Cronica Costrizione Lesioni del Rat infraorbitario Nerve (ION-CCI) per studiare trigemino Dolore neuropatico

Riepilogo

This manuscript describes a rodent model to study trigeminal neuropathic pain. The methods described include surgical procedures to perform a chronic constriction injury of the rat’s infraorbital nerve and the post-surgical behavioral tests to measure the changes in spontaneous and evoked behavior that are indicative of persistent pain and allodynia.

Abstract

I modelli animali sono strumenti importanti per studiare la fisiopatologia e la farmacologia del dolore neuropatico. Questo manoscritto descrive le procedure chirurgiche e comportamentali per studiare il dolore neuropatico trigeminale nei ratti. Per soddisfare la specificità del trigemino sindromi da dolore neuropatico, il nervo infraorbitale (Ion) viene sottoposto ad una lesione costrizione cronica (CCI) dal liberamente legatura del nervo. Un approccio intra-orbitale è presentato qui per esporre e legare lo ione nella cavità orbitale. Dopo IoN legatura, ratti mostrano cambiamenti nel comportamento spontaneo e in risposta a von Frey stimolazione capelli che sono indicativi di dolore persistente e allodinia meccanica. Due fasi possono essere definite nello sviluppo dei cambiamenti comportamentali. Durante la prima settimana seguente ionico CCI (fase 1), ratti mostrano un'attività governare faccia maggiore e asimmetrica, cioè, con volto di lavaggio colpi diretta principalmente al territorio IoN nervo feriti. Viene fatta una distinzione tra il viso grooming comportamento che fa parte di un comportamento corpo governare più generale, che rimane in gran parte influenzato da ION-CCI, e faccia governare che non è né preceduta né seguita da una cura del corpo, che è significativamente aumentato dopo ION-CCI. Durante questo periodo, la reattività alla stimolazione meccanica del territorio ione è ridotta. Questo iporesponsività è bruscamente sostituito da un estremo iperreattività cui intensità di stimolo anche molto deboli provocare comportamenti nocifensive (fase 2). Le somiglianze fenomenologico tra queste alterazioni comportamentali e segnalati segni di dolore facciale (cioè, risposte a stimolazione nocicettiva del volto) suggeriscono la presenza di disestesia / parestesia e allodinia meccanica nel territorio IoN legatura.

Introduzione

Danni ai nervi somatosensoriali più spesso porta alla perdita di sensibilità. Non è molto ben compreso come e perché, in alcuni casi, danni ai nervi periferici conduce al dolore cronico. Come risultato, neuropatie dolorose rimangono una condizione difficile da trattare ¹ e risultare in una riduzione sostanziale della qualità della vita dei pazienti ^2-3. I modelli animali sono uno strumento importante per esaminare l'efficacia dei farmaci esistenti e di nuova concezione e di identificare i meccanismi fisiopatologici coinvolti nello sviluppo e manutenzione del dolore neuropatico. Tra le principali sfide per la ricerca sul dolore traslazionale è l'identificazione e la misurazione del dolore spontaneo negli animali (vale a dire, fisiologica, manifestazioni comportamentali o di altri che indicano la presenza di dolore negli animali che non vengono sfidati con sondare stimolazioni che sono acutamente sovrapposte condizioni basali del soggetto ). L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre chirurgicamente unlesioni del nervo infraorbitale in un topo che porta allo sviluppo di entrambi spontaneo e evocato comportamento nocifensive che può utilizzato per studiare i meccanismi coinvolti nel dolore neuropatico trigemino e il suo trattamento.

