התכווצות פציעה כרונית של עצב Infraorbital של העכברוש (יון-CCI) לחקר trigeminal נוירופתי כאב

Summary

This manuscript describes a rodent model to study trigeminal neuropathic pain. The methods described include surgical procedures to perform a chronic constriction injury of the rat’s infraorbital nerve and the post-surgical behavioral tests to measure the changes in spontaneous and evoked behavior that are indicative of persistent pain and allodynia.

Abstract

מודלים של בעלי החיים הם כלים חשובים ללמוד את הפתופיזיולוגיה ופרמקולוגיה בכאב עצבי. כתב יד זה מתאר את ההליכים כירורגיים והתנהגות ללמוד כאב נוירופתי trigeminal בחולדות. לפגוש את הספציפיות של תסמונות כאב נוירופתי trigeminal, עצב infraorbital (היון) הוא נתון לפגיעת התכווצות כרונית (CCI) על ידי באופן רופף ligating העצב. גישת התוך-מסלולית מוצגת כאן כדי לחשוף ולקשור היון בחלל מסלולית. לאחר קשירת היון, חולדות להציג שינויים בהתנהגות ספונטנית ובתגובה לגירוי שיער פון פריי שמעידים על כאב מתמשך ואלודיניה המכנית. ניתן להגדיר שני שלבים בהתפתחות של השינויים התנהגותיים. במהלך השבוע הבא היון-CCI (שלב 1) הראשון, חולדות להראות פעילות טיפוח פנים גדלה וא-סימטרי, כלומר, עם פנים לשטוף strokes מכוונת בעיקר לטריטוריה יון נפצע עצב. הבחנה בין פנים גרooming התנהגות שהיא חלק מהתנהגות גוף טיפוח כללית יותר, שנשארה ללא פגע במידה רבה על ידי היון-CCI, ופנים טיפוח שלא קדמו ולא אחריו טיפוח גוף, אשר גדל באופן משמעותי לאחר היון-CCI. במהלך תקופה זו, היענות לגירוי מכאני של שטח היון מצטמצמת. hyporesponsiveness זה מוחלף בפתאומיות על ידי hyperresponsiveness קיצונית לפיה עוצמות גירוי אפילו חלשות מאוד לעורר התנהגות nocifensive (שלב 2). הדמיון הפנומנולוגית בין שינויים התנהגותיים אלה ודיווחו סימנים של כאבי פנים (כלומר, תגובות לגירוי מזיק של הפנים) מצביעות על הנוכחות של dysesthesia / paresthesia ואלודיניה המכנית בשטח יון ligated.

Introduction

נזק לעצבים החושית לרוב מוביל לאובדן התחושה. הוא לא הבין טוב מאוד למה ואיך, ובמקרים מסוימים, נזק עצבי היקפי מוביל לכאב כרוני. כתוצאה מכך, מחלות עצבים כואבות יישארו מצב מאתגר לטיפול ¹ ולגרום לצמצום משמעותי באיכות חיים של חולי ^2-3. מודלים של בעלי החיים הם כלי חשוב לבחון את היעילות של תרופות קיימות וחדש שפותחו ולזהות את מנגנוני pathophysiological המעורבים בפיתוח והתחזוקה של כאב נוירופתי. בין האתגרים המרכזיים למחקר כאב translational הוא זיהוי ומדידת כאב ספונטני בבעלי חיים (כלומר, פיסיולוגי, התנהגותי או אחרים ביטויים המצביעים על הנוכחות של כאב בבעלי חיים שאינם מאותגרות עם חיטוט גירויים הגבי חריפות על המצב הבסיסי של הנושא ). המטרה הכללית של הליך זה היא לגרום לניתוחפגיעה העצבית infraorbital בחולדה שמובילה להתפתחות של שני ספונטניים ועוררה התנהגות nocifensive שיכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים מעורבים בכאב נוירופתי trigeminal והטיפול בה.

