JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Abstract

תאי גזע עצביים (NSCs) באזור subventricular של החדרים לרוחב (SVZ) לקיים neurogenesis חוש הריח לאורך כל חיים במוח של היונקים. הם ברציפות לייצר תאי מעבר הגברה (TACs) וneuroblasts שלהתמיין נוירונים ברגע שהם לשלב נורות חוש הריח. תא הניאון מתעורר מיון פעיל טכניקות (FACS) אפשרו את הבידוד של NSCs כמו גם צאצאיהם והחלו לשפוך אור על רשתות רגולציה גן בנישות עצביות מבוגרות. אנו מדווחים כאן טכניקת מיון תא שמאפשרת לעקוב ולהבחין דינמיקת מחזור התא של אוכלוסיות תאים הנ"ל מSVZ המבוגר עם לקס / EGFR / הכתמה משולשת CD24. לאחר מכן תאים מבודדים הם מצופים כמו תאים חסיד לחקור בפרטי התקדמות מחזור התא שלהם על ידי מיקרוסקופ וידאו הזמן לשגות. לשם כך, אנו משתמשים בעכברים מהונדסים מחוון סלולארי מחזור הקרינה Ubiquitination (FUCCI) שבו תאים אדומים-ניאון דוריןG G שלב 1 בשל כתב אדום-Cdt1 ספציפי G 1. שיטה זו חשפה לאחרונה כי NSCs מתרבים בהדרגה להאריך שלב G 1 במהלך הזדקנות, שהוביל לירידת ערך neurogenesis. שיטה זו היא בקלות transposable למערכות אחרות ויכולה להיות עניין רב ללימוד דינמיקת מחזור התא של תאי מוח בהקשר של פתולוגיות מוח.

Introduction

תאי גזע עצביים רגיעה (NSCs) הם המקור לneurogenesis מבוגרת 1 ויכולים להמיר שגשוגם "מופעל" צורה המבטאת את EGFR (aNSCs) 2. לאחר הפעלה, הם להצמיח תאי מעבר הגברה (TACs) 3 ולאחר מכן neuroblasts שנודדים לנורות חוש הריח (OB) דרך צינור של האסטרוציטים ולבסוף להתמיין נוירונים 4,5. NSCs וצאצאיהם מאורגנים ב" נישות "מיוחדות ארכיטקטורות לאורך החדרים לרוחב, לסבך את מספר עצום של גורמי שליטה התפשטותם 6. הבידוד והטיהור של תאים עצביים SVZ יש צורך להאיר את הרגולציה המולקולרית המורכבת של ההפצה שלהם, אבל נשאר אתגר במשך זמן רב בשל חוסר סמנים ספציפיים וטכניקות מותאמות.

גישות חדשות באמצעות cytometry זרימה שניתנו אפשריות הבידוד של NSCs וtheiצאצאי r מהמבוגרים SVZ 2,7-11. באמצעות סמן תאי גזע 12 LEX יחד עם CD24 neuroblast סמן 13 וEGF הקרינה לתייג EGFR בתאים מתרבים 2, לאחרונה פיתחו אסטרטגית FACS מאפשרת הטיהור של חמש מהאוכלוסיות העצביות SVZ העיקריות: שקטה והופעלה NSCs, TACs, neuroblasts לא בוגר כמו גם הנודד 9. כאן אנו מתארים בפרטי תא זה מיון טכניקה ואיך לקס / EGFR / הכתמה משולשת CD24 אפשרה בפעם הראשונה את הבידוד של שני NSCs שקט והופעל.

למרות neurogenesis נמשכת בבגרות, הייצור של תאי עצב חדשים הוא ירד באופן דרסטי במוח המזדקן 14. רוב המחקרים מסכימים על ירידה הדרגתית במספר מתרבים תאים בSGZ וSVZ 15-20. ההשלכות הן לא תמימות כמו הירידה הקשורות לגיל בהנוירוגנזה בSVZ מעוררת הפחתה של nנוירונים ewborn בנורות חוש הריח של המוח בגיל, סופו של דבר מוביל לירידת ערך באפליה חוש הריח בעכברים בגיל 18. הבהרת קינטיקה מחזור התא של אבות עצביים היא צעד מפתח להבנת מנגנוני ההתפתחות של neurogenesis למבוגרים במהלך הזדקנות. מחקרים שנעשו לאחרונה חקרו את מחזור התא והתקדמות שושלת של תאי גזע עצביים מבוגרים במבחנה 21 וin vivo 22 אבל אף אחד מהם ניצל טכניקות תא מיון ובדיקות מחזור תא ניאון מקודדים גנטיים כדי להמחיש את שלבי מחזור התא של תאים מבודדים ברמת תא בודד.

כאן אנו מתארים פרוטוקול שמנצל את העכברים מהונדסים FUCCI שבו תאים הם פלורסנט במהלך מחזור התא שלהם, המאפשר ההבחנה בין G 1 וSG 2 / M שלבים 23. פרוטוקול זה מראה כיצד בידוד פוטנציאלי של NSCs וצאצאיהם ממבוגרי FUCCI מילCE בשילוב עם מיקרוסקופ וידאו הזמן לשגות מאפשר המחקר של דינמיקת מחזור התא ברמת תא בודד.