Diretto, isolato faccia governare è una misura unica del dolore neuropatico spontanea nei ratti. A seguito di lesione cronica costrizione (CCI) del nervo infraorbitario (ione), ratti mostrano cambiamenti nel comportamento spontaneo e in risposta alla stimolazione tattile che sono indicativi di dolore persistente e allodinia meccanica ^4. A seguito di ION-CCI, i ratti mostrano un'attività governare faccia maggiore e asimmetrica, cioè, con volto di lavaggio colpi diretta principalmente al territorio IoN nervo feriti. In contrasto con la stimolazione nociva del volto (ad esempio, l'iniezione formalina) ^5, non doloroso disturbi sensoriali (ad esempio, unilaterale ritaglio vibrisse, anestetico blocco del nervo infraorbitale, applicazione di olio minerale su vibriSSAE) hanno fatto, non o solo molto brevemente (vale a dire, i primi minuti dopo l'insorgenza) inducono un cambiamento significativo nel comportamento faccia governare ^6. Si è concluso che questa toelettatura anormale dopo ION-CCI è una manifestazione comportamentale di spontanee, sensazioni fortemente aversive nel territorio del nervo feriti. Questo comportamento nei ratti ionico CCI orsi forte somiglianza con dolore spontaneo osservata nei pazienti. Ulteriori studi hanno identificato una differenza importante tra il viso comportamento governare che fa parte di un comportamento governare corpo più generale (cioè, "faccia governare durante corpo grooming"), che rimane in gran parte influenzato da ION-CCI, e faccia nocifensive governare che non è né preceduta né seguita da cura del corpo (cioè, "isolato faccia grooming"), che è significativamente aumentato dopo ionico CCI ^7-9. Farmacologicamente, faccia governare durante corpo governare costituisce una misura di controllo eccellente per gli effetti non specifici di droga ( ad esempio, sedazione), che possono alterare la funzione motoria. I movimenti degli arti anteriori durante i due tipi di viso grooming sono esattamente gli stessi.

A seguito di ION-CCI, ratti esibiscono anche i cambiamenti in risposta alla stimolazione tattile che sono indicativi di allodinia meccanica ^{4, 10.} Durante la prima settimana (s) dopo ION-CCI, i ratti non rispondono più alla tattile lieve o moderata (ad esempio, von Frey ) stimoli. Questo iporesponsività viene poi bruscamente sostituito da un iperreattività estremo in cui anche le intensità di stimolo molto deboli provocano comportamento nocifensive. L'inizio della iperresponsività può variare tra i ratti, ma la maggior parte dei ratti sono diventati hyperresponsive dopo tre o quattro settimane post-operatorio.

Protocollo

Dichiarazione Etica: animali vengono trattati e curati secondo le linee guida del Comitato per la ricerca e le questioni etiche della IASP ^11. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico istituzionale.

1. Soggetti

1. Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley (250-300 g all'arrivo).
2. Ratti Casa in gabbie a fondo in una stanza colonia con una umidità del 40-60% e una RT di 21 ± 1 ° C.
3. Rendere l'acqua e cibo disponibile a libitum.
4. Tenere ratti sotto una rovesciata 00:12 h scuro ciclo / luce (luce accesa a 20 ore).

2. Chirurgia

1. Per ratto, preparare due pezzi di legatura cromico budello (5-0) di circa 6 cm di lunghezza e metterli in soluzione salina sterile per evitare l'essiccamento e diventare rigido e fragile.
