Хронический Сужение Травма крысы подглазничного нерва (ION-ТПП) для изучения невралгия тройничного нейропатической боли

Резюме

This manuscript describes a rodent model to study trigeminal neuropathic pain. The methods described include surgical procedures to perform a chronic constriction injury of the rat’s infraorbital nerve and the post-surgical behavioral tests to measure the changes in spontaneous and evoked behavior that are indicative of persistent pain and allodynia.

Аннотация

Животные модели являются важными инструментами для изучения патофизиологии и фармакологии нейропатической боли. Эта рукопись описывает хирургические процедуры и поведенческие учиться тройничного нейропатической боли у крыс. Чтобы удовлетворить специфику тройничного невропатической болевых синдромов, подглазничный нерва (ион) подвергают хронической травмы сужения (CCI) от слабо лигирования нерва. Внутри-орбитального подход представлен здесь, чтобы разоблачить и перевязывать иона в глазницы. После перевязки Ion, крысы проявляют изменения в поведении и спонтанной в ответ на фон Фрея волос стимуляции, которые свидетельствуют о постоянной боли и аллодинии механической. Две фазы могут быть определены в развитии поведенческих изменений. Во время первой недели после ионно-CCI (фаза 1), крысы проявляют повышенный и асимметричный холить деятельность лица, т.е. с умывания лица штрихи, прежде всего, направлены на нервной ранения Ion территории. Различие между номинальной грooming поведение, которое является частью более общего тела холить поведения, которая остается в значительной степени не зависит от ионно-ТПП, и лицо уход, что не является ни предшествует, ни с последующим тела ухода, который значительно возрастает после ионно-ТПП. В течение этого периода, реагирование на механическую стимуляцию территории иона уменьшается. Это hyporesponsiveness резко заменен крайней гиперчувствительности в результате чего даже очень слабые интенсивности стимула спровоцировать nocifensive поведение (фаза 2). Феноменологические сходство между этими поведенческими изменениями и сообщил, признаки лицевой боли (то есть, ответы на вредных стимуляции лица) предполагают наличие дизестезия / парестезии и механической аллодинии в лигированного Ion территории.

Введение

Повреждение нервов соматосенсорной наиболее часто приводит к потере ощущения. Это не очень хорошо понимал, почему и как, в некоторых случаях, периферическая нервные расстройства приводит к хронической боли. В результате, болезненные невропатии оставаться сложной условие для лечения ^{1 и} привести к существенному сокращению качества жизни пациентов ^2-3. Животные модели являются важным инструментом для изучения эффективности существующих и вновь разрабатываемых лекарственных препаратов и определить патофизиологические механизмы, участвующие в развитии и поддержании нейропатической боли. Среди ключевых проблем для исследования трансляционной боли является выявление и измерение спонтанной боли у животных (т.е., физиологические, поведенческие и другие проявления, которые указывают на присутствие боли у животных, которые не сталкиваются с проблемой зондирования стимуляции, которые остро накладываются на базальной состояния субъекта ). Общая цель этой процедуры является хирургическим индуцироватьподглазничная повреждение нерва у крысы, что приводит к развитию и спонтанным и вызывал nocifensive поведение, которое может использоваться для изучения механизмов, участвующих в тройничного нейропатической боли и ее лечении.

