Microsurgical דגם חדשני לHeterotopic, כמקשה אחת בחזה קיר, קורנית, ולב השתלה בעכברים

Summary

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Abstract

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.^1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

Introduction

Cardiac transplantation is the treatment of choice for end-stage heart failure. Both technical advancements and pharmacological innovations have propelled the field to early graft acceptance rates above 90%.^12,13 Despite this, 60-80% 5-year graft survival is at a standstill and chronic rejection, characterized by transplant vasculopathy, remains inevitable.^14-16 Furthermore, patients are subjected to multiple surgical procedures and lifelong immunosuppression, which are associated with chest wall deformities and medical sequelae and toxicities, respectively. The need for innovative approaches to extend allograft survival, minimize the immunosuppressive requirements, and offer reconstructive options for anatomical deformities is pressing.

Vascularized composite allotransplantation offers a unique strategy for improving heart transplant outcomes both from an immunological aspect as well as a reconstructive perspective.¹⁷ Vascularized composite allografts are also unique in a way that they have an inherent source of donor-derived hematopoietic stem cells which has shown a favorable ability to reduce immunosuppression and induce and sustain mixed chimerism.^1-8 Additionally, co-transplantation of the thymus has shown to prolong survival of both, solid organ transplants and vascularized composite allografts.^2,9-11 Combining these strategies with heart transplantation offers a novel solution to the aforementioned challenges facing heart transplantation.¹⁸

Murine models serve as excellent platforms for mechanistic in vivo investigation because of the availability of antibodies and well-defined inbred and knockout strains.^19-21 Although heart transplantation in mice is commonly studied using a heterotopic intraabdominal microsurgical suture transplant model^22-25, a heterotopic, cervical, non-suture cuff technique model has shown to be extremely replicable, reliable, and carries fewer rates of thrombosis.^19,26,27 The goal of this study is to develop a heterotopic en bloc osteomyocutaneous chest wall, thymus, and heart transplant technique in mice to study the immunological mechanisms of combined solid organ and vascularized composite allotransplantation using a cervical non-suture cuff technique. This cluster allograft is perfused through the anastomosis of the donor descending aorta to the right common carotid artery and the donor pulmonary artery to the right external jugular vein. Preservation of the internal thoracic vessels and associated thymus branches is paramount to perfusing the chest wall (sternum, ribs, muscles, and skin) and thymus.

Protocol

כל הנהלים האופרטיביים הושלמו בעמידה באוניברסיטת ג'ונס הופקינס וארצות הברית מחלקת החקלאות וצריכת שירותי בריאות הציבור. פרוטוקול זה כדלקמן ועדת אוניברסיטת ג'ונס הופקינס טיפול בבעלי חיים ושימוש, לוח הסקירה מוסדי אישר הנחיות (מספר פרוטוקול M013M490). נתוני הישרדות סופיים נרשמו להליכים כירורגיים המתוארים להלן. שני החיות התורם והמקבל יקבלו הרדמה מנע באמצעות עצירות ברמה של 0.1 מ"ג / קילוגרם sc שעה אחת לפני ניתוח ובעצירות החיה נמען מחדש מנוהלות באותו המינון לאחר השתלה מחדש במינון לפי צורך ב -48 השעות הראשונות לאחר ניתוח.

1. תורם שחזור שתל

הערה: בגין חלק התורם של דקות השתלת 40 לפני השתלת הנמען כדי למזער את זמן הרדמה נמען וכדי להקל על שעת סיום בו זמנית או מעט אוזןשעת סיום Lier לעומת הכנת הנמען.