2. Anestetizzare l'animale con pentobarbital (60 mg / kg, ip), e trattare con atropina (0,1 mg / kg, ip). Monitorare il livello di anestesia estendendo una gamba e Pinching la rete di pelle tra le dita dei piedi con un unghia per garantire viene applicata una pressione adeguata. Assicurarsi che l'animale non mostrare i arto. Se necessario, somministrare pentobarbital aggiuntivo.
3. Radere la testa del ratto in modo che un cuoio capelluto un'incisione-linea può essere di circa 25 mm con distanze uguali anteriore e posteriore al centro degli occhi.
4. Fissare la testa del topo in un telaio stereotassico o altrimenti fissare la testa del topo. Posizionare il ratto su un tampone riscaldato per mantenere la temperatura corporea.
5. Applicare una pomata oftalmica su entrambi gli occhi per evitare danni da essiccazione.
6. Scrub la zona testa rasata con l'alcol, poi Betadine.
7. Fare un cuoio capelluto un'incisione linea mediana, esponendo il cranio e l'osso nasale.
8. Utilizzare un microscopio operazione per eseguire i passaggi 2,9-2,16.
9. Sezionare il bordo dell'orbita libera, formata da mascellare, frontale, lacrimale e ossa zigomatiche, usando un tampone di cotone con punta e un paio di pinze Dumont. Utilizzare il tampone per cosìak sangue da possibili emorragie.
10. Per consentire l'accesso allo ione, deviare leggermente il contenuto orbitale con un batuffolo di cotone precisione, facendo attenzione a non tirare troppo il nervo ethmoidal anteriore che attraversa superiore allo ione. Sezionare iOn libera dal tessuto connettivo circostante, usando un tampone di cotone con punta di precisione e un paio di pinze Dumont con un movimento diffusione. Utilizzare il tampone per assorbire il sangue da possibili emorragie.
11. Per eseguire una legatura, spingere una estremità di un unico pezzo di budello cromico verso il basso lungo l'osso frontale, mediale allo ione e avanzare pochi millimetri parallelo e inferiore allo ione. La legatura è ora tenuto in posizione tra ioni e l'osso frontale.
12. Infilare la punta di un 45 gradi angolo pinze Dumont sotto lo ione collocarlo in prossimità della legatura. Ritrarre delicatamente iOn lateralmente per rivelare la legatura e la punta della pinza. Afferrare la legatura con le pinze e ritirare le pinze lateralmente da sotto lo ione.
13. Estrarre la legatura dalla cavità orbitale finché entrambe le estremità della legatura sono più o meno equidistanti dal IoN.
14. Fare un "nodo scorsoio" dalle due estremità della legatura per consentire un perfetto controllo del grado di costrizione e far scorrere il nodo contro ION. Spostare il nodo ulteriormente costrizione ione modo che il diametro del nervo viene ridotto di una quantità appena percettibile. Fare un nodo normale sulla parte superiore del nodo di slittamento in modo che la quantità di costrizione rimane costante (cioè, per evitare che il nodo feritoia di scivolare).
15. Tagliare le legature di lasciare circa 2 mm di estremità libere del nodo.
16. Ripetere la stessa procedura (punti da 2,11-2,15) per fare una seconda legatura 2 millimetri a parte la prima.
17. Per la chirurgia farsa, eseguire i passaggi 2,2-2,10.
18. Chiudere l'incisione cuoio capelluto con suture in poliestere (4-0) e lasciare il ratto di recuperare su un tappetino riscaldato. Non lasciare incustodita l'animale fino a che non ha recuperato contro sufficienticattiveria per mantenere decubito sternale e non rispedire l'animale verso la compagnia di altri animali fino a quando non è completamente recuperato.
19. Per evitare effetti analgesici di prelazione sullo sviluppo del dolore neuropatico, non somministrare l'analgesia per il dolore post-operatorio.

