"פוליקולטורה שיטת Rotifer" השלמה ומעודכנת לדג הזברה האכלת לתי-פוסקת הראשונה

Summary

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Abstract

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Introduction

דג הזברה (Danio rerio) היא בחיות מעבדה מראש יחסני מנוצלות במספר הולך וגדל של דיסציפלינות מדעיות, כולל אך לא מוגבל לגנטיקה התפתחותית, טוקסיקולוגיה, התנהגות, חקלאות ימית, ביולוגיה משובי, והמודלים של הפרעות אנושיות רבות ^{1 - 5.} למרות שהמין הוא קל יחסית כדי לשמור על במעבדה, יש מספר אתגרי ניהול המזוהים עם תרבותם ^6. הבולט ביותר הוא גידול זחל, במיוחד כאשר הדגים יתחילו ראשון להאכיל לאחר האינפלציה שלפוחית ​​גז ^7. בתנאים רגילים, בשליטה, אירוע התפתחותי זה מתרחש ב ~ 5 ימים לאחר הפריה (DPF), עם 3 הבאים - 5 הימים של צמיחה להיות ⁷ קריטיים במיוחד. הקושי הטכני המרכזי בשלב זה הוא לענות כראוי את הדרישות התזונתיות של זחלי ההאכלה הראשונים - פריטי מזון חייבים להיות בגודל מתאים, digestible, אטרקטיבי, וזמין על בסיס כמעט רציף, ללא יצירת פסולת מוגזמת בטנקי culturing. מבחינה הסטורית זו הושגה בדרך כלל על ידי מתן כמויות קטנות של מזון רבות לדגים בטנקים, יחד עם ^8,9 תחלופת מים שיגרתי. בעוד שיטות אלה הן במידה מסוימת מוצלחות, הם לא יעילים, דורשים תשומות עבודה גבוהות, ולחזור רק משתנה ושיעורים מוגבלים של צמיחה והישרדות ^10.

בטבע, זחלי דג הזברה ככל הנראה להאכיל בהווה זואופלנקטון קטן בשפע בעמודת המים ^11. מסיבה זו, פרוטוקולי larviculture שלשלב הזנות חיות כגון הסנדלית, rotifers, והארטמיה הם בדרך כלל יעילים ביותר ^7. בשנת 2010, בסט והמחברים הוכיחו שזה אפשרי לגדל דג הזברה זחל במי סטטי, מליחים יחד עם rotifers המים המלוחים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני ^12. גישה זו, הרותמת אתes הפרודוקטיביות הגבוהה הטבעית של תרבויות rotifer לספק טרף בשפע, ערך תזונתי גבוהה מבלי לזהם את המים, תשואות שיעורים גבוהים מאוד של צמיחת זחל והישרדות עם תשומת עבודה נמוכה ^12,13. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מעבדות ברחבי העולם אימץ וריאציות של פרוטוקול זה, ורבים מהם עכשיו culturing rotifers באופן רציף לתמיכה במערכות משתלת ^14.

בשנים האחרונות, שיטות לשני rotifer / פוליקולטורה דג הזברה וייצור rotifer כבר מעודנת והשתפרו להיות יותר סטנדרטי וניתן להרחבה בקלות. מאמר זה מספק הוראות צעד-אחר-צעד ל1) ייצור rotifer רציף וחזק ו 2) הקמת rotifer / מערכת פוליקולטורה דג הזברה משמשת לתמיכה בצמיחה חזקה של דגים במשך 5 הימים הראשונים של האכלת אקסוגני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Rotifer תרבות