1. משתמש במכשירים סטנדרטיים סטרילי מייקר וכפפות סטריליות להליך. המעבדה שלנו משתמשת עיקור החיטוי של מכשירי מייקרו.
2. להרדים את עכבר התורם (זכר) באמצעות מכשיר אדים אינדוקציה isoflurane ב 4%. קוצץ מכאני atraumatic באמצעות להסיר את השיער מצוואר הרחם, החזה, ואזור בטן. מניחים את החיה במצב שכיבה ולשמור isoflurane על 1-2% בחרטום. ודא הרדמה נאותה לאורך כל ההליך על ידי מעת לעת הערכת רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן.
3. לפני החתך בעור, באופן נרחב להכין אופרטיבי על ידי יישום יוד povidone חיטוי ואחריו אלכוהול איזופרופיל באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי.
4. תתחיל עם חתך בעור רוחבי שטחי עם מספריים על פני העור בצוואר הרחם ובטן. חבר שני החתכים בילטרלי לאורך קווי midaxillary.
5. בעזרת מלקחיים מייקרלנתח את אזור צוואר הרחם דו-צדדי לזהות, לקשור ולחלק את ורידי הצוואר החיצוניים עם תפר 6-0 משי ומספריים. אז electrocautery באמצעות לחלק את שרירי sternocleidomastoid לחשוף את ורידי הצוואר הפנימיים ועורקי תרדמה משותפים, דו-צדדי. לעבור תפר 6-0 משי תחת שמאל-צדדי וזכות-צדדי תרדמה משותפת וורידי הצוואר פנימיים באופנה בתפזורת.
   הערה: הם יהיו קשורים ומחולקים מאוחר יותר בשלב 1.9.
6. חדות לחלק את שרירי הרצועה ורקמת areolar רופף נלוות, הממוקמים קדמית לקנה הנשימה, באמצעות מספריים כדי לשחרר את הקבצים המצורפים שנותרו באזור צוואר הרחם.
7. באמצעות electrocautery דו קוטבי ונתיחה חדה, לחלק את השרירים גדולים pectoralis ובריח לחשוף את כלי ולקשור (6-0 תפר משי) subclavian ולחלק proximally.
8. בשלב הבא, בעדינות, לתפוס ולמשוך את איבר המין של בעלי החיים. לאורך dorsum של הפין לדמיין את וריד הגב של הפין, ולחטאאזור עם אלכוהול איזופרופיל. באמצעות מחט 30 G, להזריק 30,000 יחידות של הפרין לוריד דרך וריד הגב ולאפשר הפין להירתע חזרה לעמדתו המקורית. דליפה חלקית של פתרון הפרין לרקמה הסובבת עלולה להתרחש.
9. באמצעות הקשרים בתפזורת הניחו בעבר סביב עורק תרדמה משותף ווריד הצוואר פנימי, לקשור ולחלק את המבנים, דו-צדדי.
10. מספריים שימוש הבא לעשות חתך רוחבי intrabdominal. כסח את המעיים כדי לחשוף את נחות הווריד הנבוב infrahepatic ולהזריק 2 מיליליטר של תמיסת cardioplegia האירו-קולינס הקר לתוך הווריד הנבוב הנחות infrahepatic. להבטיח הזרקה נאותה על ידי לדמיין שינוי צבע כבד והפסקת פעימות הלב לפני קידום לשלב הבא.
    הערה: פתרון האירו-קולינס מוכן במעבדה שלנו, ראה טבלה של ריאגנטים ומכשירים ספציפיים.
11. מספריים בגישת חלל intrathoracic באמצעות diaph הדו-צדדיחתך ragmatic מהבטן החשופה. להאריך את החתך cephalad דרך השרירים הבין צלעיים וצלעות. משקף קיר חזה חושף את הלב, התימוס, וכלי גדול, תוך הבטחת שמירה על כלי בית החזה הפנימיים לאורך קיר החזה בו זמנית.
12. להזריק את נחות הווריד הנבוב suprahepatic עם 4 מיליליטר של תמיסת cardioplegia האירו-קולינס קר.
13. זהה את השורש של אב העורקים ואת עקבות distally לאב העורקים היורדים. באופן חד לחתוך את אב העורקים היורדים (שימור אורך מקסימאלי).
14. זהה את תא המטען ריאתי ולחלק רק הפרוקסימלי לנקודת הסניף שלה (שימור אורך מקסימאלי). לאחר מכן באמצעות 2 מיליליטר של תמיסת cardioplegia האירו-קולינס קר, לשטוף את תא מטען ולב ריאה על ידי הצבת קטטר קצה פלסטיק רך ללומן של תא המטען ריאתי.
15. באמצעות תפר 6-0 משי, לקשור ולחלק את הווריד הנבוב הנחות, נקודת המפגש של ורידי ריאה, וסניפי אבזר של הווריד הנבוב מעולה בין שתי המדינות. אז לרומםולנתח את cephalad הלב מהקבצים המצורפים לאורך הסמפונות העיקרית גזע וקנה נשימה בזהירות שלא להיכנס לדרך הנשימה. באמצעות electrocautery החד ודו קוטבי לנתח את החזה, התימוס, והלב משחרר אותו לחלוטין מעכבר התורם.
16. לבסוף, לקצץ את קיר חזה שתל vivo לשעבר לגודל קטן יותר, באמצעות מספריים, לאורך עצם החזה וcostae רוחב, בזהירות שלא לשבש את כלי הפנימיים של בית החזה (איור 1 א). כדי למזער את הדימום הבא revascularization, להשתמש electrocauterization דו קוטבי לאורך הגבולות של עצם החזה osteomusculocutaneous.
17. מניחים את השתל ב 10 מיליליטר של (צלזיוס 4 ^O) הקרה פתרון האירו-קולינס אם הנמען אינו מוכן להבלעה. עם זאת, אם המקבל הוא מוכן להבלעה, להעביר את השתל ישר לשדה הנמען האופרטיבי.