Protocol

פרוטוקול זה תוכנן בעמידה בקהילות האירופיות הנחיית המועצה של 24 נובמבר 1986 (86/609 / EEC) ואושר על ידי הוועדה (CETEA-CEA DSV צה"ל) המוסדית שלנו לרווחת בעלי החיים.

1. התקנה בסיסית לפני התרבות וVideomicroscopy

  1. להשתמש בצלחות זכוכית תחתונה תרבות או μ-צלחות למיקרוסקופיה וידאו confocal. 1 - 5 x 10 3 תאים / טוב, להשתמש 96-גם צלחות וצלחות 24 גם ליותר מ 5 x 10 3 תאים / טוב.
  2. לפחות יום אחד לפני תחילת הניסוי, להכין פולי-D ליזין סטרילית (PDL) צלחות מצופים לתרבויות monolayer חסיד. הוסף מספיק PDL (10 מיקרוגרם / מיליליטר בdH2O) למעייל תחתית כל היטב דגירה O / N על 37 מעלות צלזיוס. הסר את פתרון PDL ולשטוף שלוש פעמים עם DH 2 O לפני שהוא מאפשר את הצלחת לייבוש במכסת המנוע בלפחות 2 שעות תחת זרימה למינרית. אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, לאחסן את הצלחת המצופה ב-20 ° C.
  3. להכין מדיום התרבות ידי ערבוב המל"ל בסל בינוני ומוסף NSC הפצת נשק ב9: 1 (ראה טבלת חומר) יחד עם 2 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, 20 ng / ml גורם אנושי מטוהר צמיחת אפידרמיס רקומביננטי (EGF), ו- 10 ng / ml גורם אנושי רקומביננטי צמיחת פיברובלסטים 2 (FGF-2). לחמם את מדיום התרבות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים לפני השימוש.
  4. לניתוק SVZ, להכין פתרון פפאין: 1 מ"ג / מיליליטר פפאין (15 UI / ml) במאזן מלח הפתרון של ארל (EBSS) המכיל 0.2 מ"ג / L-ציסטאין מיליליטר, 0.2 מ"ג / מיליליטר EDTA, ו0.01 מ"ג / מיליליטר DNase אני בPBS. לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. לאזן את הפתרון על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  5. כדי לעצור את התגובה האנזימטית, להכין פתרון מעכבי פרוטאז (Ovomucoid): בינוני F12 המכיל 0.7 מ"ג / מיליליטר סוג מעכבי טריפסין השני: DMEM. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
  6. הכן PBS 0.6% פתרון גלוקוז כדי לאסוף את המוח וPBS 0.15% BSA שלolution לשלבי כביסה ומכתים נוגדן.
  7. להכין את כלים לנתיחה: מספריים, לנתח וקשירת מלקחיים, אזמל. משרים אותם באתנול 70%.

2. המוח וMicrodissections SVZ הקציר של עכבר למבוגרים

  1. מבוגרים הקרבת עכברי FUCCI 23 (2 עד 3 בן חודש ו / או 12 בן חודש להזדקנות מחקרים) ביצוע נקע בצוואר הרחם בהתאם להנחיות מוסדיות המתאימות.
  2. לרסס את העכבר באמצעות אתנול 70% וחתך את הראש באמצעות מספריים חדים.
  3. עושה חתך לאורך הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
  4. לבצע חתך קו האמצע אורך מתחיל בבסיס הגולגולת לנורות חוש הריח באמצעות מספריים קטנים. ודא כדי למנוע נזק למוח הבסיסי עם להבי המספריים. הסר את החלק העליון הפתוח של הגולגולת עם מלקחיים מעוקלים כדי לחשוף את המוח.
  5. לאסוף את המוח בצלחת פטרי 15 מ"מ המכילה גלוקוז 0.6% ב- PBS.
  6. Dissect משם נורות חוש הריח. מניחים את המוח על פני השטח הגב שלה ולהפוך את סעיף העטרה דרך התצלובת הראייה באמצעות אזמל.
  7. תחת מיקרוסקופ לנתח, מקם את החלק מקורי של סעיף המוח עם משטח העטרה החתך כלפי מעלה לכיוון הניסוי.
  8. לנתח את SVZ, להסיר את המחיצה עם מלקחיים מעוקלים בסדר לאחר מכן הכנס קצה אחד של מלקחיים עדינים לסטריאטום מייד בסמוך לחדר ולנתק SVZ מן הרקמה הסובבת. לפרטים נוספים, עיינו בet al אזרי. 24. מניחים את SVZ גזור לתוך צלחת פטרי המכילה 1 מיליליטר של PBS-0.6% גלוקוז.