1. רכיבים בסיסיים של מערכת תרבות באמצעות כלי 100 L תרבות
   1. אסוף את כל הרכיבים להתקנת תרבות rotifer. התקנת תרבות rotifer מורכבת מכלי תרבות (CV) לגדול rotifers; כלי דומה כדי לשמור על rotifers feedout (כלי תרבות feedout, FCV); צנצנת בקיעה עגולה תחתית (Feed מאגר, FR) לאחסון של התערובת להאכיל אצות (AFM); אספקת אוויר (AS) ללאוורר את קורות החיים, וFCV FR; משאבת peristaltic עם טיימר מדידה (PMT) לשלוט משלוח של מזון אצות לקורות החיים וFCV; ומסנן חלקיקי חוט (FPF) שיושב בתוך קורות החיים.
      הערה: רשימה של ציוד ורכיבים מלא מסופקת ברשימת חומרים.
2. תְצוּרָה
   1. להעלות את קורות החיים וFCV על דוכן או שולחן, כך שהתרבויות יכולות להיות שנקטפו בקלות באמצעות ניקוז ההולם להמשך אוסףainer (איור 1). השתמש בצינורות אספקת האוויר גמישים להתחבר AS לאורכו של צינור קשיח בכל כלי תרבות. ודא שהצינור הוא מספיק זמן כדי לספק אוויר לתחתית קורות החיים או FCV.
   2. השתמש בקו אוויר קטן-יכולת להתחבר AS לאורכו של צינור קשיח המשתרע עד לתחתית של FR המכיל את AFM. התקן שסתום לכל שורת אוויר להסדיר את זרימת אוויר. חבר את FR לPMT עם צינורות אספקת מזון, ומפעיל את הצינור מPMT לתוך חור שנקדח בצד של קורות החיים / FCV, בחלקו העליון. איור 1.
3. לִקְפּוֹץ
   1. מלא את כלי התרבות עד 90% מההיקף הזמינים במי אוסמוזה ההפוך (RO). אם RO אינו זמין, להשתמש במים נקיים, dechlorinated עירוניים; עם זאת, הערכת סיכוני ביטחון ביולוגי צריכה להתבצע כדי לוודא ששום אורגניזמים שעלולים להיות פתוגניים נמצאים במי המקור. הערה: ניתוח כזה יכול להתבצעבכל מעבדת בדיקה מוסמכת מים.
   2. מינון המים כלי התרבות במלח אקווריום להגיע מליחות של 15 גר '/ ל'. הגדר את זרימת האוויר לתוך הכלי, כך שהוא שומר על "רתיחה מתגלגלת", ולאחר מכן להוסיף לאט כמות המדודה של מלח לכלי התרבות עד שהוא נמס לגמרי על ידי האוורור. המשך aerating מים ל> 1 שעה כדי לוודא שהוא הוא מחומצן באופן מלא.
   3. הפוך את התערובת להאכיל אצות. עד 3 ליטר נקי, dechlorinated מים מתוקים (0 ppm) להוסיף של NaHCO ₃ 100 גרם ושל מנטרל אמוניה (hydroxymethylsulfonate נתרן) 100 גרם. מגיב אחרון זה מספק את היתרון נוסף של נטרול כל כלור שיורי משאריות מים ברז או אקונומיקה מהחיטוי של ציוד התרבות. זה קריטי כדי להבטיח כי תרכובות אלה להמסה מלאה. ואז להוסיף 1 ליטר של תרכיז אצות (משקל יבש ביומסה ~ 15%). מוסיף את תערובת המזון לFR ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
   4. הוסף תרבות המתנע של 5-10,000,000 rotifers plicatilis Brachionus לקורות החיים המכילים מים מליחות סודה 15 גר' / ל '. אם rotifers כבר מקורר במהלך משלוח או אחסון, הם צריכים להיות בהדרגה (במהלך 30 דקות או יותר) התאקלמו לטמפרטורה של המים בכלי התרבות (25 - C ° 27).
   5. הפעל PMT ולהתחיל שאיבה להאכיל אצות לתוך כלי תרבות rotifer. באמצעות תכונת טיימר של PMT, להגדיר את קצב האספקה ​​של תערובת מזון לאצות כדי ש~ 1.6 מיליליטר של תערובת להאכיל אצות מועבר למיליון rotifers בתרבות, בכל יום. להפיץ את ההאכלות במנות קטנות במרווחי זמן קבועים במהלך תקופה של 24 שעות; תכוף יותר ההאכלות, טוב יותר.
   6. כייל את שיעור המסירה של המשאבה ידנית על ידי סיבוב על PMT לתקופה קצובה (למשל, 1 דקות) ולאסוף את האצות שמשאבות בפרק זמן זה לגליל או כוס סיים. לדוגמא, אם במינוני PMT 5 מיליליטר של אצות בדקות 1, ולאחר מכן את שיעור המינון יהיה5 מיליליטר אצות / דקה.
   7. לחשב את שיעור ההאכלה היומי הנדרש על ידי הכפלת מספר rotifers הנוכחי, במיליון, ב- 1.6 מיליליטר. לדוגמא, תרבות rotifer עם גודל אוכלוסייה של 100 מיליון rotifers תדרוש ~ 160 מיליליטר של מזון ליום (100 x 1.6 מיליליטר).
   8. הגדר את PMT למינון דרישת עדכונים היומי הכוללת במרווחים קבועים לאורך תקופה של 24 שעות. לדוגמא, אספקה ​​של כמות מזון יומית כוללת של 160 מיליליטר יכולה להיות מועברת במנות פעם אחת כל 3 שעות במשך 24 שעות באמצעות סט PMT עם שיעור משאבת מינון של 5 מיליליטר / דקה במשך 4 דקות, 8 פעמים ביום (5 מיליליטר / דקה x 4 דקות = 20 מיליליטר x 8 האכלות = 160 מיליליטר).
