Farelerde A Novel Mikrocerrahi Heterotopik Modeli, En Bloku Göğüs Duvarı, Thymus ve Kalp Nakli

Özet

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Özet

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.^1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

Giriş

Cardiac transplantation is the treatment of choice for end-stage heart failure. Both technical advancements and pharmacological innovations have propelled the field to early graft acceptance rates above 90%.^12,13 Despite this, 60-80% 5-year graft survival is at a standstill and chronic rejection, characterized by transplant vasculopathy, remains inevitable.^14-16 Furthermore, patients are subjected to multiple surgical procedures and lifelong immunosuppression, which are associated with chest wall deformities and medical sequelae and toxicities, respectively. The need for innovative approaches to extend allograft survival, minimize the immunosuppressive requirements, and offer reconstructive options for anatomical deformities is pressing.

Vascularized composite allotransplantation offers a unique strategy for improving heart transplant outcomes both from an immunological aspect as well as a reconstructive perspective.¹⁷ Vascularized composite allografts are also unique in a way that they have an inherent source of donor-derived hematopoietic stem cells which has shown a favorable ability to reduce immunosuppression and induce and sustain mixed chimerism.^1-8 Additionally, co-transplantation of the thymus has shown to prolong survival of both, solid organ transplants and vascularized composite allografts.^2,9-11 Combining these strategies with heart transplantation offers a novel solution to the aforementioned challenges facing heart transplantation.¹⁸

Murine models serve as excellent platforms for mechanistic in vivo investigation because of the availability of antibodies and well-defined inbred and knockout strains.^19-21 Although heart transplantation in mice is commonly studied using a heterotopic intraabdominal microsurgical suture transplant model^22-25, a heterotopic, cervical, non-suture cuff technique model has shown to be extremely replicable, reliable, and carries fewer rates of thrombosis.^19,26,27 The goal of this study is to develop a heterotopic en bloc osteomyocutaneous chest wall, thymus, and heart transplant technique in mice to study the immunological mechanisms of combined solid organ and vascularized composite allotransplantation using a cervical non-suture cuff technique. This cluster allograft is perfused through the anastomosis of the donor descending aorta to the right common carotid artery and the donor pulmonary artery to the right external jugular vein. Preservation of the internal thoracic vessels and associated thymus branches is paramount to perfusing the chest wall (sternum, ribs, muscles, and skin) and thymus.

Protokol

Tüm operatif prosedürler Johns Hopkins Üniversitesi'nde ve ABD Tarım Bakanlığı ve Halk Sağlığı Servisi gereklerine uygun olarak tamamlanmıştır. Bu protokol Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi izler, kurumsal inceleme kurulu (protokol numarası M013M490) yönergeleri onayladı. Nihai sağkalım verileri aşağıda açıklanan cerrahi prosedürler için kaydedildi. Hem verici hem alıcı hayvanlar 0.1 mg buprenorfin kullanılarak rüçhan anestezisi / kg sc bir saat önce cerrahi ve alıcı hayvan buprenorfinin nakli sonrasında aynı dozda uygulanan yeniden ilk 48 saat içinde gerektiğinde yeniden dozlanır ameliyat sonrası.

1. Donör Allogreft Kurtarma

Not: Alıcı anestezi süresini en aza indirmek için erken alıcı nakli daha nakli 40 dakika donör bölümünü başlayın ve eşzamanlı bitiş saati veya biraz kulak kolaylaştırmak içinAlıcı hazırlık karşı lier bitiş zamanı.