2. הכנת נמען

הערה: כדי לצמצם את זמן הרדמה נמען,מתחיל בהכנת הנמען בתחנה אופרטיבית נפרדת כ 40 דקות לפני סיום קציר שתל תורם.

1. השתמש בערכה של מכשירים סטנדרטיים סטרילי מייקר וכפפות סטריליות להליך נפרדת.
2. להרדים את עכבר הנמען (זכר או נקבה) באמצעות מכשיר אדים אינדוקציה isoflurane ב 4%. באמצעות קוצץ מכאני atraumatic להסיר את השיער מאזור צוואר הרחם ובית החזה הימני.
3. מניחים את העכבר בעמדה וזווית האיבר הימני העליון מעט inferiorly להרכיב זווית 110 מעלות בין הראש והגפיים ימני העליונים שכיבה. לשמור על הרדמה על isoflurane 1-2% באמצעות חרטומו.
4. הנח משחת עיני נפט בעיני העכבר באמצעות מוליך קצה כותנה. לפני החתך בעור, להכין נרחב האתר האופרטיבי באמצעות יוד povidone חיטוי ואחריו אלכוהול איזופרופיל.
5. בעזרת מספריים, לעשות חתך בעור מקו האמצע לאורך בור הנחותה תקיןדר של הלסת התחתונה ולהרחיב את החתך infero-רוחבית לאזור בית החזה הימני. באמצעות נתיחה בוטה עם מלקחיים כלי דם, לגייס את וריד הצוואר החיצוני על ידי circumferentially חופשי הכלי מרקמות וadventitia רכים. לחלק את כל הסניפים באמצעות electrocautery, ולהסיר את האונה הימנית של בלוטת submandibular באמצעות נתיחה וelectrocautery חדות למקום פנוי עבור השתל.
6. ודא מספיק אורך של וריד הצוואר החיצוני לאוורט על שרוול, ולקשור את הצוואר החיצוני וריד באמצעות תפר 6-0 משי. הכנס את הווריד באמצעות לומן של שרוול polyimide החתוך ולהשתמש מהדק כלי דם בולדוג לתקן מורכב כלי-שרוול במקום. לאחר מכן באמצעות מספריים, proximally לחלק את וריד הצוואר החיצוני, אוורט על השרוול, ולתקן במקום עם תפר 10-0 ניילון. (איור 1)
7. מחלקים את השרירים sternocleidomastoid תקין עם electrocautery דו קוטבי לחשוף את עורק תרדמה המשותף. אספסוף circumferentiallyilize העורק cephalad לרוב נקודת דיסטלי באזור צוואר הרחם. המטרה זו מושגת באמצעות נתיחה בוטה של ​​כלי השיט עם מלקחיים כדי להסיר רקמות רכות וadventitia שמסביב.
8. באמצעות תפר 6-0 משי, לקשור ולחלק את עורק תרדמה המשותף. להעביר את העורק באמצעות לומן של שרוול polyimide החתוך ולתקן אותה במקום עם מהדק כלי דם בולדוג קרוב לכניסה של בית החזה ככל האפשר. מחלקים את כלי distally, בעדינות להרחיב את הכלי באמצעות מרחיב מייקר, אוורט על השרוול, ולתקן במקום עם תפר 10-0 ניילון. (איור 1)
   הערה: מרחיב המייקר הספציפי מתואר בטבלה של חומרים כימיים ומכשירים ספציפיים.