3. דיסוציאציה רקמות SVZ

  1. ברר SVZ גזור בצלחת פטרי עד שלא יישארו חתיכות גדולות.
  2. העברת הרקמה הטחון יחד עם גלוקוז% PBS-0.6 לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות.
  3. בטל supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של פפאין מראש חימם (1מ"ג / מיליליטר, מוכן בשלב 1.4) בתוספת 0.01 מ"ג / מיליליטר DNase I. דגירה של 10 דקות באמבט מים ב 37 ° C. להשתמש 1 מיליליטר של פפאין לכל עכבר.
  4. צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות וזורקים supernatant.
  5. הוסף 1 מיליליטר של טרום חימם ovomucoid (0.7 מ"ג / מיליליטר, מוכן בשלב 1.5) כדי להפסיק את פעילות פפאין. מכאני לנתק את הרקמה הטחון נוסף להשעית תא בודד על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 20 פעמים באמצעות קצה micropipette P1000. למנוע בועות אוויר.
  6. להעביר את ההשעיה התא דרך מסנן 20 מיקרומטר סטרילי בצינור 15 מיליליטר חדש. הקפד לשטוף את מסנן התא עם BSA 0.15% PBS כדי למנוע אובדן של תאים.
  7. צנטריפוגה XG 200 עבור 10 דקות וזורקים supernatant. מחדש להשעות את התאים של PBS 100 μl מכיל BSA 0.15%.

מכתים Immunofluorescent 4. למיון תא

למיון תא באמצעות FUCCI-האדום עכברים (איור 2 א), להשתמש הבאנוגדנים: המצומד Phycoerythrin-cyanine7 CD24 [PC7]; CD15 / isothiocyanate לקס והעמסת [FITC] מצומדות ויגנד EGF מצומדות Ax647.

הערה: לקס + EGFR תאים + וEGFR + תאים אינם שופעים בSVZ המבוגר: ≈ 600 ו 1500 תאים / עכבר בהתאמה 9. אנו ממליצים איגום תאי SVZ 2-3 עכברים יש מספיק חומר. לא עובד עם יותר מ 12 עכברים באותו היום, כך שמשך מיון התא אינו עולה על 3 שעות. זכור כי עובד עם עכברים רבים מדי באותו היום יוביל לתקופת מיון תא מוגברת אולי גורמת למוות של תאים מוגברים ו / או התמיינות תאים.

  1. לבצע צביעת FACS בשל BSA 0.15% PBS לכל עכבר (או ב200 μl לקבוצה של 2 עד 3 עכברי מכתים אופטימלי) 100 μl.
  2. הכן את צינורות שליטה. השתמש בחרוזי פיצוי להכין צינורות שליטת צבע אחד על פי היצרן9; של פרוטוקול. בחר חלק קטן של תאים (1/10 של התאים המופקים מעכבר אחד מספיק) ולהפריד אותו ב 4 צינורות להכין 1 צינור שלילי שליטה (תאים לא מסומנים) וקרינה 3 מינוס צינורות שליטה אחד (FMO). Resuspend התאים 200 μl של PBS BSA 0.15% לכל צינור.
    רמז: לשליטה לקס-FITC FMO, לתייג את התאים עם CD24-PC7 (01:50) ויגנד EGF Ax647 מצומדות- (1: 200); לשליטת CD24-PC7 FMO, לתייג את התאים עם CD15 / יגנד LEX-FITC (01:50) וAx647 מצומדות- EGF (1: 200) ולAx647 מצומדות- שליטת FMO יגנד EGF, לתייג את התאים עם CD15 / LeX- FITC (01:50) וCD24-PC7 (01:50).
  3. לצינורות המשמשים למיון תא, להשתמש בנוגדנים הבאים בדילול שצוין בPBS BSA 0.15%: CD24-PC7 (01:50), CD15 / LEX-FITC (01:50) ויגנד EGF Ax647 מצומדות- (1: 200).
  4. דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך. לשטוף עם 1 מיליליטר PBS BSA 0.15% ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 10 דקות. Resuspend התאים 20081; L של PBS BSA 0.15% למוח. שמור את צינורות מיון תא על קרח ולהמשיך מייד למיון התא.
  5. אם באמצעות עכברי FUCCI-ירוקים, שברי LEX-חיוביים ולקס-שליליים נפרדים באמצעות עמודות הפרדה לפני מיון תא כמניות נוגדן לקס-FITC אותו גל הפליטה מקרינת FUCCI-הירוקה (איור 3 א ', ב').
    1. ראשית, לתייג את התאים עם לקס-נוגדן עכבר אנטי אנושי (01:50) במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס בחושך בשל BSA 0.15% PBS 100 μl.
    2. לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר PBS BSA 0.15% ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 10 דקות, ואז לתייג את התאים עם microbeads אנטי עכבר IgM (01:10) במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
    3. לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר PBS BSA 0.15% ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 10 דקות. Resuspend התאים 500 BSA 0.15% μl PBS ויוצקים את התאים באמצעות עמודת הפרדה בשדה מגנטי כschematized באיור 3 ג. לשטוף את העמודה עם PBS 1 מיליליטר 0.15% BSA לקבל חלק שלילי לקס.
    4. כדי להשיג שבריר LEX-חיובי, להסיר את עמודת ההפרדה מהשדה המגנטי וelute את התאים עם 2 מיליליטר BSA 0.15% PBS.
    5. המשך צביעת יגנד EGF CD24-PC7 וAx647 מצומדות- כפי שצוין ב4.2.

