)을 사용한다. EIT는 95.5 / 68.2 / 81.8 %의 달성 SENS (44 액체 및 고체 39) (83) 화학 결과에 기초itivity / 특이도 및 정확도 (SS & A) 액체, 고체 용 / 68.4 100.0 / 84.6 % SS & A, 및 97.6 / 68.3 / 전반적인 SS & A의 83.1 %. EIT는 규제 테스트 요구 사항을 충족하기 위해 동물을 사용하지 않고 액체 및 고체 화학의 넓은 범위의 잠재적 인 안구 자극을 분류에 크게 기여할 것이다. EpiOcular EIT 방법은 TG 492으로 OECD 시험 가이드 라인으로 2015 년 구현되었습니다.

서문

화장품, 세제, 가정용 청소기 등의 가전 제품은 눈에 문의 할 경우 심각한 손상을 유발시킬 수있는 화학 물질의 다양한 포함되어 있습니다. 따라서, 눈 자극에 대한 이러한 에이전트의 테스트는 소비자 안전 ^1을 보장하기 위해 미국과 유럽 연합 (EU) 규제 기관이 필요합니다. 혼합물 및 제제의 눈 자극 잠재력의 평가는 화학 물질의 운송에 대한 유럽 연합 (EU) 화장품 지침에서 화장품 성분의 표시에 대한 REACH (등록, 평가, 허가 및 화학 물질의 제한)과 법률을 준수 요구 사항이며, 대한 살충제 및 가정용 제품 ^(2)의 표시. 현재, 규제 기관은 화학 물질의 분류 및 표지 (GHS) ^3의 세계 조화 시스템을 사용하여 안구 유해성 평가가 필요합니다. GHS는 주로 드레 이즈 눈 자극 테스트에 기초하고, 가장 널리 사용되는 눈 자극 분석되는 이물질 및 MIxtures는 토끼 눈 ^(4)의 결막 낭에 직접 도입된다. GHS 분류에 따르면, GHS 분류 1 (안구 부식)는 눈의 조직이나 노출 ^3,5 다음 21 일 이내 완전히 되돌릴 수 없습니다 눈과 시력에 심각한 손상이 심한 초기 부상의 원인이 화학 물질을 테스트하는 데 의미합니다. GHS 분류 2 노출 21 일 이내에 완전히 뒤집을 수있는 눈에 큰 변화를 생산 화학 물질을 테스트하는 의미. 부식 또는 자극없는 시험 화학 물질은 GHS 없음 카테고리라고합니다.

40 년 이상, 드레 이즈 토끼 눈 검사는 재현성의 부족, 인간의 응답의 과대 평가, 그리고 살아있는 동물 ^5-8의 사용에 대한 비판을 받아왔다. 이러한 우려는 정제, 감소, 및 생체 내 시험 ^(9)의 교체를위한 많은 제안을 장려하고있다. 검증이 아닌 동물에 대한 대안이 필요 더욱 강화시켰다(2009 년) 화장품 (2005 년) 화장품의 안전성 평가에서 동물의 사용을 금지 지침 및 성분에 일곱 번째 수정안의 채택에 의해 ^2.

1996 년 이후, 재구성 된 각막 형상 조직 모델 널리 원료, 계면 활성제 계 제제의 자극 잠재력을 평가하기 위해 화장품 산업에서 사용하고, 사용하기 위해 설계된 이들의 혼합물을 배합하거나, 눈의 근방에 한 ^10-13. RHCE 조직 모델의 사용은 네이티브, 희석되지 않은 형태로 직물 표면에 시험 물질을 직접 국소 적용을 허용한다. 이와 같이, 비 수용성 용매로 제형은 이들을 희석없이 테스트 될 수있다. 광범위하게 적용 할 수있는 간단하고 경제적 인 방법 요청 (대체 방법의 유효성 검사에 대한 유럽 연합 (EU) 참조 연구소 유럽 센터) EURL의 ECVAM의에 대한 응답으로 눈 자극 시험 (EIT)는 자장하게를 사용하는즉 노출 시간 및 라벨을 필요로하지 않는 물질로부터 안구 자극 및 부식을 분리 할 수있다 (그림 1) ^(14)를 개발 하였다. (83) 화학 (44 액체 및 39 고체)의 결과를 바탕으로, EIT는 95.5 / 68.2 / 81.8 % 민감도 / 특이도 및 정확도 (SS & A) 액체, 고체에 대한 100.0 / 68.4 / 84.6 % SS & A, 및 97.6을 / 달성 68.3 / 전반적인 SS & A의 83.1 %.

2007 년, EURL의 ECVAM의 후원하에 화장품 유럽 (구 COLIPA)에 의해 후원 멀티 실험실 사전 검증 연구는 공식 확인 ^(15)에 데려의 목적으로 EIT의 관련성과 신뢰성을 평가 하였다. 본 연구에서는 298 독립적 인 시험 일곱 독립적 인 실험실에서 수행 하였다. 연구 결과는 참여하는 모든 실험실 ^(15)에 걸쳐 변화의 낮은 계수 예측에 99.7 % 계약을 보여 주었다. 그 결과, 2010 년 EIT 프로토콜 형식 EURL ECVAM 진입검증 프로그램입니다. 검증 연구는 생체 내 참조 데이터 (드레 이즈 눈 자극 데이터) 사용할 수 있었던하는 개별 물질 및 화학 혼합물을 포함하여 104 코딩 테스트 화학 물질을 이용했다. 이 연구의 성공에 기초하여, OECD 초안 시험 지침 그것이 EIT는 UN GHS의 분류 및 표시 시스템에 따라 다양한 재료의 눈 자극 전위의 분류에 크게 기여할 것으로 기대된다 (2014)에 제출 하였다.

