三叉神経因性疼痛を研究するためにラットの眼窩下神経の慢性狭窄傷害（ION-CCI）

要約

This manuscript describes a rodent model to study trigeminal neuropathic pain. The methods described include surgical procedures to perform a chronic constriction injury of the rat’s infraorbital nerve and the post-surgical behavioral tests to measure the changes in spontaneous and evoked behavior that are indicative of persistent pain and allodynia.

要約

動物モデルは、神経因性疼痛の病態生理と薬理学を研究するための重要なツールです。本稿では、ラットにおいて、三叉神経因性疼痛を研究するために、外科的および行動の手順を説明します。三叉神経因性疼痛症候群の特異性を満たすために、眼窩下神経（イオン）が緩く神経を結紮することによって慢性狭窄損傷（CCI）に供されます。イントラ軌道アプローチが露出し、眼窩内のイオンを連結するためにここに提示されています。イオンライゲーションの後、ラットは、自発的な行動の持続的な痛みや機械的異痛の指標であるフォン・フレイ毛の刺激に応答して、変化を示します。二つの相は、行動の変化の開発に定義することができます。 ION-CCI（フェーズ1）以下の最初の週の間、ラットは主に神経損傷イオンの領土に向け洗顔ストロークで、すなわち 、活動をグルーミング増加し、非対称の顔を示しています。違いは、顔グラムの間で行われますION-CCIによって大幅に影響を受けないまま、より一般的なボディグルーミング行動の一部である行動をooming、顔はそれが先行することも、かなりのイオンCCI後に増加されたボディグルーミング、続いもされていないグルーミング。この期間中、イオン領土の機械的刺激に対する応答性が低下します。この反応性低下が急激であっても非常に弱い刺激強度が侵害防御行動（フェーズ2）を誘発することにより、極端な過敏症に置き換えられます。これらの行動の変化の間の現象学的類似点と顔面痛（ すなわち、顔の侵害刺激に対する応答）の兆候を報告したライゲーションされたイオンの領土で異常感覚/知覚異常や機械的異痛の存在を示唆しています。

概要

体性感覚神経の損傷は、ほとんどの場合、感覚の喪失につながります。これは非常によく理解理由及び方法は、いくつかの例では、末梢神経損傷は、慢性疼痛をもたらすされていません。その結果、痛みを伴う神経障害は^{、1の治療}と生活^2-3の患者の質の大幅な削減をもたらすのに困難な状態のまま。動物モデルは、既存および新たに開発された薬剤の有効性を検討すると神経因性疼痛の開発と維持に関与する病態生理学的メカニズムを識別するために重要なツールです。翻訳の痛みの研究のための主要な課題の中で識別され、（動物で自発痛を測定する、すなわち 、生理学的、急性被験者の基底状態に重畳された刺激をプロービングでチャレンジされていない動物における疼痛の存在を示す行動や他の症状）。この手順の全体的な目標は、外科的に誘導することです両方の自発的なの発展につながると三叉神経因性疼痛およびその治療に関与するメカニズムを研究するために使用することができます侵害防御行動を誘発ラットにおける眼窩下神経損傷。