5. מיון תא

הערה: תאים מוינו על סדרן FACS ב 40 PSI עם noozle 86 מיקרומטר. הקרינה נאספה באמצעות הקבוצה הבאה המסנן: 520 / 35nm, 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) (FITC) ו740LP (PC7). פיצוי הוא הכרחי כדי למנוע אותות חיוביים שגויים כמו חפיפה נמצאת בין ספקטרום הפליטה של ​​הקרינה FUCCI-האדומה וצבע PC7.

  1. בסמוך למועד מיון תא, להוסיף צבע חיוני להפלות בשידור חי מהתאים מתים. השתמשנו HO (ראה טבלת חומרים) ב2 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי. הפעל את הצינור השלילי שליטה (תאים לא מסומנים) באמצעות סדרן FACS וה בחרתאי דואר באמצעות צד פיזור (SSC) ופרמטרי פיזור קדימה (FSC) (איור 1 א).
    הערה: תאים מתים הוצאו על ידי gating רק חלק HO-שלילי (איור 1 א ') ולאחר מכן כפילויות הוצאו על ידי בחירת דופק החלק השלילי רוחב (איור 1 א' ').
  2. הפעל את בקרת צבע אחד מוכנה בשלב 4.2 ולהתאים את הצינור מכפיל (PMT) מתחים במידת צורך (תאי אוכלוסייה שלילית כלומר גבוהים מדי ו / או חיוביים את קנה מידה). בצע פיצוי צבע בחלון הפיצוי של התוכנה.
  3. הפעלת FMO שולט מוכן בשלב 4.2 (שליטת LEX-FITC FMO, CD24-PC7 שליטה ובקרת FMO FMO יגנד EGF Ax647 מצומדות-) ולצייר את שערי מיון (איור 1). מיין התאים ישירות לתוך של מדיום תרבות 100 μl 1.5 microtubes מיליליטר.

6. הכנת התאים מיקרוסקופים

  1. צלחת התא הטרי מסודריםים בצפיפות של 1 - 3 x 10 3 תאים / גם בפולי-D-Lysine- מצופה μ-פלייט 96 היטב עם 300 μl של מדיום התרבות.
  2. לפני מיקרוסקופיה וידאו, דגירה צלחות התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפחות לשעה 1 כדי לאפשר הידבקות תא.

התקנת 7. מיקרוסקופים ורכישת תמונה

  1. לבצע הדמיה חיה באמצעות מטרת התכנית Apo VC 20x דסק"ש (NA: 0.75) על מערכת מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר המצורפת הפוך קאמרי thermostated על 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 אווירה.
  2. מקם את μ-פלייט 96 היטב בתוך חדר thermostated מראש התחמם equilibrated ולהחליף את המכסה על ידי כיסוי thermostated.
  3. פתח את תוכנת ש"ח-אלמנטים ולחץ בשורת תפריטים על "רכישה / רכישת השליטה / ND רכישה" כדי לבחור את האפשרויות של הזמן לשגות (אורך, עמדות שלב, Z-סעיפי confocal, ...), "רוכשת את בקרות רכישה / / Pad Ti221; כדי לבחור את היעדים ו" רוכשים / פקדי רכישה / A1plus הגדרות "כדי לבחור את רמת PMT לכל הקרינה בשורת התפריטים. בחר תיקייה לשמור את קבצי נתונים.
  4. שימוש בחלון רכישת ND, להגדיר את המרכז של כל גם עמדת שלב ובחר באפשרות התמונה הגדולה עד 7 x 7 מ"מ ². זה יהיה ליצור תמונת פסיפס סביב המרכז של כל אחד. הגדר את החפיפה לתמונת פסיפס הגדולה עד 5%. צלם תמונות בכל 20 דקות במשך 24 שעות. בחר את מטרת התכנית Apo VC 20x דסק"ש (NA: 0.75) בחלון Ti Pad.
  5. בחלון הגדרות A1plus, לרכוש תמונות באמצעות סורק תהודה במהירות גבוהה בפורמט 512 x 512 פיקסלים ברזולוציה של 1.26 מיקרומטר / פיקסל. השתמש brightfield לדמיין צורות תא. במקרה של עכברי FUCCI-אדומים, לרגש הקרינה אדומה ב561 ננומטר ולאסוף באמצעות 595/50 ננומטר מסנן. במקרה של עכברי FUCCI-ירוקים, לרגש הקרינה ירוקה ב 488 ננומטר ולאסוף באמצעות 530/40 ננומטר מסנן. לקבוע PM האופטימלירמת T, קיזוז וכוח לייזר לכל אורך גל.
    הערה: אנו ממליצים על שימוש בפונקציה האוטומטי לערוץ brightfield כדי לאפשר לתוכנה לפוקוס אוטומטית בכל עמדת שלב לפני כל רכישה. רמז: מטרת התכנית Apo VC 20x דסק"ש (NA: 0.75) שימש לרזולוציה המעולה שלה ללא צורך בשמן. מטרות נוספות ניתן להשתמש בהתאם לרזולוציה האופטית הרצויה.
  6. בחר בלחצן 'הפעל כעת' בחלון רכישת ND להתחיל רכישה.
    רמז: בצע את העבודה במחשב ללולאה 1 כדי להיות בטוח בכל מה שעובד כמו שצריך.