프로토콜

처리를위한 RHCE 조직 1. 준비 - 일 0

1. 상업 인간의 각막과 같은 상피 (RHCE) 키트를 수신하면, 온. EIT 분석 (표 2)를 수행하는 데 필요한 모든 키트 무결성 (키트 자세한 내용은 구성 요소 참조 표준 분석 키트 구성 요소 (표 1)과 장비 및 재료를 확인 영수증의 날, 15 분 동안 실온 (그것의 24 웰 선적 컨테이너) 조직을 평형.

양	시약	조건	출처	기술	유통 기간
1	EpiOcular 조직의 봉인 된 24 웰 플레이트 (OCL-200)	2-8 ° C	매텍	24, 담배 마는를 포함세포 배양의 단말은 아가 로스에 패키지를 삽입	72 시간
1 병, 200 ml의	EpiOcular 분석 중간 (OCL-200-ASY)	2-8 ° C	매텍	DMEM 기반 매체	이십일일
1 병, 100 ㎖	마그네슘 + + - 무료 Dulbecco's-PBS (DPBS를) ++ ca를	RT	알드리치, D5652, 또는 당량.	삽입 세척에 사용	일년
4	6 웰 플레이트	RT	매	분석 프로토콜 동안 조직을 유지하는 데 사용	NA
(2)	12 웰 플레이트	RT	매	분석 프로토콜 동안 사용	NA
(2)	24 웰 플레이트	RT	매	MTT 분석을 수행하는 데 사용	NA
1 병, 0.5 ml의	메틸 아세테이트 (CAS 번호 79-20-9)	RT	알드리치, 고양이 # 186325	분석에서 PC로 사용	1 개월

표 1 : 표준 분석 키트 구성 요소.

장비 / 재료	에 필요한 :
가습 인큐베이터 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 90 ± 10 % 습도)	이전과 분석 기간 동안 배양 조직
층류 후드	멸균 조건에서 안전 작업
진공 펌프 (선택 사항)	매체 및 솔루션 흡입
플레이트 리더 광도계 (96 웰 플레이트)	읽기 OD
플레이트 쉐이커	추출물포르 마잔의 이온
살균, 무딘 칼날 집게	조직 삽입 처리
- 시계를 중지	프로토콜의 시험 자료 및 기타 시간 제한 단계의 적용시기
수조 (37 ± 1 ° C)	온난화 미디어와 MTT 솔루션
박격포와 유 봉	세분화 된 고체를 연삭
긍정적 인 변위 피펫 (50 μL)	점성 및 반 고체 물질 및 현탁액의 응용 프로그램
조정 피펫 (200 μL-2 ㎖)	액체 재료 분석 배지와 MTT인가
사전 멸균 팁 (200 μL, 20 μL), RAININ 고양이 # 1 HR-200F와 HR-20F (또는 동급)	액체 재료 분석 배지와 MTT인가
와이드 오리피스 미리 멸균 팁 (250 μL), RAININ 고양이 # 1 HR-250WS (또는 당량alent)	점성 및 반 고체 물질 및 현탁액의 응용 프로그램
8온스 / 220 ml의 용기 표본, 팔콘 고양이 # 3540200 (또는 동급)	조직을 세척
멸균 일회용 주사기 (예 : 주사기 Omnifix-F, B. 브라운 Melsungen AG, 고양이 tuberkulin 1 ml의. 제 9161406V)	~ 50 mg의 고체 물질의 공급 (옵션)
테드 펠라 마이크로 주걱 / 숟가락, 테드 펠라 주식, 고양이 # 13504 (또는 이에 상응하는, 날카로운 숟가락 또는 뼈 큐렛, 예를 들어 AESCULAP, 번호 : FK 623)	~ 50 mg의 고체 자재의 납품
칼슘 ++ 및 마그네슘 ++ 무료 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (칼슘 + 마그네슘 + + 자유 DPBS) : 시그마 - 알드리치, 고양이 # 1 D5652 (또는 동급)	분석 기간 동안 세척 조직
무균 탈 이온수, 조직 배양 등급 (품질 생물학적 또는 동급)	NC으로 사용
96 웰 평평한 바닥 판, 팔콘 (또는 동급)	외경을 읽기위한
코튼 팁 스왑 (멸균)	조직 표면을 건조 (선택적) 미국
접착 테이프 또는 파라 필름	포르 마잔 추출시 플레이트를 커버
MTT-100 분석 키트	MTT-티아 졸릴 블루 테트라 졸륨 브로마이드 시약 (시그마 # M-5655) 및 이소프로판올 추출물이 포함되어 있습니다.

표 2 : 장비와 EIT를 수행하는 데 필요한 재료.

2. 무균 조건 하에서, RHCE 조직과 24 웰 플레이트를 포함하는 비닐 봉투를 열고 멸균 거즈를 제거합니다. 아가 로스 젤 사이에 기포에 대한 모든 조직을 검사하고 삽입합니다. 삽입 영역, 결함이있는 조직 또는 조직의 WHI의> 50 % 삽입 커버 아래 기포와 문화를 사용하지 마십시오 채널 완전히 액체로 덮여있다.
3. 시험 기사 또는 제어 코드와 노출 시간으로 6 웰 플레이트 레이블. (키트에 제공됨) 정량법 중간의 분취 량 1.0 ㎖를, 미리 라벨링 된 6 웰 플레이트의 웰에, 약 37 ℃로 미리 가온.
4. 레이블 6 웰 플레이트에 삽입 RHCE 조직을 포함하는 각 삽입을 제거하고 배치 멸균 집게를 사용합니다. 이 단계 동안, 멸균 여과지에 블 롯팅하여 부드러운 삽입물의 외측에 부착 나머지 배송 아가 로스를 제거한다. 삽입 아래에 갇혀있는 공기 방울을 놓습니다.
5. 1 시간 동안 (37 ± 1 ℃에서 5 ± 1 % CO ₂ SCC, 습한 대기) 표준 배양 조건에 6 웰 플레이트에서 RHCE 조직을 사전 품어.
6. 1 시간 후, 37 ℃로 데워진 신선한 분석 중간 1.0 mL로 분석 매체를 교체하고 SCC 조건에서 RHCE 조직을 품어 (하룻밤 = O / N) (16-24 시간).