Режиссер, изолированных лицо уход является единственной мерой спонтанного нейропатической боли у крыс. После хронической травмы сужения (ТПП) подглазничного нерва в (ионов), крысы проявляют изменения в поведении и спонтанной в ответ на тактильную стимуляцию, которые свидетельствуют о постоянной боли и аллодинии механической ^4. После ионно-ТПП, крысы проявляют повышенный и асимметричный холить деятельность лица, т.е. с умывания лица штрихи, прежде всего, направлены на нервной ранения Ion территории. В отличие от вредных стимуляции лица (например, инъекции формалина) ^5, не больно сенсорные расстройства (т.е., односторонний вибриссы отсечения, анестетик блокада подглазничного нерва, применение минерального масла на vibriSSAE) не или только очень кратко (т.е., первые минуты после начала) вызывают значительные изменения в лице холить поведение ^6. Было решено, что это ненормальное уход после ионно-ТПП поведенческие проявления спонтанных, сильно отвращение ощущений на территории пострадавшего нерва. Такое поведение в ионно-ТПП крыс несет сильное сходство с спонтанную боль наблюдается у пациентов. Дальнейшие исследования выявили важную разницу между номинальной холить поведения, является частью ухаживания поведения более общей тела (то есть, "лицо уход во время теле стрижка"), которая остается в значительной степени не зависит от ионно-ТПП, и nocifensive лицо уход, что не является ни предшествует ни с последующим тела холить (т.е. "изолированные лица уход"), который значительно возрастает после ионно-ТПП ^7-9. Фармакологически, лицо уход во время ухода тела является отличным контрольное измерение для неспецифических эффектов наркотиков ( например, седативный эффект), который может ухудшить моторные функции. Движения передних конечностей в течение двух типов лица уход точно то же самое.

После ионно-промышленная палата, крысы проявляют также изменения в ответ на тактильную стимуляцию, которые свидетельствуют о механической аллодинии ^{4, 10.} В течение первой недели (ов) после ионно-ТПП, крысы больше не реагируют на легкой или умеренной тактильные (т.е. фон Фрея ) раздражители. Это hyporesponsiveness затем резко заменен крайней гиперчувствительности в результате чего даже очень слабые интенсивности стимула спровоцировать nocifensive поведение. Наступление гиперчувствительности может варьироваться от крыс, но большинство крыс стали hyperresponsive после трех-четырех недель после операции.

протокол

Заявление по этике: Животные лечение и уход в соответствии с руководящими принципами Комитета по исследованиям и этическим вопросам IASP ^11. Протокол утверждается институциональной этическим комитетом.

1. Субъекты

1. Используйте мужчин Спрэг Dawley крыс (250-300 г по прибытии).
2. House крысы в ​​твердом нижних клеток в колонии комнату с влажностью 40-60% и РТ 21 ± 1 ° С.
3. Сделайте воды и пищи в без ограничений.
4. Держите крысы в ​​обратном 12:12 ч темный / светлый цикл (свет включали в 20 часов).

