Chronische Verengung Verletzung des Ratten N. infraorbitalis (Ionen CCI) zu Trigeminal Neuropathischer Schmerz Studieren

Zusammenfassung

This manuscript describes a rodent model to study trigeminal neuropathic pain. The methods described include surgical procedures to perform a chronic constriction injury of the rat’s infraorbital nerve and the post-surgical behavioral tests to measure the changes in spontaneous and evoked behavior that are indicative of persistent pain and allodynia.

Zusammenfassung

Tiermodelle sind wichtige Instrumente, um die Pathophysiologie und Pharmakologie von neuropathischen Schmerzen zu studieren. Dieses Manuskript beschreibt die chirurgische und Verhaltens Verfahren Trigeminus neuropathischen Schmerzen bei Ratten untersucht werden. Um die Spezifität der Trigeminus neuropathischen Schmerzsyndromen gerecht zu werden, wird der N. infraorbitalis (Ion) zu einer chronischen Verengung Verletzungen (CCI) von lose Ligation des Nervenunterzogen. Eine innerOrbital Ansatz wird hier vorgestellt zu entlarven und zu ligieren des Ions in der Augenhöhle. Nach der Ionenbindung, Ratten zeigen spontane Verhaltensveränderungen und in Reaktion auf von Frey Haare Stimulation, die indikativ für chronische Schmerzen und mechanische Allodynie ist. Zwei Phasen in der Entwicklung der Verhaltensänderungen definiert werden. Während der ersten Woche nach Ionen CCI (Phase 1), Ratten zeigen eine erhöhte und asymmetrische Gesicht Pflege Aktivität, dh mit Gesicht zu waschen Striche vor allem auf die Nerven verletzt IoN Gebiet ausgerichtet. Es wird unterschieden zwischen Gesicht gr gemachtooming Verhalten, das Teil eines allgemeineren Körperpflegeverhalten, das durch Ionen CCI weitgehend unberührt bleibt, ist, und Gesicht Pflege, dass weder vorausgeht noch gefolgt von Körper Pflege, die nach Ionen CCI deutlich erhöht wird. Während dieser Zeit wird die Reaktions auf mechanische Stimulation des Ionen Gebiet reduziert. Diese hyporesponsive abrupt durch eine extreme Überempfindlichkeit, wodurch auch sehr schwache Reizstärken provozieren nozifensiven Verhalten (Phase 2) ersetzt. Die phänomenologische Ähnlichkeiten zwischen diesen Verhaltensänderungen und berichteten Anzeichen von Gesichtsschmerzen (dh Reaktionen auf schädliche Stimulation des Gesichts) deuten auf das Vorhandensein Dysästhesie / Parästhesie und mechanischer Allodynie im ligiert IoN Territorium.

Einleitung

Schäden an somatosensorischen Nerven führt häufig zu Verlust der Empfindung. Es ist nicht gut verstanden, warum und wie in einigen Fällen führt die periphere Nervenschädigungen, chronische Schmerzen. Als Ergebnis bleibt schmerzhafte Neuropathien eine schwierige Bedingung zu behandeln ¹ und führen zu erheblichen Verringerungen der Lebensqualität ^2-3 Patienten. Tiermodelle sind ein wichtiges Werkzeug, um die Wirksamkeit von bestehenden und neuen Medikamenten zu prüfen und die pathophysiologischen Mechanismen der Entwicklung und Aufrechterhaltung von neuropathischen Schmerzen beteiligt sind. Zu den wichtigsten Herausforderungen für die translationale Schmerzforschung ist die Identifikation und Messung von spontanen Schmerzen bei Tieren (dh physiologische, Verhaltens- oder andere Erscheinungsformen, die das Vorhandensein von Schmerzen bei Tieren, wobei nicht mit Sondierungs Stimulationen, die akut von der Person basalen Zustand überlagert sind herausgefordert werden zeigen, ). Das Gesamtziel dieses Verfahrens ist es, eine chirurgisch herbeiinfraNervenVerletzung in einem Ratten, die zur Entwicklung von sowohl spontane führt und evozierte nozifensiven Verhalten, das verwendet werden kann, um die Mechanismen in trigeminal neuropathischen Schmerzen und ihre Behandlung beteiligt studieren.