. ove_title "> 2 전처리 - 1 일

1. O / N 배양 한 후, 적절한 피펫 팅 장치를 사용 (제공 DPBS) ^칼슘 마그네슘 ^{2 +} - 무료 - 둘 베코의 인산염 완충 생리 식염수의 20 μl를 적용합니다. DPBS이 조직에 분산하지 않는 경우, 부드럽게 DPBS 전체 조직 표면을 젖게 할 수 있도록 보장 접시에 삽입을 누릅니다.
2. 30 ± 2 분 동안 SCC에서 RHCE 조직을 품어.
   이 단계는 조직의 수분에 필요한 생체 조건에서 모방 참고.

3. 시험 재료 노출 절차

1. RHCE 조직이 발생하도록 각각의 시험 물질 및 제어를 적용 (N = 2). 테스트 문서 투약 절차는 액체 및 고체 다릅니다. 국소 피펫을 사용하여 액체 테스트 기사의 50 μl를 적용합니다. 액체에 대한 노출 시간은 30 분이다. (염화 나트륨 50 mg의를 개최 보정) 수평 숟가락을 사용하여 고체 시험 기사의 50 mg의 적용합니다. 전고체에 대한 브라케팅 프로그램, 노출 시간은 6 시간이다.
   주 : 액체가 피펫 팅 장치를 이용하여 적용 할 수있는 액체 물질 (예를 들어, 액체, 겔 및 크림)로 정의된다. 고체 피펫을 사용하여 적용 할 수없는 비 유체 물질 (예를 들면, 분말, 수지 또는 왁스 물질)로 정의됩니다.
   1. 테스트 물품의 물리적 상태를 결정하는 것은 용이하지 않으면, 15 분 (37 ℃)에 대한 수욕 시험품과 튜브를 배치했다. 37 ℃에서 액화 그 시험 기사에 대한 액체 EIT 프로토콜을 따르십시오.
   2. 특히 점성 물질에 대한 긍정적 인 변위 피펫을 사용합니다.
2. 먼저 음성 대조군과 양성 대조군을 투약 한 후 테스트 기사를 선량.
   1. 음성 대조군 (NC) 및 표준 피펫을 사용하여 RHCE 조직에 양성 대조군 (PC)의 50 μl를 적용합니다. NC는 멸균 탈 이온수이다; PC는 메틸 아세테이트 (CAS 번호 79-20-9)이다. 때 시험 30 분 동안 NC와 PC 적용액체 테스트 기사를 보내고 6 시간 동안 고체 테스트 제품을 테스트 할 때.

4. 시험 제 노출 - 1 일

1. 액체 시험 기사의 치료를 위해. 표 3에 주어진 타이밍 일정을 따라 모든 조직에 대한 동일한 노출을 보장하기 위해 각 테스트 문서의 응용 프로그램 사이에서 1 분 간격으로 둡니다.
   1. 30 ± 2 분 전처리 후 DPBS, 국소 국소 적절한 페팅 장치를 사용하여 조직에 RHCE 50 NC 및 PC의 μL, 각 액체 시험 물질을 적용한다.
   2. 상부면을 다루 직접 조직에 액체 테스트 문서의 50 μl를 적용합니다. 점성 물질의 구멍을 넓혀 피펫 팁의 좁은 지점을 잘라. 점성 재료, 투약 장치 시험품 (티슈 삽입 또는 플라스틱 압정의 내경보다 약간 작은 직경의 평평한 향하고 실린더)를 적용, 투여 D 반전evice과 조직에 배치 시험 문서는 균일하게 접촉 조직 표면을되도록.
   3. 테스트 문서는 조직에 분산하지 않는 경우, 부드럽게 전체 조직 표면에 퍼져 있는지 확인 삽입을 누릅니다. 기계 (피펫 팁으로, 예를 들어) 시험 기사의 확산은 조직에 손상을 줄 수 있기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다.
   4. 30 ± 2 분 동안 SCC에서 조직을 품어.
2. 고체 시험 기사의 치료를 위해 -. 1 일, 표 4에 주어진 타이밍 일정을 따라 모든 조직에 대한 동일한 노출을 보장하기 위해 각 테스트 문서의 응용 프로그램 사이에서 2 분 간격을 둡니다.
   1. 30 ± 2 분 전처리 후 DPBS, 국소 적당한 피펫 팅 장치를 이용 RHCE 조직에 50 μL의 NC와 PC를 적용.
   2. 고체 테스트 문서 응용 프로그램의 경우 삽입물을 제거 (N = 2) 우물에서와은 (멸균 표면에 그들을 배치 예를 들어, 오전 뚜껑ultiwell 판) 매체에 흘리 테스트 문서를 방지 할 수 있습니다.
   3. 계단이 숟가락을 사용하여, 국소 적 조직 표면 상에 시험 물질의 약 50 mg의 적용; 조직의 표면이 완전히 테스트 문서에 포함되어 있는지 확인하십시오. 시험 물질은 조직에 분산되지 않는 경우, 조직이 완전히 시험 물질에 의해 커버되도록 좌우로 부드럽게 삽입을 흔들어. 기계 (피펫 팁으로, 예를 들어) 시험 기사의 확산은 조직에 손상을 줄 수 있기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다.
      1. 필요한 경우, 시험 물질과 조직 사이에 더 나은 접촉을 보장하기 위해 박격포와 유 봉 결정 성 분말을 분쇄.
      2. 또한, 머리와 1 ML의 주사기를 사용하여 삽입 내부의 조직 배양에 직접 장소 분말은 차단. 주사기에 물건 분말은 플런저 다시 그린 후 아래로 플런저를 눌러 적용됩니다.
      3. 인서트의 외벽이 C 인 경우ontaminated 예를 들어, 분말에 의해, 멸균 거즈로 입자를 닦아.
   4. 투여 한 후, 배양 배지를 함유하는 6- 웰 플레이트에 조직을 반환하고 15 분 ± 6 시간 동안 부화 SCC.