2. Хирургическое

1. За крысы, подготовить две части хромовой кишечника лигатуры (5-0) примерно 6 см длиной и поместить их в стерильном физиологическом растворе, чтобы избежать высыхания и становится жесткой и хрупкой.
2. Обезболить животное с фенобарбиталом (60 мг / кг, внутрибрюшинно) и лечить с атропином (0,1 мг / кг, внутрибрюшинно). Контроль за уровнем анестезии, расширяя одну ногу и pinchiнг паутину кожи между пальцами с ногтями, чтобы обеспечить адекватное давление применяется. Убедитесь, что животное не сгибать ее конечности. При необходимости, управлять дополнительную фенобарбитал.
3. Бритье голову крысы таким образом, чтобы средней линии скальпа разрез может быть сделан примерно 25 мм с равных расстояниях передней и задней к центру глаза.
4. Fix голову крысы в ​​стереотаксической рамы или иначе зафиксировать голову крысы. Поместите крысу на нагретой подушки для поддержания температуры тела.
5. Применить глазной мази на обоих глазах, чтобы предотвратить ущерб от сушки.
6. Скраб бритая голова область с алкоголем, то Бетадин.
7. Сделайте в середине строки головы разрез, обнажая череп и кости носа.
8. Используйте операционным микроскопом, чтобы выполнить шаги 2.9 до 2,16.
9. Проанализируйте края орбиты бесплатно, образованной верхнечелюстной, лобной, слезной и скуловой кости, используя ватным тампоном и пару Дюмон щипцами. Используйте тампон такак кровь от возможного кровотечения.
10. Чтобы предоставить доступ к иону, мягко отвлечь орбитальных содержимое с точностью ватным тампоном, стараясь, чтобы не затягивать передней решетчатой ​​нерв, который пересекает превосходит иона. Рассекают свободных ионов из окружающей соединительной ткани, с использованием прецизионного ватным тампоном и пару Дюмон щипцов с использованием расширяющего движение. Используйте тампон, чтобы впитать кровь от возможного кровотечения.
11. Чтобы выполнить перевязку, нажмите один конец цельного куска хромовой кишечнике вниз по лобной кости, медиальная к иону и продвигать несколько миллиметров параллельно и ниже иона. Лигатуры сейчас удерживается на месте между ионом и лобной кости.
12. Наденьте наконечник 45 градусов углом Дюмон щипцов под ION, чтобы поместить его в непосредственной близости от лигатуры. Аккуратно убрать иона с боков, чтобы выявить лигатуры и кончик пинцетом. Возьмитесь за вязь с пинцетом и вывести щипцы с боков из-под ионов.
13. Вынуть лигатуры из глазницы, пока оба конца лигатуры не более или менее на одинаковом расстоянии от иона.
14. Сделать "скольжения узла" из двух концов лигатуры, чтобы идеальный контроль за степенью сужения и сдвиньте узел против ионов. Вставьте узел дополнительно сжимать иона, так, что диаметр нерва уменьшается в размере Маловыраженные. Сделать нормальную узел в верхней части скольжения узла таким образом, чтобы количество сужения остается постоянным (т.е. для предотвращения щелевой узел от скольжения).
15. Вырезать лигатуры, чтобы оставить примерно 2 мм от свободных концов узла.
16. Повторите ту же процедуру (шаги 2.11 2.15), чтобы сделать второй перевязки 2 мм друг от друга с первого раза.
17. Для мнимой операции, выполните шаги 2.2 до 2.10.
18. Закройте головы разрез, используя полиэфирные швов (4-0) и позволяют крысы восстановить на нагретой подушки. Не оставляйте без присмотра животное, пока он не восстановил против достаточныеciousness поддерживать грудины лежачее положение и не вернуть животное в компании других животных, пока он полностью не восстановился.
19. Чтобы избежать преимущественного обезболивающее воздействие на развитие нейропатической боли, не управлять обезболивание послеоперационный боли.