Regie, isoliert Gesicht Pflege ist ein einzigartiges Maß der spontanen neuropathische Schmerzen bei Ratten. Im Anschluss an chronische Verengung Verletzungen (CCI) des N. infraorbitalis (Ion), Ratten zeigen Veränderungen in der Spontanverhalten und in Reaktion auf taktile Stimulation, die indikativ für anhaltende Schmerzen und mechanischer Allodynie ⁴ sind. Nach der Ionen CCI, Ratten zeigen eine erhöhte und asymmetrische Gesicht Pflege Aktivität, dh mit Gesicht zu waschen Striche vor allem auf die Nerven verletzt IoN Gebiet ausgerichtet. Im Gegensatz zu den schädlichen Stimulation des Gesichts (zB Formalin-Injektion) ^5, nicht schmerzhafte sensorische Störungen (dh einseitige vibrissae Clipping, Narkose N. infraorbitalis Blockade Anwendung von Mineralöl auf VIBRISSAE) nicht oder nur sehr kurz (dh die ersten Minuten nach dem Beginn) induzieren eine signifikante Veränderung der Gesichtspflegeverhalten ^6. Daraus wurde geschlossen, dass dieses abnorme Körperpflege nach dem Ionen CCI ist eine Verhaltens Manifestation der spontanen, stark aversive Empfindungen im verletzten Nervengebiet. Dieses Verhalten in Ionen CCI-Ratten trägt starke Ähnlichkeit mit bei Patienten beobachtet, die spontane Schmerzen. Weitere Studien haben einen wichtigen Unterschied zwischen Gesicht Pflege Verhalten, das Teil eines allgemeineren Körperpflegeverhalten identifiziert (dh "Gesicht Pflege während der Körper Grooming"), die durch Ionen CCI weitgehend unberührt bleibt, und nozifensiven Gesicht Pflege, dass weder voran noch gefolgt von Körperpflege (dh "isoliert Gesicht Grooming"), die nach dem Ionen CCI ^7-9 deutlich erhöht wird. Pharmakologisch, gesicht grooming während Körper Pflege bildet eine ausgezeichnete Kontrollmessung für nicht-spezifische Arzneimittelwirkungen ( zB Sedierung), die Motorfunktion beeinträchtigen können. Bewegungen der Vorderbeine in den zwei Arten von Gesichts Grooming genau gleich sind.

Nach der Ionen CCI, Ratten auch Veränderungen aufweisen als Reaktion auf taktile Stimulation, die indikativ für mechanischer Allodynie ^{4, 10 sind.} In der ersten Woche (n) nach dem Ionen CCI, Ratten nicht mehr zu leichten oder mittelschweren taktile (dh von Frey antworten ) Reize. Diese hyporesponsive wird dann abrupt durch eine extreme Überempfindlichkeit, wodurch auch sehr schwache Reizstärken provozieren nozifensiven Verhalten ersetzt. Der Beginn der Überempfindlichkeit kann zwischen Ratten variieren, aber die meisten Ratten haben sich nach drei bis vier Wochen nach der Operation hyper.

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Protokoll

Ethics Statement: Die Tiere werden behandelt und gepflegt nach den Richtlinien des Ausschusses für Forschung und ethische Fragen der IASP ^11. Das Protokoll wird von der institutionellen Ethikkommission genehmigt.

1. Themen

1. Verwenden männlichen Sprague-Dawley-Ratten (250-300 g bei der Ankunft).
2. Haus Ratten in Käfige mit festem Boden in einer Kolonie Raum mit einer Luftfeuchtigkeit von 40-60% und einer RT von 21 ± 1 ° C.
3. Machen Sie Wasser und Nahrung an libitum.
4. Halten Ratten unter einer umgekehrten 00.12 h hell / dunkel-Zyklus (Licht an um 20 h).