3. שתל הבלעה

1. לשמור על מכשור סטרילי סטנדרטי וכפפות סטריליות למקום השתל בתוך אזור צוואר רחם הנמען במהופך ועמדה אלכסונית.
2. לאחר מכן, הנח את AOR יורד תורםלומן טיק מעל מבנה שרוול עורקים של הנמען ולתקן אותה במקום זה עם תפר 10-0 ניילון (איור 1 ג ו1D).
3. אופנה באותה ההשקה כמו בשלב 3.2 בין עורק הריאה התורם ומבנה וריד הצוואר השרוול החיצוני כלפי חוץ של עכבר הנמען (איור 1 ג ו1D).
4. ראשית להסיר מהדק ורידי כלי דם (מהדק וריד הצוואר חיצוני) ולאחר מכן שחרר את המהדק העורק (מהדק עורק תרדמה משותפת). במהלך reperfusion עורקים, לבדוק את השלמות של השתל לענות על כל דימום. אם הדימום הוא דמיין, החל מחדש את המהדק העורק כדי להקטין את איבוד דם ולמתן את מקור הדימום באמצעות electrocautery דו קוטבי.
5. בדוק את השתל ולהבטיח עצירת דימום. לשחרר ולהסיר את מהדק כלי דם עורקים לחלוטין. שים לב ללב להראות סימנים של reperfusion, אשר יהיו באופן מיידי נראית לעין עם הרחבת נפח מהירה של תאי לב, ולחכות לבאכילה להתחיל בתוך 0.5-1 דקות. השתמש במלח חם (35 מעלות צלזיוס) כדי ללחלח את הלב.
6. לעטוף את החזה לעמדה אנטומית כדי שלא לגרום לכל מסתלסלים או מתחים על anastomoses. סגור את העור של פצע הניתוח הוא באמצעות 6-0 תפרי ניילון רציפים (איור 1E).

4. לאחר ניתוח טיפול

1. לנהל בולוס נוזלי intraperitoneal מלוח 0.3 מיליליטר נורמלי מייד לאחר הניתוח להחלפת נוזל.
2. אז תת עורי להזריק עצירות (0.1mg / קילוגרם) וEnrofloxacin (5mg / קילוגרם) לטיפול מונע כאב ודלקת, בהתאמה.
3. מניחים את החיה תחת מנורת חום עד שהתעורר מהרדמה ולחזור לכיבה sternal. במהלך התאוששות, לבדוק את הצוואר כדי להמחיש את פעימת לב הרעד הזה של שתל הבטחת זלוף שתל המתאים.
4. ברגע ער ובמצב שכיבה, להחזיר את העכבר לכלוב נפרד (ללא החברה של עכברים אחרים) בו הוא יכול לקבל מזון ומים כרצונך. בשל כל תנועה מגבילה קטין זמנית של האיבר הימני העליון, לעזוב מקור מזון ג'לטין על רצפת הכלוב.
5. שים לב לעכבר הנמען עבור שעה 1 לאחר הניתוח ולאחר מכן להחזיר אותו למתקן הכלוב שבו הוא יכול לקבל כרצונך מזון ומים ונבדק שלוש פעמים ביום במשך 24 שעות הראשונות לפעילות והצריכה תזונתית. צג עכברי סימנים של כאב ומצוקה ומחדש מנה עם עצירות (0.1mg / kg) תת עורי פעמיים ביום לפי צורך לשעה 72 הראשונה. בדוק את החיות יומיות לאחר מכן ולשקול אותם בכל שבוע.
6. התייעץ עם חבר צוות וטרינרים עם אם כל עכברים להציג סימנים של כאב, מצוקה, או ירידה בצריכת מזון. לשקול המתת חסד מוקדמת (בפרוטוקול שלנו טכניקת המתת חסד מעסיקה CO ₂ ממנת יתר ל7 דקות, ואחריו נקע בצוואר הרחם).
7. הפסקה של לב שתל הפעימה מוגדרת כנקודת סיום ספציפית שגרמה בעכבר כדי להיות שלacrificed.

תוצאות

Syngeneic C57BL / 6 השתלות השיגו הישרדות לטווח ארוכה. העיצוב של השתל (איור 1) הוכח כמוצלח מבחינה ההישרדות של בעלי חיים ואת היכולת להעריך הישרדות שתל מתמשכת. זה הודגם באמצעות עור שמעליה נותר צמיחה בת-קיימא, פעילה שתל מתמשך שיער, ופעימות לב היינו יכול להיות מוערך עם הדמי...

Discussion

יש המון תופעות שגורמות לחקירה החיסונית של allotransplantation, הכולל אך אינם מוגבלים למנגנונים של דחייה אקוטית וכרונית, מצגת אנטיגן ישירה ועקיפה, רגישות נמען, או האינדוקציה המעורב chimerism. ¹⁹ מודלים בבעלי חיים הפכו תקן הזהב לחקר אימונולוגיה השתלה, ומודלי עכבר עממי יושמו בש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euro-Collins Solution			The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose.
Suture	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimide Cuff Vein (21G)	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimide Cuff Artery (24G)	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Soft plastic tip catheter	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
Microsurgical dilator	S&T	D-5a.1	Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d