8. עיבוד תמונה וניתוח

  1. לנתח את הנתונים ישירות על תוכנת ש"ח אלמנטים-ידי מעקב התאים בנפרד. רמז: כדי להרוויח זמן, לשמור כל עמדה ב.אבי פורמט באמצעות תוכנת ש"ח-אלמנטים ולנתח את הסרטים עם ImageJ.
  2. בתוכנת ImageJ, לעקוב אחר תאים בודדים עוברים לפחות 2 חטיבות (תא אחד כלומר למושבה ארבעה תאים). לחתוך אזור קטן סביב התא ובחר "תמונה / כפול".
  3. בחירה 'תמונה / ערימות / הפוך Montage "בשורת תפריטים כדי להפוך את מונטאז'. ציין את המסגרות להיכלל, בגודל של התמונות ולשמור את מונטאז 'כקובץ tif לרזולוציה אופטימלית.
  4. כדי לחשב את אורך השלב הראשון SG 2 / M (איור 2 ג, ד), בחר תא בודד אדום ניאון (ב 1 G) ולאחר מכן להגדיר t = 0 (שלב S יתחיל פעם אחת האדומה-הקרינה מכבה). לספור את מספר המסגרות עד תא מחלק להעריך את אורך SG 2 / M.
    הערה: בפעם המחושבת תלויה במרווח הזמן בין כל מסגרת.
  5. כדי לחשב את שלב G1 הבא (איור 2 ג, ד), תמשיך לעקוב אחר התא שרק חלוק. אם התא מתחלק נכנס שלב G1, לא תהיה הצטברות של חלבון אדום-ניאון cdt1. לחשב את מספר המסגרות עד אדום-הקרינה מכבה אגאלכל תא.
    רמז: בתחילת 1 G הקרינה האדומה עשויה להיות חלשה כל כך לבחור את תחילתו של השלב G 1 על המסגרת שבי התא חילק להימנע קירובים.

תוצאות

היכולת להבחין באופן מהימן בין אוכלוסיות תאים השונות של שושלת תאי גזע SVZ העכבר הבוגר היא קדמונית לחקור תכונות הפונקציונליות שלהם. לשם כך, פיתחנו לקס / EGFR / אסטרטגיה משולש תיוג CD24 המאפשרת הטיהור של אוכלוסיות תאים ספציפיות מSVZ המבוגר: NSCs שקט (בהיר לקס), NSCs מופעל (LEX + EGFR +), TACs (+ EGFR) , Neuroblasts בוגר והנודד (CD24 + + EGFR וCD24 +, בהתאמה) 9 (איור 1). מוחל על עכברים הטרנסגניים FUCCI, מיון התא טכניקה מאפשר ההדמיה החיה של שלבי מחזור התא של האוכלוסיות העצביות השונות ברמת התא הבודד 25. עכברי FUCCI-אדומים שמשו למעקב השלב G 1 עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו באמצעות הקרינה אדומה (איור 2 א). תאי נג FUCCI-אדומים מייצגים את התאים בS-G 2 / M שלבים של מחזור התא, תאי קופה FUCCI-אדומים הם תאי G 1 ותאים בהירים FUCCI-אדומים הם תאי יציאה או ממחזור התא (איור 2) 23,26. לקס + + EGFR וEGFR + תאים ממבוגרים צעירים (איור 2 ג) ועכברים בגיל העמידה (איור 2 ד) היו מצופים כתאים חסיד על צלחות תרבות מצופים פולי-D ליזין. שלב SG 2 / M הראשון זוהה בתאים בודדים פעם אחת את הקרינה האדומה מכבה עד שהתא מתחלק. כפי שנצפה בעבר SG אורך שלב 2 / M לא הראה שום הבדל בין לקס + + EGFR וEGFR + תאים, או בעכברים צעירים או בגיל העמידה. אז חישבנו את אורך שלב G 1 הבא מהליגה הראשונה עד הקרינה האדומה מכבה. מעניין לציין, התארכות שלב G 1 נמצאה במהלך ההזדקנות בקס + EGFR אך לא תאים +בEGFR + תאים 25 (איור 2 ג, ד). כתוצאה מכך, neurospheres השיג 5 ימים לאחר ציפוי הם קטנים יותר בתאי קס + EGFR + התקבלו מעכברים בגילים כפי שמוצג באיור 2E.