2. Chirurgie

1. Pro Ratte, lange Vorbereitung zwei Stücke von Chrom gut Ligatur (5-0) von ca. 6 cm und legen Sie sie in steriler Kochsalzlösung, um das Trocknen und steif und spröde zu vermeiden.
2. Betäuben die Tiere mit Pentobarbital (60 mg / kg, ip) und behandle mit Atropin (0,1 mg / kg, ip). Überwachen Sie die Narkosetiefe durch die Erweiterung ein Bein und pinching das Netz der Haut zwischen den Zehen mit dem Fingernagel, um eine ausreichende Druck ausgeübt wird. Sicherzustellen, dass das Tier nicht seine Schenkel zu biegen. Falls erforderlich, zu verwalten zusätzlichen Pentobarbital.
3. Rasieren Sie den Kopf der Ratte, so dass eine Mittellinie der Kopfhaut Schnitt kann von ca. 25 mm mit gleichen Abständen vor und hinter der Mitte der Augen gestellt werden.
4. Befestigen Sie den Kopf der Ratte in einem stereotaktischen Rahmen oder den Kopf der Ratte anderweitig zu fixieren. Legen Sie die Ratte auf einem Heizkissen auf Körpertemperatur zu halten.
5. Bewerben Augensalbe auf beiden Augen, um Schäden durch Austrocknen zu verhindern.
6. Scrub die rasierten Kopf-Bereich mit Alkohol, dann Betadin.
7. Machen Sie eine Mittellinie Kopfhauteinschnitt, Belichten Schädel und Nasenbein.
8. Verwenden Sie ein Operationsmikroskop, Schritte zu 2,16 durchzuführen 2.9.
9. Präparieren Sie die Kante der Bahn frei, durch den Oberkiefer, frontal, Tränen- und Jochbeine gebildet wird, mit einem Wattestäbchen und ein Paar von Dumont Pinzetten. Verwenden Sie den Tupfer, um soak bis Blut aus möglichen Blutungen.
10. Um den Zugriff auf die Ionen geben, sanft lenken die Orbitalinhalt mit einer Genauigkeit Wattestäbchen, kümmert sich nicht um die vorderen N. ethmoidalis, die überlegene, um den Ionen kreuzt überfordern. Sezieren die Ionen frei von der umgebenden Bindegewebes, unter Verwendung eines Präzisions Wattestäbchen und ein Paar von Dumont Pinzetten mit einem Streu Bewegung. Verwenden Sie den Tupfer, um vor möglichen Blutungen tanken Blut.
11. Um eine Ligation durchzuführen, schieben Sie ein Ende eines einzigen Stück Chrom gut nach unten entlang der Stirnbein, medial der Ionen- und voran wenige Millimeter parallel und unterlegen, um den Ionen. Die Ligatur wird nun zwischen dem Ion und dem Stirnbein gehalten.
12. Gleiten Sie mit der Spitze eines 45-Grad abgewinkelten Dumont Pinzetten unter dem Ionen um es in unmittelbarer Nähe zu der Ligatur zu platzieren. Vorsichtig zurückziehen der Ionen seitlich, um das Blattschraube und Spitze der Zange zu offenbaren. Grip die Ligatur mit der Zange und lateral zurückzuziehen die Zange unter dem Ion.
13. Ziehen Sie die Unterbindung von der Augenhöhle, bis beide Enden der Ligatur sind mehr oder weniger gleich weit entfernt von der Ionen.
14. Machen Sie einen "Laufknoten" von den beiden Enden der Ligatur die perfekte Kontrolle über den Grad der Verengung zu ermöglichen, und schieben Sie den Knoten vor dem Ion. Schieben Sie den Knoten weiter, um den Ionen verengen, so dass der Durchmesser des Nervs wird durch einen eben merklichen Betrag reduziert. Einen normalen Knoten am Anfang der Laufknoten, so dass die Höhe der Verengung konstant bleibt (dh, um den Schlitz Knoten Verrutschen zu verhindern).
15. Schneiden Sie die Ligaturen um ca. 2 mm der freien Enden von dem Knoten zu verlassen.
16. Wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 2,11-2,15), um einen zweiten Ligation 2 mm von der ersten zu machen.
17. Für Scheinoperation, führen Sie die Schritte 2,2 bis 2,10.
18. Schließen Sie den Kopfhauteinschnitt mit Polyesterfäden (4-0) und lassen Sie die Ratte auf einem Heizkissen erholen. Stellen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend Nachteile wiederciousness um Brustlage zu erhalten und nicht das Tier an die Firma von anderen Tieren zurück, bis er vollständig wiederhergestellt wird.
19. Das Bezugsschmerzstillende Wirkung auf die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen zu vermeiden, nicht zu verwalten Analgesie bei postoperativen Schmerzen.

