Un microquirúrgica Modelo Novela de heterotópico, en bloque, pared torácica, el timo y el trasplante cardiaco en ratones

Resumen

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Resumen

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.^1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

Introducción

Cardiac transplantation is the treatment of choice for end-stage heart failure. Both technical advancements and pharmacological innovations have propelled the field to early graft acceptance rates above 90%.^12,13 Despite this, 60-80% 5-year graft survival is at a standstill and chronic rejection, characterized by transplant vasculopathy, remains inevitable.^14-16 Furthermore, patients are subjected to multiple surgical procedures and lifelong immunosuppression, which are associated with chest wall deformities and medical sequelae and toxicities, respectively. The need for innovative approaches to extend allograft survival, minimize the immunosuppressive requirements, and offer reconstructive options for anatomical deformities is pressing.

Vascularized composite allotransplantation offers a unique strategy for improving heart transplant outcomes both from an immunological aspect as well as a reconstructive perspective.¹⁷ Vascularized composite allografts are also unique in a way that they have an inherent source of donor-derived hematopoietic stem cells which has shown a favorable ability to reduce immunosuppression and induce and sustain mixed chimerism.^1-8 Additionally, co-transplantation of the thymus has shown to prolong survival of both, solid organ transplants and vascularized composite allografts.^2,9-11 Combining these strategies with heart transplantation offers a novel solution to the aforementioned challenges facing heart transplantation.¹⁸

Murine models serve as excellent platforms for mechanistic in vivo investigation because of the availability of antibodies and well-defined inbred and knockout strains.^19-21 Although heart transplantation in mice is commonly studied using a heterotopic intraabdominal microsurgical suture transplant model^22-25, a heterotopic, cervical, non-suture cuff technique model has shown to be extremely replicable, reliable, and carries fewer rates of thrombosis.^19,26,27 The goal of this study is to develop a heterotopic en bloc osteomyocutaneous chest wall, thymus, and heart transplant technique in mice to study the immunological mechanisms of combined solid organ and vascularized composite allotransplantation using a cervical non-suture cuff technique. This cluster allograft is perfused through the anastomosis of the donor descending aorta to the right common carotid artery and the donor pulmonary artery to the right external jugular vein. Preservation of the internal thoracic vessels and associated thymus branches is paramount to perfusing the chest wall (sternum, ribs, muscles, and skin) and thymus.

Protocolo

Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en cumplimiento de la Universidad Johns Hopkins y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y los requisitos del Servicio de Salud Pública. Este protocolo sigue el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Johns Hopkins, junta de revisión institucional aprobó directrices (número de protocolo M013M490). Datos de supervivencia final se registró durante los procedimientos quirúrgicos se describen a continuación. Tanto los animales donantes y receptores reciben anestesia preventivos utilizando buprenorfina a 0,1 mg / kg sc una hora antes de la cirugía y en el buprenorfina animal receptor es re-administrado a la misma dosis después del trasplante y re-dosifica según sea necesario en las primeras 48 horas después de cirugía.

1. Donantes aloinjerto Recuperación

Nota: Comience la porción donante del trasplante de 40 minutos antes que el beneficiario del trasplante para minimizar el tiempo de anestesia destinatario y para facilitar una hora de finalización simultánea o ligeramente oídohora de finalización lier frente a la preparación destinatario.