監督、分離された顔のグルーミングは、ラットにおける自発性神経障害性疼痛のユニークな尺度です。眼窩下神経の慢性狭窄損傷（CCI）（イオン）後、ラットは、自発的な行動の持続的な痛みや機械的異痛⁴の指標である触覚刺激に応答して、変化を示します。 ION-CCI後、ラットは主に神経損傷イオンの領土に向け洗顔ストロークで、 すなわち 、活動をグルーミング増加し、非対称の顔を示しています。顔の侵害刺激（例えば、ホルマリン注射^）5とは対照的に、非痛みを伴う感覚障害（ すなわち、一方的な鼻毛クリッピング、麻酔眼窩下神経ブロック、VIBRIの鉱物油の適用SSAE）ではないか、非常に簡単に（ すなわち 、発症後最初の数分間は）行動^{6グルーミング}顔に大きな変化を誘導しました。これは、ION-CCI後にこの異常なグルーミングが負傷した神経領土の自然、強く嫌悪感の行動発現であると結論されました。イオンCCIラットにおけるこの動作は、患者において観察自発痛に強い似ています。さらなる研究は、イオンCCIによって大部分が影響を受けないまま行動グルーミング、より一般的な体（ すなわち、「グルーミング体中にグルーミング顔」）の一部である行動グルーミング顔、そして先行でもない侵害防御顔のグルーミングの重要な違いを識別しました大幅イオンCCI ^7-9の後に増加されるグルーミング体（ すなわち、「単離された顔のグルーミング」）、続きます。薬理学的に、ボディグルーミング中グルーミング顔（非特異的薬剤効果の優れた制御測定を構成します例えば、鎮静）。顔のグルーミングの2つのタイプの間の前肢の動きはまったく同じです。

ION-CCIは、ラットはまた、機械的異痛^4、10の指標である触覚刺激に応答して変化を示す従うこと。ION-CCI後の最初の週（複数可）の間、ラットはもはや軽度または中等度の触覚（ すなわち、フォン・フレイに応答しません）刺激。この低応答性は、その後、突然でも非常に弱い刺激強度が侵害防御行動を誘発することにより、極端な過敏症に置き換えられます。過敏性の発症は、ラットの間で変動し得るが、術後3〜4週間後にほとんどのラットは、過反応性となっています。

プロトコル

倫理の声明：動物が治療と研究IASP ¹¹の倫理問題のための委員会のガイドラインに従って世話しています。プロトコルは、機関倫理委員会によって承認されています。

1.被験者

1. 雄のSprague-Dawleyラット（到着時250〜300グラム）を使用します。
2. 40〜60％の湿度のコロニールーム、21±1℃の室温で固体底のケージでハウスラット。
3. 自由で水や食料を利用できるようにします。
4. （20時間に点灯）逆12：12時間の明/暗サイクルの下でラットをしてください。

2.手術

1. ラット当たり、長い約6センチクロム腸結紮（5-0）を2枚準備し、乾燥し、堅くて脆くなるのを避けるために滅菌生理食塩水に配置します。
2. ペントバルビタール（60mg / kg、腹腔内）で動物を麻酔し、アトロピン（0.1ミリグラム/ kg、腹腔内）で処理します。片足とpinchiを拡張することによって、麻酔のレベルを監視適切な圧力が適用されていることを確認するために指の爪と指の間の皮膚のウェブngの。動物がその手足を曲げていないことを確認してください。必要に応じて、追加のペントバルビタールを投与します。