גם עכברים-ירוקים FUCCI יכולים לשמש כדי לחזות SG שלב 2 / M עם הקרינה ירוקה (איור 3 א ', ב'), אבל תאים צריכים להיות מראש מסודרים באמצעות עמודות הפרדה כנוגדן לקס-FITC משותף אותו גל הפליטה מFUCCI- הקרינה ירוקה (איור 3 ג). דוגמא לקרינת FUCCI-ירוקה לSG הראשון שלב 2 / M של מבוגרים צעירים לקס + EGFR + ותאי EGFR + מוצגת באיור 3D.

figure-results-2488
איור 1:. אסטרטגיה של תא בחירה על ידי FACS תאים (א) היו ראשון שנבחרו על פי tמורפולוגיה יורש באמצעות פיזור בצד (SSC) לעומת פיזור קדימה פרמטרים (FSC). לפרטים נוספים על בחירת שער מורפולוגיה, מתייחס לDaynac et al. 9 (א ') תאים מתים תויגו באמצעות סמן HO ולא נכללו בבחירה. (' ') כפילויות הוצאו באמצעות פרמטר רוחב דופק. כדי להגדיר את השערים, הקרינה מיון מינוס אחד (FMO) שולט לCD24-PC7 (LEX-FITC / FUCCI-אדום / EGF-Ax647 תיוג; B) ולקס-FITC (FUCCI-אדום / EGF-Ax647 / CD24 תיוג -PC7; ב ') שימש (C, C. ") ואז, שערי מיון נקבעו בקס-FITC / FUCCI-אדום צינורות שכותרתו / EGF-Ax647 / CD24-PC7 יחד עם בקרות FMO. האחוזים הממוצעים של תאים כולל מיוצגים בשערי. אם בחירת CD24 + תאים (neuroblasts), להיזהר שלא לכלול תאים לבטא בהירים CD24 מהשער. ואכן, המתאים בהיר CD24 לספירת ependymalLLS 2,9. ג 'מייצג את התאים השליליים CD24 (ריבוע שחור בC). רק לקס + + EGFR וEGFR + (ג ') שערי מיון שמשו למחקר זה.

figure-results-3779
איור 2: ניתוחים בשידור חי של מחזור תא באמצעות עכברי FUCCI-אדומים ייצוג סכמטי של מחזור תא FUCCI-האדום שבו תאים אדומים-ניאון בשלב G1 וחסר צבע בSG 2 / M שלבים 23 ייצוג (B) FACS של (א).. הקרינה FUCCI-אדומה על תאי SVZ. (C, D) מיקרוסקופיה וידאו עם לקס + + EGFR וEGFR + תאים ממוינים מצעיר (C) וגיל העמידה (ד) עכברים FUCCI-אדומים מאפשרת המעקב של השלב G 1 עם הקרינה אדומה ואילו SG ניתן להסיק 2 / M שלבים when הקרינה האדומה מכבה. תמונות רצופות מוצגות בקנה מידת זמן שהוצג בD. (E) נציג תמונות של מושבות (neurospheres) השיגו 5 ימים לאחר ציפוי. בר סולם:. 10 מיקרומטר (C, D), 30μm (E) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4851
איור 3:.. אסטרטגיה לניתוחים חיים של מחזור תא באמצעות עכברים FUCCI-ירוקים ייצוג סכמטי של מחזור תא FUCCI-הירוק שבו תאים ירוקים בSG 2 / M שלב וחסר צבע בשלב G 1 23 (א) ייצוג FACS (ב) של הקרינה FUCCI-ירוקה: תאי נג FUCCI-ירוקים מייצגים את התאים בשלב G 1 של מחזור התא ואילו FUCCI-Green תאי קופה הם תאים בSG 2 / M 23. (ג) על מנת לעקוב אחרי SG הירוק-ניאון 2 / M שלבים של לקס + EGFR + ותאי EGFR +, תאי SVZ היו צריכים מראש מסודרים עם עמודות הפרדה. תאים תויגו עם אנטי עכבר נוגדן לקס ולקס + חלק נשמרו על העמודה באמצעות microbeads אנטי עכבר (ראה פרוטוקול 4.). ואז, לקס + ולקס - שברים היו eluted ושכותרתו עם EGF-Ax647 ונוגדני CD24-PC7 למיון FACS (ד ') במיקרוסקופ וידאו של לקס + + EGFR וEGFR + תאים ממוינים מעכברי FUCCI-ירוקים צעירים מאפשר המעקב של. SG 2 / M שלבים עם הקרינה ירוקה. תמונות רצופות מוצגות בקנה מידת זמן שהוצג בD. בר סולם: 10 מיקרומטר (ד).

Discussion

טכניקת מיון התא המתוארת במסמך זה מאפשרת אפליה בין NSCs אמין השקטים, NSCs מופעל ומחקרי הצאצאים מאפשרים של הנכסים שלהם ואת הדינמיקה במוח הבוגר 9. בשילוב עם טכנולוגית FUCCI המאפשר ההדמיה של התקדמות מחזור התא בתאים חיים 23, שפתחנו טכניקה מהירה ויעילה למעקב G 1 וSG 2 / M השלבים של מחזור התא ממבוגרים צעירים ותאי מוח עכבר גילאים.