3. Verhaltenstestverfahren

1. Lassen Sie Ratten, die für mindestens 8 Tage zu den Haltungsbedingungen vor präoperativen Test akklimatisieren.
2. Habituate Ratten der Testvorschrift wurden mindestens einmal täglich für drei Tage vor der präoperativen Tests.
3. Verhaltenstests in einem abgedunkelten Raum mit Licht von einer 60 W rote Glühbirne vorgesehen suspendiert 1 m über der Mitte der Testfläche Beleuchtung des Zentrums, aber verlassen Sie den Umfang dim und der Rest des Raumes dunkel.
4. Achten Sie darauf, genügend Hintergrundgeräusche, Störungen von plötzlichen Gehörstimulation zu verringern. Falls erforderlich, liefern weißes Rauschen.
5. Beobachtung Gesicht Putzverhalten
   1. Transport eine einzelne Ratte aus der Kolonie, um den Testraum in eine überdachte Kunststoffkäfig, ohne Bettwäsche. Hinweis: Idealerweise sollte dieser eine kurze Fahrt mit minimalen äußeren Reize sein.
   2. Legen Sie die Ratte in einem überdachten, durchsichtigen Kunststoffkäfig, ohne Bettzeug (LxBxH: 24 cm x 14 cm x 17 cm) mit einem wieder vor einer Videokamera gespiegelt.
   3. Machen Sie eine 10 min Aufzeichnung das Verhalten des Tieres. Während der Aufnahme sicher, dass der Experimentator nicht in den Testraum vorhanden ist.
   4. Reinigen Sie die Beobachtungskabine, bevor Sie das nächste Tier.
   5. Sicherstellen, dass die aufgezeichneten Verhalten wird durch ein Experimentator, blind für die experimentellen Bedingungen der Ratte untersucht.
   6. Notieren Sie sich jede Fläche grooming Folge während der 10 Minuten Aufnahme. Hinweis: Gesicht Pflege wird als Bewegungsmuster, bei dem die Vorderpfoten sind in Kontakt mit Gesichtsbereiche gebracht definiert.
   7. Unterscheiden zwischen zwei Arten von Gesichtsputzverhalten. Wenn eine Sequenz weder voran noch gefolgt vonKörperpflege (dh Pflege eines Körpergebiets außer dem Gesicht), kategorisieren die Episode als isoliert Gesicht Pflege. Wenn Körper Pflege wird unmittelbar vor oder nach dem Gesicht Pflege durchgeführt wird, kategorisieren die Episode als Gesicht Pflege während der Körper Pflege.
   8. Bestimmen Sie die Anzahl der offenen Pflege Episoden.
      1. Kategorisieren Sie eine Zeitspanne zwischen Gesicht Pflege Aktionen, die 4 Sekunden als inner Folge Raum nicht überschreitet (dh eine Pause zwischen den Gesichtspflegemaßnahmen in einer einzigen Folge).
      2. Kategorisieren Sie eine Zeitspanne zwischen Gesicht Pflege Aktionen, die 4 Sekunden als inter Folge Raum (dh eine vollständige Unterbrechung der Gesichtspflegemaßnahmen zwischen zwei Folgen) überschreitet.
6. Mechanische Stimulation Tests
   1. Transport Ratten in Gruppen von bis zu 6 Tieren aus der Kolonie, um den Testraum in einem bedeckten Käfig mit Bettwäsche. Stellen Sie sicher, dass es sich um eine kurze Fahrt mit minimalen äußeren Reizen.
   2. Legen Sie dieRatten einzeln in durchsichtige Kunststoffkäfige mit Betten (lxwxh: 24 cm x 14 cm x 17 cm) mit einem angelenkten Deckel, so daß er leicht geöffnet und geschlossen werden.
   3. Verwenden Sie eine abgestufte Serie von fünf von Frey Haaren. Hinweis: Die erforderliche, um die Haare zu biegen ist 0.015 g, 0.127 g, 0.217 g, 0.745 g und 2.150 g.
   4. Gewöhnen die Ratten zum Beobachtungskäfig und Greifbewegungen für 10 min. Alle 30 Sekunden, den Deckel öffnen und sanft berühren die Wand des Käfigs mit einem Kunststoffstab.
   5. Wenn das Tier in einem Sniffing / ohne Bewegungszustand (dh mit vier Pfoten auf dem Boden platziert, weder bewegliche noch eiskalt, aber ausstellenden Schnüffelverhalten), gelten die ersten von Frey Haare innerhalb der Ionen Gebiet in der Nähe der Mitte des vibrissal Pad , auf der behaarten Haut um die mystacial Tasthaare.
   6. Note die Reaktion des Tieres auf die Stimulation auf eine der folgenden Antwortkategorien ⁴ gehören.
      1. Kategorisieren Sie einen völligen Mangel an Antwort alsScore 0.
      2. Kategorisieren Sie einen Stimulus Erkennung (dh die Ratte dreht den Kopf in Richtung der anregenden Objekts und die Anregung Objekt wird dann untersucht), wie stand es 1.
      3. Kategorisieren Sie eine Auszahlung Reaktion (dh., Die Ratte dreht den Kopf langsam oder zieht es zügig nach hinten, wenn die Stimulation angewendet wird, manchmal ein einziges Gesicht zu wischen ipsilateral zur stimulierten Bereich auftritt), wie stand es 2.
      4. Kategorisieren Sie eine Flucht / Angriff Reaktion (dh., Vermeidet die Ratte weiteren Kontakt mit dem Stimulus-Objekt, entweder passiv, indem sein Körper von der anregenden Aufgabe, eine kauernde Stellung gegen die Käfigwand übernehmen, oder aktiv durch Angriffe auf die Stimulus-Objekts, indem Beißen und packte Bewegungen) als Partitur 3.
      5. Kategorisieren asymmetrische Gesicht Pflege (dh, zeigt der Ratte eine ununterbrochene Reihe von mindestens drei Gesichtswasch Striche zu der stimulierten Gesichtsbereich gerichtet ist) als Partitur 4.
      6. Innerhalb jedes Tier, gelten stimuli in aufsteigender Reihenfolge der Intensität. Nachdem ein Stimulusintensität an einer Seite aufgebracht worden ist, es auf der anderen Seite, bevor sie zu dem nächsten Stimulusintensität. Zufälliger Reihenfolge, in welcher die ipsilateralen und kontralateralen Seiten stimuliert werden. Beachten Sie, dass das Tier muss in einem Sniffing / ohne Bewegungszustand vor jeder Stimulation.