3. 正中線の頭皮切開を眼の中心に等距離の前後で約25mmで作製することができるように、ラットの頭部を剃ります。
4. 定位フレームにラットの頭を修正するか、またはそうでなければ、ラットの頭を固定。体温を維持するために加熱されたパッドの上にラットを置きます。
5. 乾燥による損傷を防ぐために、両眼に眼軟膏を適用します。
6. その後ベータダイン、アルコールで剃ったエリアをスクラブ。
7. 頭蓋骨と鼻骨を露出し、ミッドライン頭皮の切開を行います。
8. 2.16にステップ2.9を実行するために手術用顕微鏡を使用してください。
9. 綿棒とデュモン鉗子のペアを使用して、上顎、前頭、涙と頬骨骨によって形成された無料の軌道のエッジを解剖。そうに綿棒を使用してください可能な出血から血をのk。
10. イオンへのアクセス権を与えるには、静かにイオンに優れ横切る前篩骨神経を引き伸ばし過ぎないように注意しながら、精密綿棒で眼窩内容をそらします。精密綿棒や拡散の動きを使用して、デュモン鉗子のペアを使用して、周囲の結合組織から遊離イ​​オンを分析。可能な出血から血液を吸収するために綿棒を使用してください。
11. 連結を実行するには、下向きの前頭骨に沿ってクロム腸の単一片の一方の端を押して、イオンに内側およびイオンに数ミリが平行と劣る進めます。リガチャーは、現在イオンと前頭骨との間の所定の位置に保持されています。
12. 合字の近くにそれを置くために、イオンの下に45度傾斜したデュモン鉗子の先端をスリップ。静かに鉗子の結紮先端を明らかにするために、横方向にイオンを撤回。グリップピンセットで結紮イオンの下から横方向に鉗子を撤回。
13. 合字の両端が多かれ少なかれ等距離イオンからなるまで、眼窩から合字を引き出します。
14. 合字の両端から「スリップノット」は狭窄度にわたって完全な制御を可能にし、イオンに対して結び目をスライドするようにしてください。神経の直径はちょうど顕著な量だけ減少されるように、イオンを収縮するために、さらに結び目をスライドさせます。くびれの量が一定になるように（ すなわち、滑りからスリット結び目を防ぐために）、スリップノットの上に通常の結び目を作ります。
15. 結び目から自由端の約2mmを残して合字をカットします。
16. 2ミリメートル離れて、最初から二番目の連結を行うこと（2.15に対して2.11ステップ）と同じ手順を繰り返します。
17. 偽手術の場合は、ステップ2.2 2.10を実行します。
18. ポリエステル縫合糸（4-0）を使用して頭皮の切開を閉じ、ラットを加熱パッド上で回復することができます。それは十分な短所を取り戻したまで無人の動物を放置しないでくださいciousness胸骨横臥位を維持し、それが完全に回復するまで、他の動物の会社に動物を返しません。
19. 神経障害性疼痛の開発に先制鎮痛効果を回避するために、手術後の痛みのために鎮痛を管理していません。