1. Prosedür standart steril mikrocerrahi aletleri ve steril eldiven kullanın. Laboratuvarımız mikrocerrahi aletleri otoklav sterilizasyon kullanır.
2. % 4 izofluran indüksiyon buharlaştırıcı kullanılarak donör fare (erkek) anestezisi. Kullanımı atravmatik mekanik makası servikal, torasik saç ve karın bölgesini kaldırın. Yatar pozisyonda hayvan yerleştirin ve bir burun konisi ile% 1-2 üzerinde izofluran korumak. Periyodik ayak tutam çekilme refleksi değerlendirerek işlem boyunca yeterli anestezi sağlayın.
3. Cilt kesisi öncesinde, yaygın steril pamuklu çubuk kullanarak izopropil alkol ardından antiseptik povidon iyot uygulayarak operatif hazırlar.
4. Servikal ve karın derisi boyunca makas ile yüzeysel enine cilt kesisi ile başlayın. Bilateral orta aksiler çizgisinde her iki kesiler bağlayın.
5. Mikrocerrahi forseps kullanarak6-0 ipek sütür ve makasla eksternal juguler venler, tespit bağlanır ve bölmek için bilateral servikal bölgeyi incelemek. Sonra kullanarak elektrokoter bilateral internal juguler venler ve karotis arterler maruz sternokleidomastoid kasları bölün. Sol taraflı ve toplu bir şekilde karotis ve internal juguler venler sağ taraflı altında 6-0 ipek sütür geçirin.
   NOT: Bunlar bağladılar ve Adım 1.9 daha sonra bölünecektir.
6. Keskin, servikal bölgede kalan ekleri ücretsiz makas kullanarak, trakea anterior bulunan kayış kasları ve ilişkili gevşek areolar dokuyu, bölün.
7. Bipolar elektrokoter ve keskin diseksiyon kullanarak, subklavian damarları ve Arter (6-0 ipek dikiş) ortaya çıkarmak ve proksimale bölmek için pektoralis majör kas ve clavicles bölün.
8. Sonra, yavaşça, kavramak ve hayvanın penisi çekme. Penisin sırtında boyunca penisin dorsal ven görselleştirmek ve dezenfekteizopropil alkol ile bölge. 30 G iğne kullanarak, intravenöz dorsal ven yoluyla heparin 30.000 adet enjekte ve penis tekrar eski konumuna geri tepme için izin verir. Çevre dokuya heparin solüsyonu kısmi akabilir.
9. Karotis ve internal juguler ven etrafında önceden yerleştirilen dökme bağları kullanarak, bilateral, bağlanır ve yapıları bölün.
10. Sonraki kullanım makas enine intraabdominal kesi yapmak için. Infrahepatic inferior vena kava ortaya çıkarmak ve infrahepatic inferior vena kava içine soğuk Euro-Collins kardiyopleji solüsyonuna 2 ml enjekte etmek için bağırsakları eviscerate. Önce aşağıdaki adıma ilerleyen karaciğer renk değişikliği ve kalp atışı durması görselleştirerek uygun enjeksiyon sağlayın.
    NOT: Euro-Collins çözümü, laboratuvarımızda hazırlanan özel reaktifler ve araçların tabloya bakınız edilir.
11. Kullanımı makas ikili diaph üzerinden intratorasik boşluğu erişmekmaruz karından kesi ragmatic. Interkostal kaslar ve kaburga ile sefalad kesi uzatın. Aynı anda göğüs duvarı boyunca internal torasik damarların korunmasını sağlarken kalp, timus ve büyük damarları açığa göğüs duvarı düşünün.
12. Soğuk Euro-Collins kardiyopleji solüsyonuna 4 ml suprahepatik inferior vena kava enjekte edilir.
13. Aort kökü tespit ve inen aort distal iz. Keskin azalan aorta (maksimal uzunluğu koruyarak) kesti.
14. Pulmoner gövde belirlemek ve (maksimal uzunluğu koruyarak) şube noktasına sadece yakın bölün. Sonra soğuk Euro-Collins kardiyopleji solüsyonuna 2 ml kullanılarak, akciğer gövde lümenine bir yumuşak plastik uç kateter yerleştirerek pulmoner gövde ve kalp yıkayın.
15. 6-0 ipek sütür, ligate kullanarak ve pulmoner venlerin izdiham inferior vena kava bölmek ve bilateral superior vena kava aksesuar dalları. Sonra yükseltmesineve hava yolunu girmek için özenle ana kök bronşlarda ve trakea boyunca ekleri kalp sefalad teşrih. Keskin ve bipolar elektrokoter kullanılarak göğüs duvarı, timus ve kalp tamamen donör fare onu kurtarmanın incelemek.
16. Son olarak, sternum ve yanal costadan boyunca, makas kullanılarak, daha küçük boyuta allogreft göğüs duvarı ex vivo süs özenle internal torasik damarlar (Şekil 1A) bozmak için değil. Revaskülarizasyon aşağıdaki kanamayı en aza indirmek için, osteomusculocutaneous sternum sınırları boyunca bipolar elektrokoterizasyonunun kullanın.
17. Alıcı içerlek hazır değilse Euro-Collins solüsyonu soğuk ⁽⁴ o Celcius) 10 ml allogreft yerleştirin. Alıcı içerlek için hazır olup olmadığını ancak, düz alıcı ameliyat alanına allogreft aktarın.