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Ergebnisse

Ionen CCI-Ratten zeigen eine starke postoperative Zunahme der Menge an Zeit auf isolierte Gesicht Pflege (Abbildung 1) verbracht. Die Zunahme Spitzen am Ende der ersten postoperativen Woche und dann sinkt in den folgenden Wochen. Neueste Studien haben Gesicht Pflege wesentlich für bis zu drei Wochen erhöht werden gefunden. Gesichtspflegeverhalten in scheinoperierten Ratten ist mehr oder weniger unberührt.

Ionen CCI-Ratten zeigen auch, eine fast vollständige Mangel an Rea...

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Diskussion

Der interessanteste Aspekt des Ionen CCI-Modell ist, dass es ein einzigartiges Maß für spontane, nicht-evozierte (neuropathischer) Schmerzen. Die meisten Tierstudien von neuropathischen Schmerzen, mit Spinalnerven Modellen, die ausschließlich Adresse nozifensiven Verhaltensweisen (z. B. Lautäußerungen und Entzug Reaktionen), was auf Überempfindlichkeit gegen mechanische oder thermische Reize ^12. , Ist der Chef der klinischen Beschwerden bei Patienten jedoch andauernden Schmerz, nicht Hyperalges...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut	Dynek	CG504
Nembutal  (pentobarbital)	Pharmacy
Atropine	Pharmacy
Clippers for small animals - Favorita II	Aesculap	GT104
Stereotaxic instrument	Stoelting	51600
Ophthalmic ointment (Liposic)	Pharmacy
Homeothermic monitor system	Harvard Apparatus	PY8 50-7221-F
Cotton applicator	Pharmacy
Precision cotton swab	Qosina	10225
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Polyester sutures - Mersilene (4-0)	Ethicon	R871H
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011