3.行動試験手順

1. ラットは手術前の検査の前に住宅事情に少なくとも8日間順応できるようにします。
2. 手術前の検査前に少なくとも一日一回3日間の試験手順にラットを慣らします。
3. 60 W赤い電球が提供する光で暗い部屋での行動試験は、試験領域の中心を照らすが、薄暗い部屋と暗いの残りの部分周囲を残しての中心の上に1メートルを停止しました。
4. 突然の聴覚刺激からの干渉を減少させるのに十分なバックグラウンドノイズがあることを確認してください。必要に応じて、ホワイトノイズを提供します。
5. 顔グルーミング行動の観察
   1. T寝具なしで覆われたプラスチックケージ内の試験室にコロニーから1匹のラットをransport。注：理想的には、これは最小限の外部刺激との短い旅行であるべきです。
   2. 寝具なしでカバーし、透明なプラスチックケージにラットを置き（縦x幅x高さ：24センチメートルX 14センチメートル×17 cm）のバックビデオカメラの前でミラーリングされています。
   3. 動物の行動の10分の記録を行います。記録時には、必ず実験者は試験室に存在しないことを確認してください。
   4. 次の動物を配置する前に観察ケージを清掃してください。
   5. 記録動作がラットの実験条件に盲目である実験者によって分析されていることを確認します。
   6. 10分の記録時に各顔グルーミングエピソードを記録します。注：顔のグルーミングは、前足が顔領域と接触している移動パターンとして定義されます。
   7. 顔グルーミング行動の2つのタイプの区別を行います。シーケンスは、先行でもなく続いもされていない場合グルーミング体（すなわち、顔以外の身体部位の毛づくろい）を単離し、顔のグルーミングなどのエピソードを分類します。ボディグルーミング顔のグルーミングの直前または直後に実行された場合、ボディグルーミング中にグルーミング顔としてのエピソードを分類します。
   8. 顔グルーミングエピソードの数を決定します。
      1. イントラエピソード空間として4秒を超えていない顔グルーミングアクション間の時間を分類（ すなわち 、単一エピソード内の顔グルーミングアクション間の一時停止）。
      2. インターエピソード空間（ すなわち 、2つのエピソードの間に顔グルーミング行動の完全な中断）として4秒を超えて顔グルーミング行動との間の時間を分類。
6. 機械的刺激試験
   1. 寝具で覆われたケージ内の試験室への植民地から最大6匹の動物の群における輸送ラット。これは最小限の外部刺激との短い旅行であることを確認してください。
   2. 置き個別寝具透明なプラスチックケージのラット：ヒンジ付きふた付き（縦x幅x高さ24センチメートル×14センチ×17センチ）は、それが簡単に開閉できるようにします。
   3. 5フォン・フレイ毛の段階的なシリーズを使用してください。注：毛を曲げるのに必要な力は、0.015グラム、0.127グラム、0.217グラム、0.745グラムおよび2.150 gです。
   4. 観察ケージにラットを慣らすし、10分間の動きに達します。 30秒ごとに、ふたを開け、ゆっくりとプラスチックの棒でケージの壁をタッチします。
   5. 動物は（ すなわち、4本の足が地面に置いて、どちらも移動も凍結が、行動をスニッフィング示す）盗聴/無運動状態にある場合に、感覚毛パッドの中央付近にイオン領土内の第1のvon Frey毛を適用、mystacial鼻毛を取り巻く毛深い肌に。
   6. 次の応答カテゴリ⁴のいずれかに属するように、刺激に対する動物の反応をスコア。
      1. 応答の完全な欠如を分類スコア0。
      2. スコア1（すなわち、ラットが刺激オブジェクトとその後探求される刺激物に向かって頭を回す）刺激検出を分類。
      3. 撤退の反応を分類（ すなわち 、ラットはゆっくりと頭を回転させるか、活発に後方刺激が印加されると、時々 、単一の顔が刺激された領域と同側のワイプそれを引っ張る発生）としてスコア2。
      4. （エスケープ/攻撃応答を分類すなわち 、ラットは、または積極的に、刺激対象を攻撃することによって、ケージの壁に身をかがめる位置をとるように刺激する物体から離れて体を動かすことにより、受動的に、刺激物とのさらなる接触を回避かむとスコア3のような）動きをつかみます。
      5. グルーミング非対称顔分類スコア4として（ すなわち 、ラットは、刺激された顔領域に向けられた少なくとも3洗顔ストロークの途切れないシリーズが表 ​​示されます）。
      6. それぞれの動物の中では、STIMUを適用強度の低い順に李。刺激強度は、一方の側に適用された後、次の刺激強度に移動する前にもう一方の側に適用します。同側と反対側が刺激される順番をランダム。動物が各刺激の前に盗聴/無運動状態になければならないことに注意してください。

結果

イオンCCIラットは、孤立した顔グルーミング（ 図1）に費やされた時間の量に強い術後の増加を示します。増加の最初の術後週の終わりにピークとし、次の週の間に減少します。最近の研究では、大幅に3つまでの週間増加するグルーミング顔を発見しました。偽手術ラットで顔グルーミング行動は、多かれ少なかれ影響を受けません。

イオンCCIラットは、第...

ディスカッション

イオンCCIモデルの最も興味深い側面は、それが自発的、非誘発（神経障害性）の痛みのユニークな指標を提供することです。脊髄神経モデルを使用して、神経因性疼痛のほとんどの動物研究は、もっぱら機械的または熱的刺激¹²への過敏性を反映して、侵害防御行動（ 例えば 、発声および離脱応答）を扱います。しかし、患者における主任臨床苦情が継続的な痛みではなく、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut	Dynek	CG504
Nembutal  (pentobarbital)	Pharmacy
Atropine	Pharmacy
Clippers for small animals - Favorita II	Aesculap	GT104
Stereotaxic instrument	Stoelting	51600
Ophthalmic ointment (Liposic)	Pharmacy
Homeothermic monitor system	Harvard Apparatus	PY8 50-7221-F
Cotton applicator	Pharmacy
Precision cotton swab	Qosina	10225
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Polyester sutures - Mersilene (4-0)	Ethicon	R871H
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011