5. 린스

1. 시험 문서에 세 깨끗한 비커 (150 mL의 용량)의 세트를 준비하고 DPBS 100 ㎖로 그들 각각을 입력합니다. 각 테스트 기사를 들어, 세 개의 비커의 다른 세트를 사용한다.
2. 30 ± 2 분, 액체 재료에 대한 노출 또는 고체 물질에 대한 15 분의 노출 ± 6 시간의 끝에서 제거하고 사용 하였을 경우 투여 장치를 폐기.
3. 미세 집게로 플라스틱 '칼라'의 상단 모서리를 잡고 매체 중 RHCE 조직을 포함하는 인서트를 들어 올립니다. 취급 및 디캔팅을 용이하게하기 위해 곡선 집게를 사용합니다. 집게를 사용하여 칼라에 의해 서로 중복 인서트를 유지함으로써 한 번에 두 개의 조직을 헹군다. 주의 N 수집게와 조직을 손상 OT.
4. 깨끗한 흡수성 재료 상 조직 표면에서 시험 기사 또는 컨트롤 (종이 타월, 거즈 등) 따르다
5. , DPBS, 약 2 초 동안 DPBS에 원을 그리 소용돌이의 첫 번째 비커에 삽입을 찍어 그들은 대부분 DPBS로 가득되도록 삽입을 들어, 다시 비커에 액체를 가만히 따르다. 첫 번째 비커에이 과정을 세 번 반복합니다.
6. 동일한 방식으로 3 회 DPBS의 두 번째 및 세 번째 비커에 삽입 헹군다.
7. 흡수 물질에 삽입에 남아있는 액체를 가만히 따르다. 대략 45 ° 각도 (오픈 엔드 아래)에 삽입을 돌려 흡수 물질로 윗입술을 터치합니다.
   주 : 볼 시험 물질을 모두 제거 할 수없는 경우, 더 린스가없는 과도한 처리에 조직 손상을 방지하기 위해 수행되어야한다.

6. 후 흡수

1. 세척 한 후,직전 미리 라벨링 된 12 웰 플레이트에서 RT로 가온 정량법 중간 5ml에 조직 몰입.
2. 액체 재료의 12 ± 2 분, 또는 임의의 잔여 시험 물질의 제거를 용이하게하기 위하여 RT에 침지하여 고체 물질의 25 ± 2 분 동안 조직을 배양한다.

7. 후 배양

1. 끝나면 침지 기간 후 담근다 조직으로부터 정량법 중간 캔트 및 흡수성 재료에 삽입시킨다.
2. 따뜻한 중간 정량법 1 ㎖를 함유하는 미리 라벨링 된 6 웰 플레이트에 삽입물을 전송.
   1. 액체 시험 물질에 대한 SCC에서 120 ± 15 분 동안 조직을 품어.
   2. 고체 시험 물질에 대한 SCC에서 18 ± 0.25 시간 동안 조직을 품어.