1. Utilice instrumentos de microcirugía estériles estándar y guantes estériles para el procedimiento. Nuestro laboratorio utiliza la esterilización en autoclave de los instrumentos de microcirugía.
2. Anestesiar el ratón donante (masculina) con vaporizador inducción isoflurano en el 4%. Uso de las podadoras mecánicas atraumáticos eliminar el pelo de la cervical, torácica y región abdominal. Colocar el animal en posición supina y mantener isoflurano en 1-2% a través de un cono de nariz. Asegurar una anestesia adecuada durante todo el procedimiento, mediante la evaluación periódica del reflejo de retirada pizca dedo del pie.
3. Antes de la incisión en la piel, ampliamente preparar el operativo mediante la aplicación de povidona yodada antiséptico seguida por el alcohol isopropílico con un hisopo de algodón estéril.
4. Comience con una incisión en la piel transverso superficial con unas tijeras a través de la piel cervical y abdominal. Conecte los dos incisiones de forma bilateral a lo largo de las líneas medioaxilares.
5. Con unas pinzas de microcirugíadiseccionar la región cervical bilateral para identificar, ligar y dividir las venas yugulares externas con sutura de seda 6-0 y tijeras. Luego, utilizando electrocauterio dividir los músculos esternocleidomastoideo para exponer las venas yugulares internas y las arterias carótidas comunes, de forma bilateral. Pasar una sutura de seda 6-0 bajo la del lado izquierdo y el lado derecho de la carótida común y venas yugulares internas en la moda al por mayor.
   NOTA: Se les ataron y se dividen después en el paso 1.9.
6. Bruscamente dividir a los músculos de la correa y el tejido areolar laxo asociado, situado por delante de la tráquea, utilizando tijeras para liberar a los apegos restantes de la región cervical.
7. El uso de electrocauterio bipolar y disección cortante, dividir los músculos principales y las clavículas pectorales para exponer los vasos subclavia y ligar (6-0 sutura de seda) y dividir proximal.
8. Luego, suavemente, agarre y retirar el pene del animal. A lo largo del dorso del pene visualizar la vena dorsal del pene, y desinfectar elregión con alcohol isopropílico. Usando una aguja 30 G, inyectar 30.000 unidades de heparina por vía intravenosa a través de la vena dorsal del pene y permiten a retroceder de nuevo a su posición original. Pueden producirse fugas parcial de la solución de heparina en el tejido circundante.
9. El uso de los lazos a granel previamente colocados alrededor de la arteria carótida común y la vena yugular interna, ligar y dividir las estructuras, de forma bilateral.
10. Uso de las tijeras Siguiente para hacer una incisión transversal intraabdominal. Eviscerar los intestinos para exponer la vena cava inferior infrahepática e inyectar 2 ml de solución fría cardioplegia Euro-Collins en el infrahepática vena cava inferior. Asegúrese de inyección adecuada mediante la visualización de la decoloración del hígado y el cese de los latidos del corazón antes de avanzar a la siguiente etapa.
    NOTA: la solución Euro-Collins es preparado en nuestro laboratorio, ver tabla de reactivos e instrumentos específicos.
11. Con una tijera acceder a la cavidad intratorácica a través de un diaph bilateralragmatic incisión del abdomen expuesto. Extienda la incisión cefálica través de los músculos intercostales y las costillas. Representativas de la pared torácica exponer el corazón, el timo, y los grandes vasos garantizando al mismo tiempo la conservación de los vasos torácicos internos a lo largo de la pared torácica.
12. Inyectar el suprahepática vena cava inferior con 4 ml de solución fría cardioplegia Euro-Collins.
13. Identificar la raíz de la aorta y rastrear de manera distal a la aorta descendente. Bruscamente cortar la aorta descendente (preservando longitud máxima).
14. Identificar el tronco pulmonar y dividir justo proximal a su punto de ramificación (preservación de longitud máxima). Luego, utilizando 2 ml de solución fría cardioplegia Euro-Collins, lave el tronco pulmonar y el corazón mediante la colocación de un catéter de punta de plástico blando en el lumen del tronco pulmonar.
15. Usando una sutura de seda 6-0, ligar y dividir la vena cava inferior, confluencia de las venas pulmonares, y las ramas accesorias de la vena cava superior bilateral. Luego elevary diseccionar el cefálica corazón de los apegos a lo largo de la principal bronquios y la tráquea, con cuidado de no entrar en la vía aérea. El uso de electrocauterio bipolar aguda y diseccionar la pared torácica, el timo, y el corazón liberar completamente del ratón donante.
16. Por último, recortar la pared torácica aloinjerto ex vivo a un tamaño más pequeño, con unas tijeras, a lo largo del esternón y costillas laterales, con cuidado de no romper los vasos torácicos internos (Figura 1A). Para minimizar la hemorragia después de la revascularización, utilice electrocauterio bipolar a lo largo de las fronteras del esternón osteomusculocutaneous.
17. Coloque el aloinjerto en 10 ml de frío ⁽⁴ ° Celsius) solución Euro-Collins si el destinatario no está preparado para la inserción. Sin embargo, si el receptor está listo para inserción, transferir el aloinjerto directamente al campo operatorio destinatario.