טכניקת תא מיון שימוש בפרוטוקול זה הייתה שילוב תוקף הראשון של סמנים המאפשרים טיהור של חמש האוכלוסיות עצביות העיקריות מSVZ 9. זה היה גם הטכניקה הראשונה תוקף מאפשרת את ההבחנה של NSCs שקט והופעל. ראוי לציין כי טכניקה זו אינה דורשת שימוש בעכברים מהונדסים כשלעצמה, אשר הוא הכרחי כאשר מותאם לדגמי עכבר מהונדסים suפרק כFUCCI. מאז, קודגה et al. 10 השתמשו שילוב תיוג משולש GFAP-GFP / CD133 / EGFR להבחין NSCs שקט מעמיתו הופעל אבל זה לא יכול להיות מותאם לטכנולוגית FUCCI כפי שהוא דורש שימוש בעכברים מהונדסים GFAP-GFP. מישיגן et al. 11 פיתחו / EGFR / אסטרטגית Glast CD24 משולשת תיוג שמחולקת תוצאות משותפות עם הטכניקה המשמשת במחקר זה 9. ואכן, מתאם גבוה בין לקס וסמני Glast NSCs כבר נצפה באל Daynac et. ללמוד 9. עם זאת, נוגדני Glast משמשים במישיגן et al. הטכניקה הוא מצמידים את Phycoerythrin ולכן לא יכולים להיות מותאמים לשימוש בעכברים FUCCI-אדומים.

יש כמה נקודות טכניות חשובות שדורשות תשומת לב לפני מיון תאי SVZ. ראשית, צעד הניתוק הוא מאוד חשוב כמו רקמת המוח יש ניתק לתוך תאים בודדים תוך שמירה על המבנה בטגריטי של החלבונים המשמשים לאסטרטגית תיוג נוגדן. 0.05% טריפסין-EDTA הוכח כיעיל מאוד בdissociating רקמת SVZ 27 אבל אנטיגן לקס נמצא רגיש מאוד שכן כמעט כל immunofluorescence LEX-FITC היה אבוד (מידע לא מוצג). לפיכך, פפאין שימש כזה היה יותר יעיל ופחות הרסני מאשר פרוטאזות אחרת ברקמת המוח. יתר על כן, לא לקס ולא EGFR ולא CD24 הושפע טיפול פפאין. יש לציין כי תיוג הנוגדן שונו אם טיפול פפאין עלה 15 דקות. השגנו תוצאות אופטימליות עם טיפול פפאין 10 דקות הקשורים ניתוק מכאני (פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים).

ציפוי פולי-D-ליזין מאפשר תרבות של תאים חסיד והיווצרות המושבות לאחר מספר ימים בתרבות. עכשיו זה מקובל כי במבחני חוץ גופית מגיע עם המגבלות שלהם 28,29. אנו ממליצים קביעת מחזור התא הראשון רק להתאים עוברים החלוקה לפחות אחד לאחר להישאר קרוב ככל האפשר לin vivo פנוטיפ התא.

ראוי לציין להזכיר כי חלבוני Geminin (הקרינה ירוקה) וCdt1 (הקרינה אדומה) המשמשים לעיצוב מערכת FUCCI 23 הוצגו בעבר לבוא לידי ביטוי בשפע על ידי אבות עצביים במהלך הנוירוגנזה מוקדמת בעכברים 30 וברקמות מוח בוגר 9,25 . למרות מבנה mKO2-hCdt1 (30/120) היה בעיקר בשימוש במחקר הנוכחי לעקוב שלב G1 עם הקרינה אדומה, השימוש בשני המבנים [mKO2-hCdt1 (30/120) וMAG-hGem (1/110) ] יכול להיות שחזה כדי לאפשר ההדמיה של השלבים העיקריים של מחזור התא (1 G וSG 2 / M), כמו גם את המעבר / S G 1 23. החסרון העיקרי של ההדמיה כפול הצבע הוא הסטים תואמים המוגבלים של הקרינה שעדיין יכול לשמש לתיוג התא. פתרון אחד הוא להשתמש separatiעל עמודים. לדוגמא, יש לנו בהצלחה מדולדלת חלק CD24 חיובי מהתאים באמצעות עמודות הפרדה לפני תא מיון ולחיות הדמיה כפי שנהגנו נוגדן CD24-PE שחלק את אותו אורך גל הפליטה מקרינת FUCCI-האדומה 25.