8. MTT 생존 분석 - 1 일 (액체 프로토콜)과 2 일 (고체위한 프로토콜)

1. (120)의 후 배양 후 MTT 분석을 수행77; 액체 15 분 각각 고형분 18 ± 0.25 시간,.
2. 미리 라벨링 된 24- 웰 플레이트의 각 웰에 1.0 ㎎ / ㎖ MTT 용액 및 용액의 분취 액 0.3 mL로 제조.
   1. 상업 MTT 키트 (표 5)를 사용하여 :
   2. 사용하기 전에 2 시간은 실온에서 MTT 집중을 해동. 2 MTT 농축 mL 및 1.0 ㎎ / ㎖ MTT 용액을 생성하기 위해 MTT 희석제 8ml의 결합.
   3. 사용할 때까지 어둠 속에서 4 ° C에서 MTT 솔루션을 저장합니다. 1 개 이상 하루 MTT 솔루션을 보관하지 마십시오.
3. 포스트 인큐베이션의 끝에, 6- 웰 플레이트에서 각각의 삽입 체를 분리하고 부드럽게 흡수 물질에시킨다.
4. MTT 용액 0.3 ml에 포함 된 24 웰 플레이트에 삽입을 놓습니다. 삽입 아래에 갇혀있는 공기 방울을 놓습니다. SCC에서 180 ± 10 분 동안 접시를 품어.
5. MTT 추출
   1. MTT 용액에서 180 ± 10 분 부화 후, 각각의 삽입물을 분리및 24- 웰 플레이트로부터 흡수성 재료에 인서트의 바닥을시킨다.
   2. 비 착색제 액체 테스트 제품 (침수 추출)의 경우 :이 삽입 잠기도록 추출 제 솔루션 (이소프로판올)의 2.0 ml의를 포함하는 미리 라벨링 24 웰 플레이트에 삽입을 전송합니다.
   3. 고체와 액체의 착색제를 들어 (비 침수 추출 용매 용액의 오염을 방지 할 추출)이 삽입 잠수함 않도록 추출 용매 용액 1.0 ㎖ (이소프로판올)을 함유하는 미리 라벨링 된 6 웰 플레이트에 삽입물을 전송.
      참고 : 해당 부정과 긍정적 인 컨트롤 같은 비 침수 추출을 수행합니다.
6. (플레이트 커버와 우물의 상단 가장자리 사이의 또는 표준 플레이트 실러와 파라 필름으로, 예를 들어) 판을 밀봉. 궤도 판 쉐이커에 접시를 놓고 MTT를 추출하기 위해 2 실온에서 시간 3 흔들어.
   1. 또한, 2-8에서 추출 O / N을 수행76, 흔들림없이 어둠 속에서 C.
7. 비 액체 착색제 시험 기사 (잠긴 추출)의 경우 : 추출 기간의 끝에서, 각각의 액체가 다시 잘 삽입 및 RHCE 조직과 삽입물을 폐기 가만히 따르다.
   1. 추출액을 혼합하고, 플레이트의 구성 (도 2)에있어서 미리 라벨링 된 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 두 200 μL 분취를 전송.
8. 고체와 액체 염료 (비 침수 추출)의 경우 : 추출 기간이 종료되면 조직이 (조직을 관통하지 않도록주의) 폐기합니다.
   1. 조직으로부터 추출 된 용액을 함유하는 24- 웰 플레이트의 각 웰에 추출 용매의 용액 1.0 mL로 추가한다. 추출 용매 용액을 혼합하고 상기 플레이트의 구성 (도 2)에있어서 미리 라벨링 된 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 두 200 μL 씩 옮긴다.
9. T를 결정그는 550 및 590 nm의 사이에 단일 파장에서 추출 된 샘플의 광학 밀도 (OD) 플레이트 리더 또는 분광 광도계에 (실험실 내에서 일치해야합니다).
   1. 불용성 고체로 인한 혼탁 추출물 솔루션, 원심 분리기 외경 (증발을 방지하기 위해 4 ° C에서 원심 분리기를 냉각)를 측정하기 전에 솔루션을 경우. 경우 세정의 테스트 문서 (TA)를 제거하지 않고 TA는 MTT 감소 방해, 추가 컨트롤을 사용할 수 있어야합니다. MTT 감소 ^(16)을 보정하기 위해 상세한 SOP를 참조하십시오.
   2. 경우 TA가 갖도록, 또는 MTT 측정과 상호 작용할 수있는 발색 도시되어, 추가적인 테스트가 바인딩 색상의 양을 결정하기 위해 수행되고,이어서 조직으로부터 추출한다. 컬러 테스트 제 ¹⁶ 조를 수정하기 위해 상세한 SOP를 참조하십시오.

조직의 생존 능력 시험 (표 6과 그림 3) & # 9. 계산(160);

1. 일반 계산
   1. 각 실험에 대한 빈 제어 우물 (OD BLK)의 평균 OD 값을 계산합니다.
   2. 같은 실험 (BLK 데이터를 수정)의 각 OD 값에서 OD (BLK)을 뺍니다.
   3. 각각의 조직 (= 보정 OD)를위한 두 개의 분취 량의 평균값을 계산한다.
2. 평균 대조군 (100 % 컨트롤)을 각각 제어하고 시험품 상대적인 두 복제 각 조직의 생존 백분율을 계산한다.
   생존율 (%) = [보정 된 OD 처리 조직 / 보정 OD 음성 대조군] × 100 %
3. 생존 능력 (복제 두 조직 간 생존력 차이)의 차이를 계산한다.
4. 평균 시험품 생존율 (TA 생존)를 계산하고 예측 모델에 따른 시험품을 분류.

10. 예측 모델 (그림 3)

1. TA-처리 조직의 생존 능력은 NC 처리 조직 V에> 60.0 상대 인 경우iability는 비 - 자극성 (NI)와 같은 시험 물질 (GHS 없음 카테고리) 라벨.
2. TA 처리 조직 생존력이 NC 처리 조직 생존에 대하여 60.0 ≤이면 자극 (I)로서 시험품 레이블 (GHS 카테고리 1 및 2).
   참고 : EIT 시험 결과의 경우 자격을 갖춘 것으로 간주됩니다 :
   • EIT NC 외경> 0.8 <2.5;
   • (NC 상대적 %) EIT PC 조직 생존율 ≤50.0 %이고;
   • 두 복제 조직 (NC, PC, 테스트 문서)의 차이는 20.0 % <이다.

결과

10 테스트 제품 (TA) 및 부정과 긍정적 인 컨트롤을 실시 대표 EIT 결과는 표 6과 그림 3에 제시되어있다.이 NC는 100 % 조직의 생존에 해당하는 OD = 1.31에 대한, 따라서 PC (OD 평균 = 0.41) 평균했다 31.2 %의 상대 조직의 생존. EIT 프로토콜 고체 노출 프로토콜을 사용하여, 4 실험실에서 액체 노출 프로토콜 및 8 독립적 인 유효 실험을 이용하여 7 실험실에서 15 유효한 독립적 인 실험을 수행 한 결과, 액체 프로토콜을 사용하여 PC에 대한 평균 조직 생존율은 36.4 ± 4.0이었다 %와 고체 프로토콜 32.3 ± 6.4 %. 모든 경우, 양성 대조군의 결과는 60.0 % ^(15)의 컷오프 값 이하이었다.

그림 3, TA1, TA2, TA4, TA7에 표시하고, TA8 조직의 생존율> 60.0 %를 가지고 있었고, 따라서 "NI"로 분류 된 바와 같이. TA3, TA5, TA6, TA9 및 TA10은 조직 생존율의 X를했다04, 60.0 %, 따라서 "I"로 분류했다. 중복 된 조직과 조직의 생존 능력의 차이는 TA2의 제외한 모든 조교에 대한 <20.0 %였다. 그들은 모두 EIT 허용 기준 (10.2 절)를 만난 이후 따라서, TA2의 제외한 모든 시험 기사에 대한 결과는 "자격"으로 간주되었다. 이 때문에, 초기 실험에서 TA2 중복 조직 사이의 높은 변동성으로, 두 번째 실험은 공인 EIT 결과를 얻을 필요가 있었다.

본원 RHCE 조직 모델을 이용하여 설명한 바와 같이 EIT 시험 방법의 EURL ECVAM / 화장품 유럽 ^15,17-19 의해 정식 유효성 검증 multilaboratory 포함한 여러 연구에서 안구 자극의 평가에 사용 하였다. 모든 연구에서, EIT는 재현 할 것으로 보여 올바르게 화학 물질 (물질 및 혼합물 모두) 눈의 자극이나 눈에 심한 손상 교류에 대한 분류 및 표시를 필요로하지 않는 식별 할 수였다UN GHS ^15,17-19에 cording. EIT 시험 방법은 민감도, 특이도 및 전반적인 정확도 눈 자극에 대한 유효성 검사 관리 그룹 (VMG)의 허용 기준을 충족 현재는 생체 내 토끼 드레 이즈 테스트 ^(19)에 대한 부분 교체와 같은 형식적인 구현이 아직되지 않고 있습니다.

그림 1 : 액체 및 고체 시험 기사에 대한 EIT 프로토콜의 개요 약어 사용 : 오전, 분석 매체;. SCC, 표준 배양 조건; PBS, 둘 베코 인산염 완충 식염수; RT 실온.

그림 2. MTT 조직 생존 시험 표준 96 웰 플레이트 구성 두 200 μL 분취 량 TRA 아르미리 라벨링 된 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 nsferred. 약어가 사용 : NC, 음성 대조군; PC, 양성 대조군; TA1-TA20, 시험 기사 1-20; 빈, 추출 용매 솔루션입니다. 96- MTT 플레이트 구성은 RHCE 조직 생존 및 EIT 결과를 계산하도록 설계 Excel 스프레드 시트와 함께 사용된다.

그림 3 : EIT 결과는 10 시험 기사, NC 및 RHCE 조직 모델을 사용하여 PC 컨트롤에 대한 얻은 그래프는 EIT 결과를 제공하기위한 Excel 스프레드 시트에서 생성됩니다.. NC에 60.0 %의 상대 ≤ 조직의 생존을 감소 테스트 화학 물질은 "자극 ("I ", TA3, TA5, TA6, TA9 및 TA10) 및 조직의 생존이> 60.0 %가 비 자극으로 분류했다 테스트 화학 물질 (로 분류됩니다 NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 및 TA8).

EIT 프로토콜 작업 단계에 대한 시간 (하나의 연산자에 대한 일일의 일을) 시작
각 라인은 조직 일쌍에 해당
단계의 순서 :	1	(2)	3	4	(5)	6	7
액체 :	PBS	TA 노출	포스트 스며 들다	포스트 Incub.	MTT 반응	MTT 추출	측정
	30 분	30 분	12 분	120 분	180 분	120 분	외경
NC	9시	9시 반	10시	10시 12분	12시 12분	15시 12분	후
PC	9시 1분	9시 31분	10시 1분	10시 13분	12시 13분	15시 13분	17시 반
TA-1	9시 2분	9시 32분	10시 2분	10시 14분	12시 14분	15시 14분
TA-2 <> / STRONG	9시 3분	9시 33분	10시 3분	10시 15분	12시 15분	15시 15분
TA-3	9시 4분	9시 34분	10시 4분	10시 16분	12시 16분	15시 16분
TA-4	9시 5분	9시 35분	10시 5분	10시 17분	12시 17분	15시 17분
TA-5	9시 6분	9시 36분	10시 6분	10시 18분	12시 18분	15시 18분
TA-6	9시 7분	9시 37분	10시 7분	10시 19분	12시 19분	15시 19분
TA-7	9시 8분	9시 38분	10시 8분	10시 20분	12시 20분	15시 20분
NG> TA-8	9시 9분	9시 39분	10시 9분	10시 21분	12시 21분	15시 21분
TA-9	9시 10분	9시 40분	10시 10분	10시 22분	12시 22분	15시 22분
TA-10	9시 11분	9시 41분	10시 11분	10시 23분	12시 23분	15시 23분

표 3. 액체 테스트 제품의 테스트를위한 샘플 시간표를 포함하여 프로토콜 단계를 미리 습윤 DPBS, 테스트 문서의 응용 프로그램 (TAS), 헹굼과 함께 조직을 사후 담근 후 잠복기, MTT 분석, MTT의 추출, 및 MTT OD의 측정은 열에 표시됩니다. 중복 조직을위한 시간은 행에 구성되어 있습니다. 전체 분석 테스트 (10) 조교 및 컨트롤은 하루 만에 완료 할 수 있습니다.