בימוי, טיפוח פנים מבודד הוא מדד ייחודי של כאב נוירופתי ספונטני בחולדות. בעקבות פציעה כרונית התכווצות (CCI) של עצב infraorbital (יון), חולדות להציג שינויים בהתנהגות ספונטנית ובתגובה לגירוי חוש המישוש שמעידים על כאב מתמשך ואלודיניה המכנית ^4. בעקבות היון-CCI, חולדות להראות פעילות טיפוח פנים גדלה וא-סימטרי, כלומר, עם פנים לשטוף strokes מכוונת בעיקר לטריטוריה יון נפצע עצב. בניגוד לגירוי המזיק של הפנים (למשל, הזרקת פורמלין) ^5, שאינו כואב הפרעות חושיות (כלומר, גזיר חד-צדדי vibrissae, מצור עצב infraorbital הרדמה, יישום של שמן מינרלים על vibrissae) לא או רק לזמן קצר מאוד (כלומר, בדקות הראשונות לאחר הופעה) לגרום לשינוי משמעותי בפרצוף טיפוח התנהגות ^6. זה היה להסיק כי טיפוח חריג זה לאחר היון-CCI הוא ביטוי ההתנהגותי של תחושות ספונטניות, מאוד מרתיעים בשטח העצב הפגוע. התנהגות בחולדות היון-CCI זו נושאת דמיון רבה לכאב ספונטני שנצפה בחולים. מחקרים נוספים זיהו הבדל חשוב בין התנהגות טיפוח פנים שהוא חלק מהתנהגות טיפוח גוף כללי יותר (כלומר, "פנים טיפוח גוף טיפוח במהלך"), אשר נשאר ללא פגע במידה רבה על ידי היון-CCI, ופני nocifensive טיפוח שאינו קדמו ולא אחריו גוף טיפוח (כלומר, "פנים מבודדים טיפוח"), אשר גדל באופן משמעותי לאחר היון-CCI ^7-9. פרמקולוגית, פנים טיפוח גוף טיפוח במהלך מהווה מדידת שליטה מצוינת להשפעות תרופה שאינן ספציפיות ( למשל, הרגעה) שעלול לפגוע בתפקוד מוטורי. תנועות של forelimbs במהלך שני הסוגים של פנים טיפוח הן בדיוק אותו הדבר.

בעקבות היון-CCI, חולדות גם תערוכה שינויים בתגובה לגירוי חוש המישוש שמעידים על אלודיניה המכנית ^{4, 10.} בשבוע הראשון (ים) לאחר היון-CCI, חולדות כבר לא מגיבות למישוש קל או בינוני (כלומר, פון פריי גירויים). hyporesponsiveness זה אז החליף בפתאומיות על ידי hyperresponsiveness קיצונית לפיה גם בעוצמות גירוי חלשות מאוד לעורר התנהגות nocifensive. תחילתה של hyperresponsiveness עשויה להשתנות בין חולדות, אבל רוב החולדות הפכו hyperresponsive לאחר שלושה עד ארבעה שבועות לאחר ניתוח.

Protocol

הצהרת אתיקה: מטופלים בעלי חיים, וטופלו על פי ההנחיות של הוועדה למחקר ולסוגיות אתיות של ¹¹ IASP. הפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה האתית המוסדית.

1. נושאים

1. השתמש בחולדות זכרי Sprague-Dawley (250-300 גר 'בהגעה).
2. חולדות בית בכלובים מוצקים-תחתון במושבה חדר עם לחות של 40-60% וRT של C ° 21 ± 1.
3. הפוך מים ומזון זמינים כבהרצון.
4. שמרו חולדות תחת 00:12 כהה HR / מחזור אור הפוך (אורות בשעה 20 שעות).

2. ניתוח

1. לחולדה, להכין שתי חתיכות של מייתר כרום בטן (5-0) בסך של כ 6 סנטימטרים ומניחים אותם בתמיסת מלח סטרילית כדי למנוע התייבשות והופך נוקשה ופריך.
2. להרדים את החיה עם pentobarbital (60 מ"ג / קילוגרם, IP) וטיפול באטרופין (0.1 מ"ג / קילוגרם, IP). לפקח על הרמה של הרדמה על ידי הרחבת רגל אחת וpinching האינטרנט של עור בין האצבעות עם ציפורניים כדי להבטיח לחץ הולם מוחל. להבטיח כי בעל החיים לא להגמיש איברה. במידת צורך, לנהל pentobarbital נוספת.
3. לגלח את הראש של החולדה כך שחתך בקרקפת קו אמצע יכול להיות עשוי מכ -25 מ"מ עם קדמי שווים מרחקים ואחוריים למרכז של העיניים.
4. לתקן את ראשו של העכברוש במסגרת stereotaxic או אחר לקבע את הראש של החולדה. מניחים את החולדה על כרית מחוממת כדי לשמור על טמפרטורת גוף.
5. החל משחה עיניים על שני העיניים כדי למנוע נזק מייבוש.
6. לשפשף את אזור הראש המגולח עם אלכוהול, אז בבטאדין.
7. לעשות חתך בקרקפת קו אמצע, חשיפת עצם גולגולת ואף.
8. השתמש במיקרוסקופ פעולה כדי לבצע שלבים 2.9-2.16.
9. לנתח את קצה המסלול החופשי, שהוקם על ידי הלסת, חזיתי, הדמעות ועצמות הזיגומטית, באמצעות ספוגית כותנה שקצה וזוג המלקחיים דומון. השתמש בספוגית לכךAK דם מדימום אפשרי.
10. כדי לתת גישה ליונים, בעדינות להטות את התוכן מסלולית עם מקלון צמר גפן דיוק, נזהר שלא להתמתח יתר על מידה את עצב ethmoidal הקדמי שחוצה מעולה ליונים. לנתח את היונים חופשיים מרקמת חיבור המקיפה, באמצעות ספוגית כותנה שקצה דיוק וזוג המלקחיים דומון באמצעות תנועה מתפשטת. השתמש בספוגית כדי לספוג את הדם מדימום אפשרי.
11. כדי לבצע קשירה, לדחוף קצה אחד של פיסת מעי כרום כלפי מטה לאורך העצם הקדמי בודדת, המדיאלי ליון ולקדם כמה מילימטרים מקבילים ונחותים היון. המייתר כעת נערך במקום בין היון והעצם הקדמי.
12. להחליק את הקצה של 45 מעלות מלקחיים דומון זווית תחת היון למקם אותו בסמוך למייתר. בעדינות לחזור בי היון רוחבי כדי לחשוף את הקשר וקצה המלקחיים. גריפ המייתר עם המלקחיים ולמשוך את המלקחיים רוחבי מתחת ליון.
13. משוך את המייתר מחלל מסלולית עד שני הקצוות של המייתר הם פחות או יותר במרחק שווה מהיון.
14. הפוך "קשר להחליק" משני קצוות של המייתר כדי לאפשר שליטה מושלמת על מידת ההתכווצות והחלק את הקשר נגד היונים. חלק את הקשר נוסף כדי להצר היון כך שהקוטר של העצב הוא מופחת על ידי סכום רק מורגש. הפוך קשר רגיל על גבי תלוש קשר כך שהסכום של התכווצות נשאר קבוע (כלומר, כדי למנוע את קשר חריץ החלקה).
15. חותך את חיבורי האותיות לעזוב כ 2 מ"מ של קצוות חופשיים מהקשר.
16. חזור על אותו ההליך (שלבים 2.11-2.15) לעשות קשירת 2 מ"מ שני מלבד הראשון.
17. לניתוח דמה, לבצע צעדים 2.2-2.10.
18. סגור את החתך בקרקפת באמצעות תפרי פוליאסטר (4-0) ולאפשר לחולדה להתאושש על משטח לוהט. אל תשאירו את בעלי החיים ללא השגחה עד שהוא חזר חסרונות מספיקciousness לשמור כיבה sternal ולא להחזיר את בעלי החיים לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהוא התאושש באופן מלא.
19. כדי להימנע מהשפעות משכך כאבים מנע על התפתחות כאב נוירופתי, לא לנהל שיכוך כאבים לכאב לאחר ניתוח.