2. Alıcı Hazırlık

Not: Alıcı anestezi süresini en aza indirmek için,Ayrı bir ameliyat istasyonunda önceki donör allogreft hasat tamamlanması yaklaşık 40 dakika alıcı hazırlık başlar.

1. Standart steril mikrocerrahi aletleri ve prosedür için steril eldiven ayrı bir kümesi kullanın.
2. % 4 izofluran indüksiyon buharlaştırıcı kullanılarak (erkek veya kadın) alıcı fare anestezisi. Atravmatik mekanik makası kullanarak doğru servikal ve torasik bölgeden saç kaldırmak.
3. Yatar pozisyona ve açı sağ üst ekstremite hafifçe inferiora baş ve sağ üst ekstremite arasındaki 110 derecelik açı oluşturarak fare yerleştirin. Bir burun konisi ile% 1-2 izofluran üzerinde anestezi koruyun.
4. Bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak fare gözleri petrol oftalmik merhem yerleştirin. Cilt kesisi öncesinde yaygın izopropil alkol ardından antiseptik povidon iyot kullanarak ameliyat sitesi hazırlamak.
5. Makas kullanarak, sağ alt bor boyunca orta hattan bir cilt kesi yapmakMandibula der ve sağ göğüs bölgesine infero-lateral kesi uzatmak. Mikrovasküler forseps ile künt diseksiyon kullanarak, yumuşak doku ve adventisyanın gelen çevresel serbest geminin dış juguler ven seferber. Elektrokoter kullanarak tüm şubeleri bölün ve allogreft için boş alan keskin diseksiyon ve elektrokoter kullanılarak submandibular bezin sağ lobunu çıkarın.
6. Bir manşet üzerine tersine çevrilmesi için eksternal juguler venin yeterli uzunluğa sahip ve 6-0 ipek sütür kullanılarak damar dış şahdamarını Arter. Bir hazır kesilmiş polimid manşet lümen yoluyla damarını yerleştirin ve yerine gemi-kaf kompleksi düzeltmek için bir buldog mikrovasküler kelepçe kullanın. Sonra proksimale evert manşet üzerine, eksternal juguler ven bölmek ve 10-0 naylon sütür ile yerde düzeltmek, makas kullanılarak. (Şekil 1B)
7. Karotis arter ortaya çıkarmak için bipolar elektrokoter ile sağ sternokleidomastoid kas bölün. Çevresel mafyaServikal bölgedeki uzak noktaya en sefalad arter ilize. Bu yumuşak doku ve çevresindeki adventisya kaldırmak için forseps ile kabın künt diseksiyon kullanılarak gerçekleştirilir.
8. 6-0 ipek sütür, ligate kullanarak ve karotis arter bölün. Bir hazır kesilmiş polimid manşet lümen yoluyla arter geçirin ve mümkün olduğunca göğüs girişine yakın bir bulldog mikrovasküler kelepçe ile yerine sabitleyin. Hafifçe evert manşet üzerine, bir mikrocerrahi dilatörü kullanarak gemiyi dilate, distale gemi bölün ve 10-0 naylon sütür ile yerde sabitleyin. (Şekil 1B)
   NOT: Belirli bir mikrocerrahi dilatör özel reaktifler ve araçların tabloda açıklanmaktadır.

3. Allogreft Ankastre

1. Bir baş aşağı ve eğik pozisyonda alıcı servikal bölgede allogreft yerleştirmek için standart steril enstrümantasyon ve steril eldiven koruyun.
2. Daha sonra, verici inen AOR yerAlıcının arteriyel manşet yapısının üzerinde tik lümen ve 10-0 naylon sütür (Şekil 1C ve 1D) ile yerine onu bunu düzeltin.
3. Donör pulmoner arter ve alıcı fare (Şekil 1C ve 1D) everte eksternal juguler ven-kaf yapı arasındaki adım 3.2 ile aynı anastomoz moda.
4. İlk venöz mikrovasküler kelepçesini (eksternal juguler ven kelepçe) kaldırmak ve daha sonra arteriyel kelepçesini (karotis arter kelepçesi) bırakın. Arteriyel reperfüzyon sırasında, herhangi bir kanama ele allogreftin bütününü kontrol edin. Kanama görüntülenmiştir ise, kan kaybını en aza indirmek ve bipolar elektrokoter kullanılarak kanama kaynağını azaltmak için arteriyel kelepçesini yeniden uygulayın.
5. Greft kontrol edin ve hemostaz sağlamak. Bırakın ve tamamen arter mikrovasküler kelepçesini çıkarın. Kalp boşluklarının hızlı hacim genişlemesi ile anında görülecektir reperfüzyon belirtileri göstermeye kalbi gözlemleyin, ve b bekleyin0.5-1 dakika içinde başlayacak yeme. Kalbi nemlendirmek için ılık tuzlu su (35 ° C) kullanın.
6. Anastomozlar üzerinde herhangi bir dolaşması ya da tansiyonu teşvik etmeyecek şekilde anatomik pozisyona göğüs duvarı örtün. 6-0, sürekli naylon dikiş (Şekil 1E) kullanılarak cerrahi yaranın cilt kapatın.