e_content ">

(2 일 한 운전자에 대한 작업) EIT 프로토콜 단계는 시작 시간
각 라인은 조직 일쌍에 해당
1 일					2 일 (다음날)
단계의 순서 :	1	(2)	3	4	(5)	6	7
고체 :	PBS	TA 노출	포스트 스며 들다	포스트 Incubaction	MTT 반응	MTT 추출	측정
	30 분	6 시간	26 분	18 시간	180 분	120 분	외경
NC	9시	9시 반	15시 반	15시 56분	9시 56분	12시 56분	후
PC	9시 2분	9시 32분	15시 32분	15시 58분	9시 58분	12시 58분	15시 반
TA-1	9시 4분	9시 34분	15시 34분	16시	10시	13시
TA-2	9시 6분	9시 36분	15시 36분	16시 2분	10시 2분	13시 2분
TA-3	9시 8분	9시 38분	15시 38분	16시 4분	10시 4분	13시 4분
TA-4	9시 10분	9시 40분	15시 40분	16시 6분	10시 6분	13시 6분
TA-5	9시 12분	9시 42분	15시 42분	16시 8분	10시 8분	13시 8분
TA-6	9시 14분	9시 44분	15시 44분	16시 10분	10시 10분	13시 10분
TA-7	9시 16분	9시 46분	15시 46분	16시 12분	10시 12분	13시 12분
TA-8	9시 18분	9시 48분	15시 48분	16시 14분	10시 14분	13시 14분
TA-9	9시 20분	9시 50분	15시 50분	16시 16분	10시 16분	13시 16분
TA-10	9시 22분	9시 52분	15시 52분	16시 18분	10시 18분	13시 18분

표 4 : 고체 테스트 제품의 테스트를위한 샘플 시간표.를 포함하여 프로토콜 단계 사전 습윤 세정과, 포스트 - 흡수 후 잠복기, MTT 분석, MTT의 추출 및 MTT OD의 측정이 컬럼에 제시되어, DPBS, 시험 기사의 응용 프로그램과 함께 조직을. 중복 조직을위한 시간은 행에 구성되어 있습니다. 10 조교 및 컨트롤 테스트 전체 시험은 2 일에 걸쳐 수행된다.

양	시약	보관 조건	출처	기술	유통 기간
1 병, 2 ml의	MTT 집중 (MTT-100-CON)	빛으로부터 보호 (-20)	매텍	냉동 MTT 집중	2개월
1 병, 8 ml의	MTT의 희석제	2-8 &# 186; C	매텍	MTT 농축액을 희석 종래는 MTT 분석에서 사용하는	2개월
1 병, 60 ml의	아이소 프로필 알코올 (CAS 번호 67-63-0)	RT	알드리치	추출 용매 솔루션	NA

표 5 : MTT-100 분석 키트 구성 요소.

코드 N °	조직	원시 데이터		빈 보정 데이터		외경의 의미	생존의 %
	N	Aliq. 1	Aliq. (2)	Aliq. 1	Aliq. (2)
NC	1	1.316	1.352	1.316	1.352	1.334	101.6
	(2)	1.277	1.309	1.277	1.309	1.293	98.4
PC	1	0.379	0.397	0.379	0.397	0.388	29.6
	(2)	0.419	0.442	0.419	0.442	0.431	32.8
TA1	1	1.213	1.244	1.213	1.244	1.229	93.5
	(2)	1.355	1.355	1.355	1.355	1.355	103.2
TA2	1	1.210	1.122	1.210	1.122	1.166	88.7
	(2)	0.828	0.837	0.828	0.837	0.833	63.4
TA3	1	0.167	0.168	0.167	0.168	0.167	12.7
	(2)	0.138	0.136	0.138	0.136	0.137	10.4
TA4	1	1.137	1.160	1.137	1.160	1.149	87.4
	(2)	1.262	1.191	1.262	1.191	1.227	93.4
TA5	1	0.610	0.621	0.610	0.621	0.616	46.​​9
	(2)	0.480	0.484	0.480	0.484	0.482	36.7
TA6	1	0.502	0.513	0.502	0.513	0.508	38.7
	(2)	0.396	0.407	0.396	0.407	0.402	30.6
TA7	1	1.048	1.050	1.048	1.050	1.049	79.9
	(2)	1.149	1.150	1.149	1.150	1.150	87.5
TA8	1	1.032	1.034	1.032	1.034	1.033	78.7
	(2)	0.941	0.935	0.941	0.935	0.938	71.4
TA9	1	0.022	0.022	0.022	0.022	0.022	1.7
	(2)	0.144	0.149	0.144	0.149	0.147	11.2
TA10	1	0.150	0.150	0.150	0.150	0.150	11.4
	(2)	0.254	0.255	0.254	0.255	0.255	19.4

	평균	DIF.	의 의미	DIF.	DIF. / 2	분류
	OD의	OD의	생존율 [%]	생존율의
NC	1.314	0.041	100.0	3.12	1.56	NI	자격있는
PC	0.410	0.043	31.2	3.23	1.62	나는	자격있는
TA1	1.292	0.127	98.3	9.63	4.81	NI	자격있는
TA2	0.999	0.333	76.1	25.36	12.68	NI	D> (20)
TA3	0.152	0.030	11.6	2.32	1.16	나는	자격있는
TA4	1.188	0.078	90.4	5.94	2.97	NI	자격있는
TA5	0.549	0.134	41.8	10.16	5.08	나는	자격있는
TA6	0.455	0.106	34.6	8.07	4.03	나는	자격있는
TA7	1.100	0.101	83.7	7.65	3.82	NI	자격있는
TA8	0.986	0.095	75.0	7.23	3.62	NI	자격있는
TA9	0.085	0.125	6.4	9.48	4.74	나는	자격있는
TA10	0.203	0.105	15.4	7.95	3.98	나는	자격있는

표 6 :. 10 시험 기사를 얻을 EIT 결과, NC 및 PC ​​컨트롤은 테이블 자극하다조직의 생존과 EIT 결과를 계산하기위한 Excel 스프레드 시트로 uced. NC에 60.0 %의 상대 ≤ 조직의 생존을 감소 테스트 화학 물질은 "자극 ("I ", TA3, TA5, TA6, TA9 및 TA10) 및 조직의 생존이> 60.0 %가 비 자극으로 분류했다 테스트 화학 물질 (로 분류됩니다 NI ", TA1, TA2, TA4, TA7 및 TA8).