3. התנהגות תהליך הבדיקה

1. לאפשר חולדות להסתגל ללפחות 8 ימים לתנאי הדיור לפני הבדיקה טרום ניתוחית.
2. להרגיל לפחות פעם ביום במשך שלושה ימים חולדות להליך הבדיקה לפני הבדיקה טרום ניתוחית.
3. בדיקת התנהלות בחדר חשוך עם אור הניתן על ידי הנורה האדומה W 60 מושעה 1 מ 'מעל מרכז אזור בדיקת הדלקת המרכז אבל משאיר את ההיקף עמום והשאר מחושך החדר.
4. ודא שיש רעש רקע מספיק כדי להקטין הפרעות מגירוי שמיעתי פתאומי. במידת צורך, לספק רעש לבן.
5. תצפית של פנים טיפוח התנהגות
   1. Transport חולדה אחת מהמושבה למבחן החדר בכלוב פלסטיק מכוסה בלי מצעים. הערה: באופן אידיאלי, זה צריך להיות טיול קצר עם גירויים חיצוניים מינימאליים.
   2. מניחים את החולדה בכלוב מכוסה פלסטיק, שקוף ללא מצעים (LxWxH: 24 סנטימטרים X 14 סנטימטרים X 17 סנטימטרים) עם שיקוף בחזרה מול מצלמת וידאו.
   3. הפוך הקלטת 10 דקות של ההתנהגות של בעלי החיים. במהלך הקלטה, לוודא הנסיין אינו נוכח בחדר הבדיקה.
   4. נקה את כלוב התצפית לפני הצבת החיה הבאה.
   5. ודא ההתנהגות נרשמה מנותחת על ידי הנסיין שהוא עיוור לתנאי הניסוי של החולדה.
   6. לעשות תקליט של כל פרק פנים טיפוח במהלך הקלטת 10 דקות. הערה: טיפוח פנים מוגדר כדפוסי תנועה שבכפות רגליו קדמיות מובאות במגע עם אזורי פנים.
   7. לעשות הבחנה בין שני סוגים של פנים טיפוח התנהגות. אם רצף לא קדמו ולא אחריוגוף טיפוח (כלומר, טיפוח של אזור אחר בגוף מלבד הפנים), לסווג את הפרק כמבודד טיפוח פנים. אם טיפוח הגוף מתבצע מייד לפני או אחרי הפנים טיפוח, לסווג את הפרק כפני טיפוח במהלך טיפוח גוף.
   8. לקבוע את מספר פרקי פנים טיפוח.
      1. לסווג פרק זמן בין פעולות פנים טיפוח שאינו עולה על 4 שניות כחלל התוך-פרק (כלומר, הפסקה בין פעולות פנים טיפוח בתוך פרק יחיד).
      2. לסווג פרק זמן בין פעולות טיפוח פנים שעולים על 4 שניות כחלל הבין-פרק (כלומר, הפרעה מלאה של פעולות פנים טיפוח בין שני פרקים).
6. בדיקת גירוי מכאנית
   1. חולדות תחבורה בקבוצות של עד 6 בעלי חיים מהמושבה לחדר הבדיקה בכלוב מכוסה עם מצעים. ודא כי מדובר בטיול קצר עם גירויים חיצוניים מינימאליים.
   2. הנח אתחולדות בנפרד בכלובי פלסטיק שקופים עם מצעים (LxWxH: 24 סנטימטרים X 14 סנטימטרים X 17 סנטימטרים) עם מכסה צירים כך שניתן לפתוח בקלות ונסגרו.
   3. השתמש בסדרה מדורגת של חמש שערות פון פריי. הערה: הכוח הדרוש כדי לכופף את השערות הוא 0.015 g, 0.127 g, .217 G, .745 גרם ו2.150 גרם.
   4. להרגיל חולדות לכלוב התצפית ותנועות להגיע במשך 10 דקות. כל 30 שניות, פתחו את המכסה ולגעת בעדינות בקיר של הכלוב עם מוט פלסטיק.
   5. כאשר בעלי החיים הוא ב/ לא מדינת תנועה מרחרחת (כלומר, עם ארבע כפות שהונחו על הקרקע, לא מרגשים ולא הקפאה, אבל מציג התנהגות רחרוח), להחיל את שיער פון פריי הראשון בתוך שטח היון בסמוך למרכז משטח vibrissal , על עור השעיר המקיף את vibrissae mystacial.
   6. ציון תגובתו של בעל החיים לגירוי להשתייך לאחת מהקטגוריות הבאות תגובת ^4.
      1. לסווג חוסר תגובה כמלאציון 0.
      2. לסווג זיהוי גירוי (כלומר, העכברוש הופך את הראש לכיוון אובייקט המגרה ואובייקט הגירוי אז חקר) כתוצאה 1.
      3. לסווג תגובת נסיגה (כלומר., העכברוש הופך את הראש משם לאט או מושך אותו בזריזות לאחור כאשר הגירוי מוחל, לפעמים פרצוף אחד לנגב ipsilateral לאזור המגורה מתרחש) כתוצאה 2.
      4. לסווג בריחה / תגובת התקפה (כלומר., העכברוש ימנע מגע נוסף עם אובייקט הגירוי, או באופן פסיבי על ידי הזזת הגוף שלה מהאובייקט מגרה לתפוס עמדת כריעה על קיר הכלוב, או באופן פעיל על ידי תקיפת אובייקט הגירוי, מה שהופך את נושך ותופס תנועות) כתוצאה 3.
      5. לסווג פנים סימטריים טיפוח (כלומר, העכברוש מציג סדרה רצופה של לפחות שלוש משיכות פנים לשטוף מופנות כלפי אזור הפנים מגורה) כתוצאה 4.
      6. בתוך כל בעלי חיים, תחול stimuלי בבסדר עולה של עוצמה. לאחר עוצמת גירוי יושמה בצד אחד, להחיל אותה על הצד השני לפני שעברת לעוצמת הגירוי הבאה. באקראי את הסדר שבי הצדדים ipsilateral ונגדיים הם מגורה. שים לב שבעלי החיים צריכים להיות ב/ לא מדינת תנועה מרחרחת לפני כל גירוי.