4. Ameliyat Sonrası Bakım

1. Sıvı replasmanı için hemen ameliyat sonrası bir 0.3 ml normal tuzlu su intraperitoneal sıvı bolus yönetin.
2. Daha sonra deri altından, sırasıyla, ağrı ve enfeksiyon profilaksisi için buprenorfin (0.1 mg / kg) ve enrofloksasin (5 mg / kg) enjekte edilir.
3. Anestezi uyanan kadar bir ısı lambası altında hayvan yerleştirin ve sternum yatma dönün. Kurtarma sırasında, yeterli allogreft perfüzyon sağlanması allogreftin fibrilasyon kalp görselleştirmek için boyun inceleyin.
4. Bir kez uyanık ve yatar pozisyonda, diğer farelerin şirket olmadan ayrı bir kafes (fare iade) O yiyecek ve su ad libitum alabilirsiniz nerede. Sağ üst ekstremite geçici minör kısıtlayıcı harekete, kafesin katta bir jelatin gıda kaynağı bırakın.
5. Ameliyat sonrası 1 saat alıcı fare gözlemleyin ve daha sonra gıda ve su ad libitum alabilir ve aktivite ve beslenme alımı için ilk 24 saat günde üç kez denetlenir kafes tesisine iade edin. İlk 72 saat için gereken günde iki defa deri altından ağrı ve sıkıntı ve buprenorfin (0.1 mg / kg) ile yeniden dozunun belirtileri için fareler izleyin. Daha sonra günlük hayvanları inceler ve her hafta onları tartın.
6. Herhangi fareler ağrı, sıkıntı belirtileri gösterir, ve yem tüketiminde azalma ise bir veteriner personel ile danışın. Erken ötenazi düşünün (protokolde ötanazi tekniği sonra servikal dislokasyon yapılmıştır, 7 dakika boyunca _CO2 aşırı doz kullanmaktadır).
7. Allogreft kalp atışının durması s olmak için fareyi isteyen belirli bir son nokta olarak tanımlanıracrificed.

Sonuçlar

Singenik C57BL / 6 nakli uzun süreli yaşam elde etti. Allogreft (Şekil 1) tasarım bir hayvan hayatta kalma perspektifi ve sürekli allogreft hayatta değerlendirmek yeteneği başarılı olduğunu kanıtladı. Bu canlı, aktif devam eden allogreft saç büyümesini kalan örten deri yoluyla gösterilmiştir ve kalp atışları görselleştirme ve parmak palpasyonla değerlendirilecek başardık. Hayatta kalma verileri, ayni atadan gelme nakledilen farelerde, Şekil 2'de gösteri...

Tartışmalar

Dahil allotransplantasyon, immunolojik soruşturma içine faktör ama akut ve kronik rejeksiyon, doğrudan ve dolaylı antijen sunumu, alıcı duyarlılık ya da karışık kimerizmin indüksiyon mekanizmaları bunlarla sınırlı değildir fenomen çok sayıda bulunmaktadır. ¹⁹ hayvan modelleri haline gelmiştir transplant immünolojinin çalışma için altın standardı ve fare modelleri halk nedeniyle düşük bağıl veterinerlik ve konut taleplerini azalma maliyet transjenik ve gen knockout farelerde m...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euro-Collins Solution			The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose.
Suture	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimide Cuff Vein (21G)	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimide Cuff Artery (24G)	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Soft plastic tip catheter	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
Microsurgical dilator	S&T	D-5a.1	Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d