토론

우리는 EpiOcular 조직 모델을 위해 개발 된 눈 자극 시험 (그림 1)을 제시 하였다. GHS 분류 사이에 차별하지 않습니다 여기에 제시된 EIT는 민감도와 특이도 ⁽¹⁷⁾ EIT를 높은 수준으로 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 물질로 안구 자극 및 부식 (GHS 분류 1과 2 결합)를 분리 할 수있다 1 종류 2 화학 물질. EIT는 분류 및 화장품 및 제약 성분을 포함한 화학 물질의 넓은 범위의 눈 자극 전위 라벨링 검증 하였다. 시험 관내 시험에서 다른과 관련하여, EIT는 생체 내 토끼 눈 자극 시험에 대한 대체 될 것입니다.

EIT는 노광과 노광 후 배양 기간 (도 1)의 길이에 차이가 액체 및 고체 물질에 대해 유사하지만 구별되는 두 가지 프로토콜을 사용한다. EIT에 사용 종점이전에 검증 된 인간 상피 조직 모델 ^{(20, 21)에} 사용 된 MTT 분석에 의해 결정 조직 생존력이다. 이 분석을 수행하기 위해, 표준 세포 배양 장치 외에 특별한 장비가 필요하지 않다. 때문에 높은 조직 간 조직 재현성의 수준, N = 2 조직 대신에 일반적으로 권장 N = 3이 사용됩니다. 능력 N 사용 = 그것이 개별적인 조직 ^(14)의 다른 처리에 따라서 발생할 수있는 분석의 변동성을 최소화 숙련 작업자가 동시에 두 조직을 처리 할 수 보낸 두 조직은, 프로토콜의 중요한 측면이다. 또한, 양성 및 음성 대조군과 함께, 테스트 문서 당 N = 2 조직, 동일한 물리적 상태 (액체 또는 고체) 10 시험 물질의 자극성을 사용하여, 하나의 키트 (24 조직)을 사용하여 평가 될 수있다.

자료의 신뢰성 분류를 보장 다른 핵심 포인트는 양성 대조군 스와의 사양입니다bstance (조직 생존 ≤50.0 %), 중복 조직 (차이 <20.0 %) 및 ​​음성 대조군 OD 수치 (> 0.8 <2.5) 사이의 재현성.

EIT 시험을 수행 할 때 배양 기간에서 프로토콜 또는 변경에서 편차가 변경된 결과를 초래할 수 있기 때문에, 상기 검증 프로토콜과 제안 된 투여 및 세척 스케줄 (표 3 및 4)을 준수하는 것이 중요하다. 마찬가지로, MTT 배양을위한 3 시간의 시간의 편차는 다른 MTT의 수치가 발생합니다 및 분석 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

때때로, 시험 물질은 MTT 조직 생존 분석 또는 MTT의 원인 감소 방해 할 수있는 광학 또는 다른 특성을 가질 수있다. 예를 들어, 시험 물질은 직접 청자색 반응 생성물에 MTT를 줄일 수 있거나, MTT의 포르 마잔 (~ 570 ㎚)와 동일한 범위의 광을 흡수하는 착색 물질을 포함하는 것일 수있다. 그러나 이러한 시험 화학 물질은 홍보합니다MTT 분석시에, 충분한 양의 물질이 여전히 조직에 존재하는 (또는 흡수에 의해) 인 경우에만 문제 ESENT. 이러한 간섭을 피하기 위해, 광범위한 헹굼 절차는 EIT 프로토콜로 통합된다. TA를 제거하지 않습니다 세척 및 TA는 MTT 감소를 방해하는 경우, 추가 컨트롤이 감지하는 데 사용하고 그것에 대한 정확해야합니다. 시험 물질의 직접 MTT 환원이 의심되는 경우 간단히, 해당 화학 물질의 50 μL (또는 고체 50 mg)을 SCC (NC, 멸균 증류수 50 μL에서 작업 MTT 용액으로 3 시간 동안 인큐베이션되어 있어야 ) 동시에 실행합니다. MTT 용액 청자색 바뀌면 시험품은 MTT를 환원 한 것으로 추정된다. 이 경우, 동결 조직 살해 컨트롤을 사용하여 기능 검사는 시험 물질이 조직에 결합하고 거짓 MTT 환원 신호 선도 여부를 평가하기 위해 수행되어야한다. TA-노출, 사망 조직 관리에 상당한 MTT 감소가있는 경우(미처리 살아있는 조직의 양에 대해), 시험 제품의 평균 조직 생존력 살해 제어의 평균 생존을 감산에 의해 보정되어야한다.

위음성 분류 ^14,15,18의 낮은 발생 빈도에 의해 입증 된 바와 같이 EIT는 안전의 측면에 ^{잘못한다가.} 중요한 것은 눈에 부식성 및 GHS 분류 한 화학 물질, 아무도, 가장 심각한 안구 위험을 나타내는 없습니다 이 분석 ^{14,15,18,19에} 비자 극적으로 분류 하였다. 마지막으로, 시험 관내 시험 법에서 RHCE의 주요 이점 중 하나는 깔끔한 액체 (2 차원 수중 세포 배양 불가능) 고체 물질을 시험 할 가능성이있다.

EIT는 UN GHS의 분류 및 표시 시스템에 따라 다양한 재료의 안구 염증 가능성을 결정하는데 크게 기여할 것이다. 동물의 교체는 O 결정큘라 독성 몇 년 동안 독성 학적 연구의 목표였다. EIT 시험 방법은 2014 년 EURL ECVAM에서 지원하는 형식적인 검증 연구를 완료하고 EpiOcular EIT는 2015 년 OECD TG 492으로 OECD 테스트 가이드 라인으로 구현되었습니다.