3. Порядок поведенческий тест

1. Разрешить крысы акклиматизироваться в течение по крайней мере 8 дней до жилищных условий до предоперационного тестирования.
2. Приучают крыс к процедуре тестирования по крайней мере, один раз в день в течение трех дней, прежде чем до операции тестирования.
3. Проведение тестирования в затемненной комнате со светом, предоставленной 60 Вт лампочки красного приостановлено 1 м выше центра пробной площади освещая центр, но оставляя окружность тусклым и остальная часть темной комнате.
4. Убедитесь, что имеется достаточно фонового шума, чтобы уменьшить помехи от внезапной слуховой стимуляции. При необходимости обеспечить белый шум.
5. Наблюдение лица поведения груминг
   1. Тransport один крысу из колонии в испытательной камере в крытой клетке без пластиковой постельные принадлежности. Примечание: В идеале, это должно быть короткое путешествие с минимальными внешними раздражителями.
   2. Поместите крысу в покрытом прозрачную пластиковую клетку без постельных принадлежностей (ДхШхВ: 24 см х 14 см х 17 см) с зеркальным назад перед видеокамерой.
   3. Сделайте 10 мин записи поведения животного. Во время записи, убедитесь, что экспериментатор не присутствует в испытательной камере.
   4. Очистите наблюдения клетку до размещения следующего животного.
   5. Убедитесь, что записали поведение анализируется с помощью экспериментатора, который слеп к экспериментальной состоянии крысы.
   6. Сделать запись каждого лица холить эпизоде ​​во время записи 10 мин. Примечание: Лицо уход определяется как образцы движения, в котором передние лапы вступают в контакт с лицевой области.
   7. Сделайте различие между двумя типами поведения лица ухода. Если последовательность не является ни предшествует, ни с последующимТело уход (т.е. уход из области тела, кроме лица), классифицировать эпизод как изолированные лица ухода. Если тело уход осуществляется непосредственно до или после ухода лица, классифицировать как эпизод лица уход во время тела уход.
   8. Определить количество эпизодов груминга лицо.
      1. Классифицировать период времени между лицом уход действий, которые не превышают 4 сек в качестве внутри эпизод пространстве (то есть, пауза между лицом уход действий в пределах одного эпизода).
      2. Классифицировать период времени между лицом действий, которые стрижка превышает 4 сек в качестве между эпизод пространстве (т.е., полное прерывание лица уход действий между двумя эпизодами).
6. Механическая стимуляция тестирование
   1. Транспорт крыс в группах до 6 животных из колонии в испытательной камере в закрытом клетку с постельными принадлежностями. Убедитесь, что это короткое путешествие с минимальными внешними раздражителями.
   2. ПоместитеКрыс по отдельности в прозрачные пластиковые клетки с постельные принадлежности (ДхШхВ: 24 см х 14 см х 17 см) с шарнирной крышкой, так что она может быть легко открыта и закрыта.
   3. Используйте градуированное серию из пяти волосков фон Фрея. Примечание: сила, необходимая, чтобы согнуть волосков 0,015 г, 0,127 г, 0,217 г, 0,745 г и 2.150 г.
   4. Приучают крыс на смотровую клетке и идущие движения в течение 10 мин. Каждые 30 сек, открыть крышку и осторожно касаться стенки клетки с пластиковым стержнем.
   5. Когда животное находится в сниффинга / нет состояние локомоторного (то есть, с четыре лапы находится на земле, ни перемещение, ни замораживание, но экспонирование перехвата поведение), применить первый волосы фон Фрея на территории иона вблизи центра vibrissal площадки на волосистой коже, окружающей mystacial вибриссы.
   6. Оценка ответа животного к стимуляции принадлежать к одной из следующих категорий реагирования ^4.
      1. Классифицировать полное отсутствие реакции каксчетом 0.
      2. Классифицировать обнаружение стимула (т.е. крыса поворачивает голову в сторону объекта стимулирующего и объект стимулом затем исследовали), а счетом 1.
      3. Классифицировать реакцию на снятие (т.е.., Крыса поворачивает голову медленно прочь или тянет его быстро назад, когда стимуляция применяется, иногда одного лица протрите ипсилатеральная в вынужденном области происходит), а оценка 2.
      4. Классифицировать в / ответ атаки побег (т.е.., Крыса избегает контактов с объектом стимулирования, или пассивно, перемещая свое тело от стимулирующего объекта, чтобы принять Крадущийся позиции против клетки стены, или активно атакуя объект стимул, делая кусаться и хватать движений), а счетом 3.
      5. Классифицировать асимметричный лицо холить (т.е. крыса показывает непрерывный ряд, по крайней мере трех лицом мытья ударов, направленных на вынужденном лицевой области) в качестве счетом 4.
      6. Внутри каждого животного, применяются stimuЛи в порядке возрастания интенсивности. После интенсивности стимула была применена к одной стороне, применять его на другую сторону, прежде чем перейти к следующему интенсивности стимула. Случайный порядок, в котором ипсилатеральные и контралатеральные стороны стимулировали. Обратите внимание, что животное должно быть в нюхают / нет государства двигательного перед каждым стимуляции.

Результаты

Ион-CCI крысы показывают сильную послеоперационную увеличение количества времени, потраченного на изолированных лицо стрижка (рисунок 1). В увеличение пика в конце первого послеоперационного недели, а затем снижается в течение следующих недель. Недавние исследования показали,...

Обсуждение

Наиболее интересным аспектом модели ионно-ТПП является то, что она предоставляет уникальную меру спонтанного, не вызывал (нейропатической боли). Большинство исследований на животных нейропатической боли, используя позвоночника нервные модели, исключительно обратиться nocifensive поведен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut	Dynek	CG504
Nembutal  (pentobarbital)	Pharmacy
Atropine	Pharmacy
Clippers for small animals - Favorita II	Aesculap	GT104
Stereotaxic instrument	Stoelting	51600
Ophthalmic ointment (Liposic)	Pharmacy
Homeothermic monitor system	Harvard Apparatus	PY8 50-7221-F
Cotton applicator	Pharmacy
Precision cotton swab	Qosina	10225
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Polyester sutures - Mersilene (4-0)	Ethicon	R871H
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011