2. Destinatario Preparación

Nota: Para minimizar el tiempo de anestesia destinatario,comenzar la preparación receptor en una estación operativa separada aproximadamente 40 min antes de la finalización de la cosecha del injerto donante.

1. Utilice un conjunto separado de instrumentos de microcirugía estériles estándar y guantes estériles para el procedimiento.
2. Anestesiar el ratón receptor (hombre o mujer) con vaporizador inducción isoflurano en el 4%. El uso de las podadoras mecánicas atraumáticos quitar el pelo de la región cervical y torácica derecha.
3. Coloque el ratón en la posición supina y el ángulo de la extremidad superior derecha ligeramente por abajo formando un ángulo de 110 grados entre la cabeza y el miembro superior derecho. Mantener la anestesia en el 1-2% isoflurano a través de un cono de la nariz.
4. Coloque petróleo ungüento oftálmico en los ojos de ratón utilizando un aplicador con punta de algodón. Antes de la incisión de la piel, ampliamente preparar el sitio de la operación usando povidona yodada antiséptico seguido por alcohol isopropílico.
5. Con unas tijeras, hacer una incisión en la piel de la línea media a lo largo del bor inferior derechoder de la mandíbula y extender la incisión infero-lateral a la región torácica derecha. Utilizando disección roma con pinzas microvasculares, movilizar a la vena yugular externa circunferencialmente libre del vaso de tejidos blandos y adventicia. Divida todas las ramas utilizando electrocauterio, y quitar el lóbulo derecho de la glándula submandibular mediante disección cortante y electrocauterio para liberar espacio para el aloinjerto.
6. Asegurar suficientemente la longitud de la vena yugular externa para la eversión sobre un manguito, y se liga la vena yugular externa utilizando una sutura de seda 6-0. Inserte la vena a través del lumen de un manguito de poliimida de precorte y utilizar una pinza microvascular bulldog para fijar el complejo buque-manguito en su lugar. Luego, utilizando tijeras, proximal dividir la vena yugular externa, Evert sobre el brazalete, y fijar en su lugar con una sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
7. Divida el músculo esternocleidomastoideo derecho con electrocauterio bipolar para exponer la arteria carótida común. Mafia circunferencialmenteilize la arteria cefálico al punto más distal dentro de la región cervical. Esto se logra utilizando disección roma del vaso con pinzas para eliminar el tejido blando y adventicia circundante.
8. El uso de sutura de seda 6-0, ligar y dividir la arteria carótida común. Pase la arteria a través de la luz de un manguito de poliimida precortadas y fijarlo en su lugar con una pinza microvascular bulldog tan cerca de la entrada torácica posible. Divida el vaso distal, dilatar suavemente el recipiente usando un dilatador microquirúrgica, Evert sobre el brazalete, y fijar en su lugar con una sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
   NOTA: El dilatador microquirúrgica específica se describe en la tabla de reactivos e instrumentos específicos.

3. aloinjerto Inserción

1. Mantener la instrumentación estéril estándar y guantes estériles para colocar el injerto dentro de la región cervical destinatario en un revés y la posición oblicua.
2. A continuación, coloque el aor descendente donantelumen de tics más de la construcción del manguito arterial del receptor y fijarlo en su lugar con una sutura de nylon 10-0 (Figura 1C y 1D).
3. Moda mismo anastomosis como en el paso 3.2 entre la arteria pulmonar donante y la eversión constructo yugular venosa-manguito exterior del ratón receptor (Figura 1C y 1D).
4. Primero quite pinza microvascular venosa (pinza vena yugular externa) y luego liberar la pinza arterial (abrazadera de la arteria carótida común). Durante la reperfusión arterial, inspeccionar la totalidad del aloinjerto para abordar cualquier hemorragia. Si se visualiza la hemorragia, vuelva a aplicar la pinza arterial para minimizar la pérdida de sangre y mitigar la fuente de la hemorragia mediante electrocauterio bipolar.
5. Inspeccione el injerto y asegurar la hemostasia. Suelte y retire completamente la pinza microvascular arterial. Observar el corazón a mostrar signos de reperfusión, que serán instantáneamente evidente con la expansión de volumen rápida de las cámaras del corazón, y esperar a que bcomer para comenzar dentro de 0,5 a 1 min. Utilice solución salina tibia (35 ° Celsius) para humedecer el corazón.
6. Coloque la pared del pecho en una posición anatómica a fin de no inducir a cualquier formación de cocas o tensiones en las anastomosis. Cierre de la piel de la herida quirúrgica está utilizando 6-0 suturas de nylon continuo (Figura 1E).

4. Cuidado posoperatorio

1. Administrar un bolo intraperitoneal 0,3 ml de solución salina normal inmediatamente después de la operación para la reposición de líquidos.
2. Entonces inyectar subcutáneamente buprenorfina (0,1 mg / kg) y enrofloxacina (5 mg / kg) para la profilaxis de dolor y la infección, respectivamente.
3. Colocar el animal bajo una lámpara de calor hasta que se despierta de la anestesia y volver al decúbito esternal. Durante la recuperación, inspeccione el cuello para visualizar el latido fibrilación del aloinjerto asegurar una adecuada perfusión del injerto.
4. Una vez despierto y en la posición reclinada, devuelva el ratón a una jaula separada (sin la compañía de otros ratones) Donde pueda recibir alimentos y agua ad libitum. Debido a cualquier movimiento restrictiva menor temporal de la extremidad superior derecha, deje una fuente de alimento de gelatina en el suelo de la jaula.
5. Observe el ratón receptor durante 1 hora después de la operación y luego regresar a su centro de la jaula donde pueda recibir alimentos y agua ad libitum y se inspeccionados tres veces al día durante las primeras 24 horas para la actividad y la ingesta nutricional. Monitorear los ratones para detectar signos de dolor y angustia y re-dosis con buprenorfina (0,1 mg / kg) por vía subcutánea dos veces al día según sea necesario para las primeras 72 horas. Examine los animales todos los días a partir de entonces y les pesan cada semana.
6. Consulte con un miembro del personal veterinario, si alguna ratones muestran signos de dolor, angustia, o disminución de la ingesta de alimento. Considere la eutanasia precoz (en nuestro protocolo de la técnica de la eutanasia emplea CO ₂ sobredosis de 7 min, seguido por dislocación cervical).
7. El cese de los latidos del corazón del aloinjerto se define como un parámetro específico que provocó el ratón para ser sacrificed.

Resultados

Singénica C57BL / 6 trasplantes logra la supervivencia a largo plazo. El diseño del aloinjerto (Figura 1) demostró ser un éxito desde una perspectiva supervivencia de los animales y la capacidad de evaluar la supervivencia del aloinjerto en curso. Esto fue demostrado a través de la piel suprayacente seguir siendo viable, crecimiento activo aloinjerto permanente del cabello, y los latidos del corazón pudieron ser evaluados con la visualización y palpación del dedo. Los datos de supervivencia se r...

Discusión

Hay una multitud de fenómenos que un factor en la investigación inmunológica de alotrasplante, que incluyen pero no se limitan a los mecanismos de rechazo agudo y crónico, la presentación directa e indirecta antígeno, la sensibilización destinatario, o la inducción de quimerismo mixto. ¹⁹ Los modelos animales se han convertido el estándar de oro para el estudio de la inmunología del trasplante y modelos de ratón se implementan popularmente debido a su bajo costo, la disponibilidad de ratones transg...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euro-Collins Solution			The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose.
Suture	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimide Cuff Vein (21G)	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimide Cuff Artery (24G)	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Soft plastic tip catheter	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
Microsurgical dilator	S&T	D-5a.1	Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d