3. Procedura di prova del comportamento

1. Consentire topi per acclimatarsi per almeno 8 giorni a condizioni abitative prima del test pre-operatoria.
2. Abituare ratti alla procedura di prova almeno una volta al giorno per tre giorni prima del test pre-operatorio.
3. Test condotta in una stanza buia con luce fornita da una W lampadina rossa 60 sospesa 1 m sopra il centro della zona reattiva illuminazione centro ma lasciando la circonferenza dim e il resto della camera oscura.
4. Assicurarsi che ci sia sufficiente rumore di fondo di ridurre le interferenze dalla stimolazione uditiva improvvisa. Se necessario, fornire il rumore bianco.
5. Osservazione del comportamento governare faccia
   1. TRASPORTI un singolo topo dalla colonia alla camera di prova in una gabbia di plastica coperto senza biancheria da letto. Nota: Idealmente, questo dovrebbe essere un breve viaggio con stimoli esterni minimi.
   2. Mettere il topo in una coperta, gabbia di plastica trasparente senza biancheria da letto (lxwxh: 24 cm x 14 cm x 17 cm) con una a specchio di nuovo di fronte a una telecamera.
   3. Effettuare una registrazione 10 min di comportamento dell'animale. Durante la registrazione, assicurarsi che lo sperimentatore non è presente nel locale di prova.
   4. Pulire la gabbia di osservazione prima di posizionare il prossimo animale.
   5. Assicurarsi che il comportamento registrato viene analizzato da uno sperimentatore che è cieco alla condizione sperimentale del ratto.
   6. Fare un record di ogni episodio faccia governare durante la registrazione 10 min. Nota: Faccia governare è definito come schemi di movimento in cui zampe anteriori sono portati a contatto con le zone del viso.
   7. Fare una distinzione tra due tipi di comportamento volto governare. Se una sequenza non è né preceduta né seguita dacura del corpo (cioè, governare di una zona del corpo diversa dal viso), categorizzare l'episodio come isolato faccia governare. Se il corpo governare viene eseguita immediatamente prima o dopo faccia governare, classificare l'episodio come faccia governare durante il corpo governare.
   8. Determinare il numero di episodi faccia governare.
      1. Categorizzare un periodo di tempo tra le azioni faccia governare che non supera i 4 secondi come spazio intra-episodio (cioè, una pausa tra le azioni faccia governare all'interno di un singolo episodio).
      2. Categorizzare un periodo di tempo tra le azioni governare faccia che supera 4 sec come spazio inter-episodio (cioè, una completa interruzione di azioni volto grooming tra due episodi).
6. Test stimolazione meccanica
   1. Ratti Mezzi di trasporto in gruppi di un massimo di 6 animali della colonia di sala prove in gabbia coperta con biancheria da letto. Assicurarsi che si tratta di un breve viaggio con stimoli esterni minimi.
   2. Posiziona ilratti singolarmente in gabbie di plastica trasparente con lenzuola (lxwxh: 24 cm x 14 cm x 17 cm) con un coperchio a cerniera in modo che possano essere facilmente aperte e chiuse.
   3. Utilizzare una serie graduata di cinque peli von Frey. Nota: La forza richiesta per piegare i capelli è 0,015 g, 0.127 g, 0,217 g, 0,745 ge 2.150 g.
   4. Abituare i topi alla gabbia di osservazione e dei movimenti che raggiungono per 10 min. Ogni 30 sec, aprire il coperchio e toccare delicatamente la parete della gabbia con una bacchetta di plastica.
   5. Quando l'animale è in un sniffing / no stato locomozione (cioè, con quattro zampe poste a terra, né muoversi né congelamento, ma esibendo sniffing comportamento), applicare la prima capelli von Frey nel territorio ionico in prossimità del centro del pad vibrissal , sulla pelle pelosa che circonda il vibrisse mystacial.
   6. Punteggio la risposta dell'animale alla stimolazione di appartenere ad una delle seguenti categorie di risposta ^4.
      1. Categorizzare una completa mancanza di risposta comepunteggio 0.
      2. Categorizzare una rilevazione stimolo (cioè, il ratto gira la testa verso l'oggetto e l'oggetto stimolante stimolo viene poi esplorata) come punteggio 1.
      3. Categorizzare una reazione di ritiro (es., Il topo gira la testa lentamente o tira bruscamente all'indietro quando viene applicata la stimolazione, a volte una sola faccia pulire omolaterale alla zona stimolata avviene) come punteggio 2.
      4. Categorizzare una fuga / risposta di attacco (es., Il topo evita ulteriori contatti con l'oggetto di stimolo, sia passivamente spostando il suo corpo lontano dall'oggetto stimolante per assumere una posizione rannicchiata contro la parete della gabbia, o attivamente attaccando l'oggetto stimolo, rendendo mordere e afferrando movimenti) come punteggio 3.
      5. Categorizzare faccia asimmetrica grooming (cioè, il ratto visualizza una serie ininterrotta di almeno tre colpi di faccia-wash diretti verso la zona del viso stimolata) come punteggio 4.
      6. All'interno di ogni animale, si applicano stimuLi in un ordine crescente di intensità. Dopo una intensità dello stimolo è stato applicato ad una faccia, applicarla a lato prima di passare al successivo intensità dello stimolo. Casuale l'ordine in cui i lati ipsilaterale e controlaterale sono stimolati. Si noti che l'animale deve essere in uno sniffing / no stato locomozione prima di ogni stimolo.

Risultati

Ratti ION-CCI evidenziano una forte crescita post-operatoria nella quantità di tempo speso sul viso isolato governare (Figura 1). L'aumento di picchi alla fine della prima settimana post-operatorio e poi diminuisce durante le seguenti settimane. La maggior parte degli studi recenti hanno trovato faccia governare essere significativamente aumentato per un massimo di tre settimane. Faccia comportamento governare in sham operati ratti è più o meno inalterati.

Ratti ION-C...

Discussione

L'aspetto più interessante del modello ION-CCI è che esso fornisce una misura unica di spontaneo, (neuropatico) dolore non evocato. La maggior parte degli studi sugli animali di dolore neuropatico, utilizzando i modelli dei nervi spinali, si rivolgono esclusivamente comportamenti nocifensive (ad es., La vocalizzazione e le risposte di astinenza), riflettendo ipersensibilità al stimolazioni meccaniche o termiche ^12. Tuttavia, la denuncia clinica principale nei pazienti è dolore in corso, non i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut	Dynek	CG504
Nembutal  (pentobarbital)	Pharmacy
Atropine	Pharmacy
Clippers for small animals - Favorita II	Aesculap	GT104
Stereotaxic instrument	Stoelting	51600
Ophthalmic ointment (Liposic)	Pharmacy
Homeothermic monitor system	Harvard Apparatus	PY8 50-7221-F
Cotton applicator	Pharmacy
Precision cotton swab	Qosina	10225
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Polyester sutures - Mersilene (4-0)	Ethicon	R871H
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011