מחקרים מעטים בחנו את אורך מחזור התא של אוכלוסיות SVZ העכבר מבוגרות. אורך מחזור התא הכולל שהושג עם הטכניקה שלנו הוא קרוב לאחד מוערך במבחנה על ידי קוסטה et al. 21, אבל הצלחנו בפעם הראשונה להבחין שלבי מחזור התא השונים. במחקר in vivo, פונטי et al. 22 השתמש בשילוב של תחליפי תימידין כדי לקבוע את דינמיקת ההתפשטות של אוכלוסיות תאי SVZ השונות. עם זאת, הם יכולים גם לבצע ניטור רציף של מחזור התא ולא לעקוב אחר התאים ברמת התא הבודד. זה יכול להיות נושא כפי שהראה כי ההטרוגניות חזקה קיימת שנינותהין אוכלוסיית תאי SVZ נתון 22,25. אנו מתארים כאן חלופיים בטכניקת מבחנה, קל להתקנה, המאפשר ההדמיה החיה של שלבי מחזור התא של אוכלוסיות עצביות מבוגרות שונה ברמת תא בודד.

הבנת הרגולציה של מחזור התא של תאי גזע עצביים ואת אבות עדיין מהווה אתגר לפיתוח גישות טיפוליות חדשות בהקשר של פתולוגיות הזדקנות או מוח. כך הפרוטוקול שלנו יכול להיות מגוון רחב של יישומים. בהקשר של הזדקנות, טכניקה זו יכולה להיות יעילה גם כדי להבין את ההשפעות של הזדקנות על בידול NSCs. ואכן, ניתן לזהות תאי גזע / עצביים נכנסו בידול כעוצמת הניאון האדום שלהם היא במובהק גבוהה יותר 26. לבסוף, זה יכול להיות גם עניין לנצל את ההדמיה לחיות רציפה ברמת תא בודד ללמוד תהליכים פנימיים וחיצוניים התא אחראים לפרו השושלתgression של NSCs המבוגר.

Disclosures

The authors declare that they have no conflict of interest.

Acknowledgements

אנחנו אסירי תודה ל- C ז'ובר, V נוויל, V Barroca, J טיליאט וכל צוות של מתקני בעלי חיים; לJ Baijer וN Dechamps למיון תא; O. אטיין לקבלת סיוע טכני, וא Gouret לסיועה המנהלי. Cytometry זרימה ומיון תא בוצעה בiRCM cytometry הזרימה המשותפת למשאב, שהוקמה על ידי מענקי ציוד מDIM-גזע-קוטב, INSERM, Fondation ARC, וCEA. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של חברת חשמל הצרפתי (EDF). יש MD מלגה מLa הליגה העל Contre le הסרטן וLM מאזור איל-דה-פראנס (DIM Biothérapies). מארק-אנדרה Mouthon ופרנסואה ד Boussin מחבר מניות שותף בכיר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well uncoated glass bottom culture plates MatTek Corp.P96G-1.5-5-F
µ-Plates 96-wellIbidi89626
Poly-D-LysineMilliporeA003E
NeuroCult NSC Basal MediumSTEMCELL Technologies5700
NeuroCult NSC Proliferation Supplement STEMCELL Technologies5701
HeparinSTEMCELL Technologies7980
EGFMilliporeGF144
FGF-2MilliporeGF003
PapainWorthingtonLS003119
EBSSInvitrogen24010-043
L-cysteineSigmaC-7352
0.5M EDTA, pH 8.0PromegaV4231
DNase ISigmaD5025-15KU
Trypsin inhibitor type IISigmaT9128Ovomucoid
DMEM:F12 mediumLife Technologies31330-038
20 µm filter BD Medimachine Filcon340622
Eppendorf microtubes 3810XSigmaZ606340-1000EA
BSASigmaA1595Bovine serum albumin solution
CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7]Life TechnologiesA14776Mouse IgM; clone MMA. 1:50
CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugatedBD Biosciences332778Rat IgG2b; clone M1/69.  1:50
Mouse anti-human LeX antibodyBD Pharmingen559045Mouse IgM; clone MAM.  1:50
Alexa647 - conjugated EGF ligandLife TechnologiesE353511:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text
CompBeadsBD Biosciences644204
MACS LS separation columns Miltenyi Biotec130-042-401separation columns (in the manuscript)
Anti-mouse IgM microbeads Miltenyi Biotec130-047-301
Hoechst 33258Sigma861405HO (in the manuscript)
INFLUX cell sorterBD BiosciencesFACS sorter (in the text)
Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE TiNikon Corp.confocal laser scanning microscope (in the manuscript)
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit softwareNikon Corp.NIS-Elements software (in the manuscript)
Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75)Nikon Corp.
ECLIPSE Ti thermostated chamberNikon Corp.thermostated chamber (in the manuscript)
ImageJRBS
FlowJoTree Star, Ashland, OR
FUCCI miceRIKEN BioResource Center, JAPANSakaue-Sawano et al. 2008

References

  1. Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  2. Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
  3. Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
  4. Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  5. Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
  6. Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
  7. Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
  8. Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
  9. Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
  10. Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
  11. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
  12. Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
  13. Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
  14. Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
  15. Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
  16. Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
  17. Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
  18. Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
  19. Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
  20. Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
  21. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
  22. Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
  23. Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  24. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
  25. Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
  26. Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
  27. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
  28. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  29. Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
  30. Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience103FUCCIFACSsubventricular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved