Constriction chronique blessures de orbitaire du nerf de la Rat (ion-CCI) d'étudier trijumeau douleur neuropathique

Résumé

This manuscript describes a rodent model to study trigeminal neuropathic pain. The methods described include surgical procedures to perform a chronic constriction injury of the rat’s infraorbital nerve and the post-surgical behavioral tests to measure the changes in spontaneous and evoked behavior that are indicative of persistent pain and allodynia.

Résumé

Les modèles animaux sont des outils importants pour étudier la physiopathologie et la pharmacologie de la douleur neuropathique. Ce manuscrit décrit les procédures chirurgicales et comportementales pour étudier la douleur neuropathique trijumeau chez les rats. Pour répondre à la spécificité des syndromes de douleur neuropathique trijumeau, le nerf sous-orbitaire (LOI) est soumis à une blessure constriction chronique (CCI) par ligature lâche le nerf. Une approche intra-orbitaire est présenté ici d'exposer et de ligaturer l'ion dans la cavité orbitaire. Après IoN ligature, les rats présentent des changements dans le comportement spontané et en réponse à la stimulation de cheveux de von Frey qui sont indicatifs de la douleur persistante et l'allodynie mécanique. Deux phases peuvent être définies dans le développement des changements de comportement. Au cours de la première semaine suivant ions CCI (phase 1), les rats montrent une activité de toilettage visage accrue et asymétrique, à savoir, avec lavage du visage coups en premier lieu au territoire IoN nerf blessé. Une distinction est faite entre la face grooming comportement qui fait partie d'un comportement corps toilettage plus général, qui reste largement affectée par ions CCI, et le visage de toilettage qui est suivie ni précédée par toilettage du corps, qui est significativement augmentée après ions CCI. Au cours de cette période, la réactivité à la stimulation mécanique du territoire ions est réduite. Cette hyporéactivité est brusquement remplacé par une hyperréactivité extrême selon laquelle, même très faibles intensités de relance provoquent comportement nocifensive (phase 2). Les similitudes phénoménologiques entre ces altérations du comportement et signalé des signes de douleur faciale (ie, les réponses à une stimulation nociceptive du visage) suggèrent la présence de dysesthésies / paresthésie et allodynie mécanique dans le territoire IoN ligaturé.

Introduction

Les dommages aux nerfs somato conduit le plus souvent à une perte de sensation. Il est pas très bien compris pourquoi et comment, dans certains cas, les dommages du nerf périphérique conduit à la douleur chronique. En conséquence, les neuropathies douloureuses demeurent une condition difficile à traiter ¹ et se traduire par des réductions substantielles dans la qualité de vie des patients ^2-3. Les modèles animaux sont un outil important pour examiner l'efficacité des médicaments existants et nouvellement développés et d'identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement et l'entretien de la douleur neuropathique. Parmi les principaux défis pour la recherche sur la douleur de la traduction est d'identifier et de mesurer la douleur spontanée chez les animaux (c.-à-physiologique, manifestations comportementales ou d'autres qui indiquent la présence de la douleur chez les animaux qui ne sont pas remis en question avec de sondage stimulations qui sont gravement superposent à la condition basale du sujet ). L'objectif global de cette procédure est d'induire chirurgicalement unelésion du nerf sous-orbitaire chez un rat qui mène au développement à la fois spontanée et évoqué le comportement nocifensive qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes impliqués dans la douleur neuropathique trijumeau et de son traitement.

Réalisé, isolé visage toilettage est une mesure unique de la douleur neuropathique spontanée chez les rats. Après une lésion constriction chronique (CCI) du nerf sous-orbitaire (Ion), les rats présentent des changements dans le comportement spontané et en réponse à la stimulation tactile qui sont indicatifs de la douleur persistante et l'allodynie mécanique ^4. Après ions CCI, les rats montrent une activité de toilettage visage accrue et asymétrique, à savoir, avec lavage du visage coups en premier lieu au territoire IoN nerf blessé. Contrairement à la stimulation nocive du visage (par exemple, l'injection de formol) ^5, non douloureuse des troubles sensoriels (ie, unilatérale coupure de vibrisses, anesthésie sous-orbitaire blocage nerveux, application d'huile minérale sur vibriSSAE) ne l'ont pas ou seulement très brièvement (à savoir, les premières minutes après le début) induisent un changement significatif dans le comportement face à ⁶ toilettage. Il a été conclu que ce toilettage anormale après ions CCI est une manifestation comportementale des sensations spontanées, très agressives dans le territoire du nerf blessé. Ce comportement chez le rat ions CCI porte forte ressemblance à la douleur spontanée observée chez les patients. D'autres études ont identifié une différence importante entre le comportement de toilettage pour le visage qui fait partie d'un comportement de toilettage du corps plus général (par exemple, «toilettage de visage pendant corps grooming»), qui reste largement affectée par ions CCI, et le visage nocifensive toilettage qui ne soit ni précédée ni suivi par le corps de toilettage (ie, "visage isolé grooming»), qui est significativement augmentée après ions CCI ^7-9. Pharmacologiquement, toilettage de visage pendant corps toilettage constitue une excellente mesure de contrôle pour les effets non spécifiques drogue ( par exemple, la sédation) qui peuvent altérer la fonction du moteur. Les mouvements des membres antérieurs au cours des deux types de visage toilettage sont exactement les mêmes.

Après ions CCI, les rats présentent également des changements en réponse à la stimulation tactile qui sont indicatifs de l'allodynie mécanique ^{4, 10.} Pendant la première semaine (s) après ions CCI, les rats ne répondent plus aux tactile légère ou modérée (c.-à-von Frey stimuli). Cette hyporéactivité est ensuite brusquement remplacée par une hyperréactivité extrême lequel même de très faibles intensités de relance provoquent comportement nocifensive. Le début de l'hyperréactivité peut varier entre les rats, mais la plupart des rats sont devenus hyperréactives après trois à quatre semaines après l'intervention.

Protocole

Déclaration éthique: Les animaux sont traités et soignés selon les directives du Comité pour la recherche et des questions éthiques de l'IASP ^11. Le protocole est approuvé par le comité d'éthique institutionnelle.

1. Sujets

1. Utilisez des rats mâles Sprague-Dawley (250-300 g à l'arrivée).
2. Maison des rats dans des cages à plancher dans une salle de colonie avec une humidité de 40-60% et un RT de 21 ± 1 ° C.
3. Faire de l'eau et de la nourriture disponible à volonté.
4. Gardez rats sous une 12:12 h sombre du cycle inversé / lumière (lumières allumées à 20 h).

2. Chirurgie

1. Par rat, préparer deux morceaux de ligature de l'intestin chromique (5-0) d'environ 6 cm de long et les placer dans une solution saline stérile pour éviter le séchage et de devenir raide et cassante.
2. Anesthésier l'animal avec du pentobarbital (60 mg / kg, ip) et traiter avec de l'atropine (0,1 mg / kg, ip). Surveiller le niveau de l'anesthésie en étendant une jambe et pinching le web de la peau entre les orteils avec un ongle afin d'assurer une pression suffisante est appliquée. Assurez-vous que l'animal ne fléchir pas sa branche. Si nécessaire, administrer pentobarbital supplémentaire.
3. Raser la tête du rat de sorte qu'un cuir chevelu incision médiane de la ligne peut être d'environ 25 mm avec des distances égales antérieure et postérieure au centre des yeux.
4. Fixer la tête du rat dans un cadre stéréotaxique ou autrement fixer la tête du rat. Placez le rat sur un coussin chauffant pour maintenir la température du corps.
5. Appliquer une pommade ophtalmique sur les deux yeux afin de prévenir les dommages causés par le séchage.
6. Frotter la surface de la tête rasée avec de l'alcool, puis la bétadine.
7. Faire une incision du cuir chevelu à mi-ligne, d'exposer le crâne et les os nasal.
8. Utilisez un microscope d'opération pour exécuter les étapes 02/09 à 02/16.
9. Disséquer le bord de l'orbite libre, formé par le maxillaire, frontal, lacrymal et zygomatique, en utilisant un tampon de coton-tige et d'une paire de pinces Dumont. Utilisez le tampon de sorteak du sang d'une hémorragie possible.
10. Pour donner accès à l'ion, dévier doucement le contenu orbitaux et avec un coton-tige de précision, en prenant soin de ne pas trop le nerf ethmoïdale antérieure qui traverse supérieure à l'ion. Disséquer l'ion libre du tissu conjonctif environnant, en utilisant un tampon de coton-tige précision et une paire de pinces Dumont en utilisant un mouvement d'épandage. Utilisez le tampon pour absorber le sang d'une hémorragie possible.
11. Pour effectuer une ligature, pousser une extrémité d'un seul morceau de l'intestin chromique bas le long de l'os frontal, en dedans de l'ion et avancer de quelques millimètres parallèle et inférieure à l'ion. La ligature est désormais maintenu en place entre l'ion et de l'os frontal.
12. Glissez la pointe d'un 45 degrés pince Dumont inclinées sous l'ion de le placer à proximité de la ligature. Rétracter doucement l'ion latéralement pour révéler la ligature et le bout de la pince. Grip la ligature avec la pince et retirer la pince latéralement sous l'ion.
13. Extraire la ligature de la cavité orbitale jusqu'à ce que les deux extrémités de la ligature sont plus ou moins égale distance de l'ion.
14. Faire un "noeud coulant" à partir des deux extrémités de la ligature permet une maîtrise parfaite sur le degré de constriction et faites glisser le noeud contre l'ion. Faites glisser le nœud à la suite de resserrer l'ion sorte que le diamètre du nerf est réduit d'un montant à peine perceptible. Faire un nœud sur le dessus de la normale le nœud coulant de sorte que le montant de constriction reste constante (ie, pour empêcher le noeud de la fente de glisser).
15. Couper les ligatures de laisser environ 2 mm d'extrémités libres du noeud.
16. Répétez la même procédure (étapes 2.11 à 2.15) pour faire une deuxième ligature 2 mm en dehors de la première.
17. Pour une intervention chirurgicale fictive, effectuez les étapes 02.02 à 02.10.
18. Fermer l'incision du cuir chevelu en utilisant des sutures de polyester (4-0) et laisser le rat de récupérer sur un coussin chauffant. Ne pas laisser l'animal sans surveillance tant qu'il a retrouvé contre suffisantesciousness de maintenir décubitus sternal et ne pas remettre l'animal à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli.
19. Pour éviter les effets analgésiques de préemption sur le développement de la douleur neuropathique, ne pas administrer une analgésie pour la douleur post-chirurgicale.

3. Procédure de test comportemental

1. Permettre aux rats à acclimater pendant au moins 8 jours à des conditions de logement avant l'essai pré-opératoire.
2. Habituer les rats à la procédure de test au moins une fois par jour pendant trois jours avant les essais pré-opératoire.
3. Test de conduite dans une pièce sombre avec la lumière fournie par un W ampoule rouge suspendu 60 1 m au-dessus du centre de la zone d'essai d'éclairage du centre, mais en laissant la circonférence faible et le reste de la chambre noire.
4. Assurez-vous qu'il est le bruit de fond suffisante pour diminuer les interférences de la stimulation auditive soudaine. Si nécessaire, fournir un bruit blanc.
5. Observation du comportement de toilettage du visage
   1. TRANSPORT un seul rat de la colonie à la salle de test dans une cage en plastique couverte sans literie. Note: Idéalement, cela devrait être un court voyage avec des stimuli externes minimales.
   2. Placez le rat dans un endroit couvert, cage de plastique transparent sans literie (L xlx H: 24 cm x 14 cm x 17 cm) avec un miroir de retour devant une caméra vidéo.
   3. Faire un enregistrement de 10 min du comportement de l'animal. Pendant l'enregistrement, assurez-vous que l'expérimentateur est pas présent dans la salle d'essai.
   4. Nettoyez la cage d'observation avant de placer l'animal suivant.
   5. Assurez-vous que le comportement enregistrée est analysée par un expérimentateur qui est aveugle à la condition expérimentale du rat.
   6. Faire un enregistrement de chaque épisode visage de toilettage pendant l'enregistrement de 10 min. Remarque: Visage toilettage est défini comme modèles de mouvement dans lequel les pattes de devant sont mis en contact avec les zones du visage.
   7. Faire une distinction entre deux types de comportement face toilettage. Si une séquence est suivie ni précédée parcorps toilettage (ie, toilettage d'une zone du corps autre que la face), classer l'épisode comme isolé visage toilettage. Si le corps de toilettage est effectuée immédiatement avant ou après le visage de toilettage, de classer l'épisode comme le visage lors de toilettage toilettage corps.
   8. Déterminer le nombre d'épisodes visage de toilettage.
      1. Catégoriser un laps de temps entre les actions de visage toilettage qui ne dépasse pas 4 sec comme un espace intra-épisode (ie, une pause entre les actions de visage toilettage dans un seul épisode).
      2. Catégoriser une période de temps entre le visage actions de toilettage qui dépasse 4 sec comme un espace inter-épisode (ie, une interruption complète des actions de visage toilettage entre deux épisodes).
6. Les tests de stimulation mécanique
   1. Rats de transport dans des groupes de jusqu'à 6 animaux de la colonie à la salle de test dans une cage couverte avec literie. Assurez-vous que cela est un court voyage avec des stimuli externes minimales.
   2. Placer lerats individuellement dans des cages en plastique transparent avec une literie (L xlx H: 24 cm x 14 cm x 17 cm) avec un couvercle à charnière de sorte qu'il peut être facilement ouverts et fermés.
   3. Utilisez une série graduée de cinq cheveux de von Frey. Remarque: La force nécessaire pour plier les poils est de 0,015 g, 0,127 g, 0,217 g, 0,745 g et 2,150 g.
   4. Habituer les rats à la cage d'observation et des mouvements atteignant pendant 10 min. Toutes les 30 secondes, ouvrez le couvercle et touchez doucement la paroi de la cage avec une tige en plastique.
   5. Lorsque l'animal est dans un / pas d'état de locomotion renifler (ie, avec quatre pattes posées sur le sol, ni mouvement, ni le gel, mais présentant reniflant comportement), appliquer la première cheveux von Frey sur le territoire IoN près du centre de la plaquette de vibrisse , sur la peau velue entourant le vibrisses mystacial.
   6. Note de la réponse de l'animal à la stimulation d'appartenir à l'une des catégories de réponses suivantes ^4.
      1. Catégoriser un manque complet de réponse0 marquer.
      2. Catégoriser un détection de stimulus (ie, le rat tourne la tête vers l'objet de stimulant et l'objet de relance est ensuite exploré) comme score à 1.
      3. Catégoriser une réaction de retrait (ie., Le rat tourne la tête lentement ou tire allègrement vers l'arrière lorsque la stimulation est appliquée, parfois une seule face essuyer ipsilatéral à la zone stimulée se produit) comme score à 2.
      4. Catégoriser / une réponse d'attaque d'échappement (ie., Le rat évite en outre le contact avec l'objet de relance, soit passivement en déplaçant son corps loin de l'objet stimulant à assumer une position accroupie contre le mur de la cage, ou activement en attaquant l'objet de relance, ce qui rend mordant et saisissant mouvements) le score 3.
      5. Catégoriser visage asymétrique toilettage (à savoir, le rat affiche une série ininterrompue d'au moins trois coups face lavage dirigés vers la zone du visage stimulé) le score 4.
      6. Au sein de chaque animal, appliquer Stimuli dans un ordre croissant d'intensité. Après une intensité du stimulus a été appliqué d'un côté, l'appliquer à l'autre côté avant de passer à la prochaine intensité du stimulus. Aléatoire l'ordre dans lequel les côtés ipsilatéraux et controlatéraux sont stimulés. Notez que l'animal doit être dans un / pas d'état de locomotion renifler avant chaque stimulation.

Résultats

Rats ions CCI montrent une forte augmentation post-opératoire dans la quantité de temps passé sur le visage isolé toilettage (Figure 1). L'augmentation des pics à la fin de la première semaine post-opératoire et puis diminue au cours des semaines suivantes. La plupart des études récentes ont montré le visage de toilettage être considérablement augmenté pour un maximum de trois semaines. Visage comportement de toilettage dans subi une opération fictive rats est plus ou moins affectée. ...

Discussion

L'aspect le plus intéressant du modèle ions CCI est qu'il fournit une mesure unique de, (neuropathique) douleur spontanée non-évoquée. La plupart des études sur les animaux de la douleur neuropathique, en utilisant des modèles de nerfs rachidiens, adresse exclusivement comportements nocifensives (par ex., La vocalisation et les réponses de sevrage), reflétant une hypersensibilité aux stimulations mécaniques ou thermiques ^12. Cependant, la plainte clinique chef chez les patients est...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut	Dynek	CG504
Nembutal  (pentobarbital)	Pharmacy
Atropine	Pharmacy
Clippers for small animals - Favorita II	Aesculap	GT104
Stereotaxic instrument	Stoelting	51600
Ophthalmic ointment (Liposic)	Pharmacy
Homeothermic monitor system	Harvard Apparatus	PY8 50-7221-F
Cotton applicator	Pharmacy
Precision cotton swab	Qosina	10225
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Polyester sutures - Mersilene (4-0)	Ethicon	R871H
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011