תוצאות

חולדות היון-CCI מראות עלייה חזקה שלאחר ניתוח בכמות הזמן שבילה על פני מבודדות טיפוח (איור 1). פסגות העלייה בסוף השבוע שלאחר הניתוח הראשון ולאחר מכן יורדות בשבועות הבאים. רוב המחקרים שנעשו לאחרונה מצאו פנים טיפוח לגדל באופן משמעותי עד שלושה שבועות. התנהגות טיפוח...

Discussion

ההיבט המעניין ביותר של מודל היון-CCI הוא שזה מספק מדד ייחודי של כאב ספונטני, עורר אינם (נוירופתי). רוב המחקרים בבעלי החיים בכאב עצבי, תוך שימוש במודלי עצב בעמוד השדרה, באופן בלעדי לטפל בהתנהגויות nocifensive (למשל., ניקוד ותגובות נסיגה), המשקף רגישות יתר לגירויים מכאניים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut	Dynek	CG504
Nembutal  (pentobarbital)	Pharmacy
Atropine	Pharmacy
Clippers for small animals - Favorita II	Aesculap	GT104
Stereotaxic instrument	Stoelting	51600
Ophthalmic ointment (Liposic)	Pharmacy
Homeothermic monitor system	Harvard Apparatus	PY8 50-7221-F
Cotton applicator	Pharmacy
Precision cotton swab	Qosina	10225
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Polyester sutures - Mersilene (4-0)	Ethicon	R871H
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011