   9. לאפשר לתרבות לגדול עד שהוא מייצר אוכלוסייה הנדרשת, בדרך כלל עבור 48-72 שעות, לפני הקציר. ב 24 שעות שלאחר להתחיל, להוסיף מסנני חלקיקי חוט לכלי התרבות ולהתחיל תחזוקה רגילה.
4. תַחזוּקָה
   הערה: התרבות פועלת באופן רציף ודורשת routinתחזוקת דואר שבאופן אידיאלי צריכה להתבצע באותו הזמן בכל יום, ברצף הבא.
   1. מלא את FCV 90% מנפח זמין עם נקי, dechlorinated מים מתוקים, במינון עם מלחי אקווריום L / 10 גרם. ודא שהמים הוא גם מעורבים, וכי כל מלח מתמוסס באופן מלא. הגדר את זרימת האוויר לתוך הכלי, כך שהוא שומר על "רתיחה מתגלגלת". מדוד את המליחות עם refractometer ולהבטיח שהמליחות היא 10 גר '/ L. זה קריטי כדי לעמוד ביעד זה ושלא יעלה על זה.
   2. לדוגמא rotifers בקורות החיים: ודא שהתרבות היא מעורבת היטב, לאחר מכן לאסוף 3 דגימות של 2 - 3 מיליליטר כל אחד באמצעות פיפטה העברה או autopipettor, מחלקים שונים של התרבות. לשלב דגימות אלה בצינור או בקבוקון של גודל נוח (למשל, 10 מיליליטר).
   3. העברת 1 - 2 מיליליטר של המדגם המשולב על צלחת פטרי, כדי שניתן דמיינה אותו תחת מיקרוסקופ לנתח. בדוק את האיכות של התרבות (שחייה התנהגות שלrotifers, נוכחות של ביצים מנותקות, פרוטוזואה זיהום).
   4. לשתק את rotifers במדגם בשילוב שנותר על ידי הוספה של 50% תמיסת יוד Lugols 100 μl למדגם. בתוך שניות לאחר תוספת של Lugols, להתבונן rotifers להפסיק חייה. עכשיו, בקלות לספור את rotifers.
      הערה: אתנול, אקונומיקה מדוללת, או חומץ יכולה לשמש במקום של Lugols. חומץ (2 טיפות / 10 מיליליטר) יש את היתרונות של להיות לא מסוכן, לא לאבד את הכוח באחסון כפתרונות אקונומיקה ויוד יכול, ולא מה שהופך את חוזה rotifers, כך העטרה של cilia ו" הרגל "יישארו מורחבת ו בעלי חיים נראים טבעיים יותר.
   5. ודא שהמדגם הוא גם מעורב (rotifers המשותק יישב במהירות), ואז לקחת במהירות subsample מיליליטר ~ 2 בpipet פלסטיק ולוותר 1 מיליליטר לשקופית לספור Sedgewick-Rafter (20 x 50 ריבועים 1 מ"מ) (איור 2 ). באמצעות מיקרוסקופ לנתח או תרכובת, לספור את rotifers שלם ולאמספר otal של ביצים המצורפות לrotifers אלה (איור 2). ספירה כמה שיותר משטח השקופית כצורך לספור ~ 100 rotifers. לחשב את מספר rotifers לכל מיליליטר, ולהקליט את זה בגיליון אלקטרוני או יומן.
   6. קציר ~ 30% מהיקף rotifers בקורות החיים: הסירו את אספקת האוויר ומסנן חוט, לפתוח לאט את השסתום בחלק התחתון של קורות החיים ולאפשר למים לזרום לאספן פלנקטון עם מסך רשת 53 מיקרומטר. לאסוף את המים זורמים החוצה של החלק התחתון של האספן לאחר הסינון לדלי או ניקוז. השתמש בעדין לזרימה מתונה כדי למנוע נזק לrotifers. אל תאפשר rotifers לייבוש על המסך.
   7. מסיבות עקביות, רצוי להקים FCV עם מספר סטנדרטי של rotifers בכל יום. לכן, בהתבסס על הצפיפות הידועה rotifer קורות חיים וקציר הנפח, להתאים כולל FCV הנפח להשיג צפיפות סופית עולה בקנה אחד (למשל., 1500 rotifers מיליליטר /). הוסף את רוטי נקטףfers לFCV: בעדינות להעביר את rotifers מהמסך הגבייה באמצעות בקבוק לשטוף מלאים במים נקיים מלח (10 - L / 15 גר '). הפוך את המסך מעל FCV ולשטוף את rotifers לFCV עם זרם עדין של מים מלוחים. התחל PMT כדי לספק מזון (~ 1.57 מיליליטר למיליון rotifers ליום) לFCV.
   8. לשפשף את כל החלק הפנימי של קורות החיים עם, מברשת נקייה רכה ניילון או כרית קרצוף.
   9. הפוך תערובת חדשה של מים / L 15 גרם על ידי הוספת הכמות המתאימה של מלח לכמות מדודה של מי RO נקיים בדלי 5 ליטר להחליף את נפח מים איבד למסוק. מוסיף את המלח למים בדלי ומערבבים נמרצות עד שהוא נמס לגמרי, ולאחר מכן להוסיף לקורות החיים.
   10. שימוש בתרסיס בלחץ גבוה בכיור, לשטוף את מסנן החוט עד שהוא נקי מפסולת, ולאחר מכן להחזיר אותו לקורות החיים.
   11. התאם שיעורי הזנה של אצות נמסרו לקורות החיים על ידי שינוי משך הזמן של כל אירוע מינון, על פי הספירה היומית של rotifers מיליליטר /.השתמש בחישובים הניתנים בשלב 1.3.8, לעיל כדי לקבוע את הכמות המתאימה של מזון כדי להיות מועברת.
   12. כ 24 שעות מאוחר יותר, לחזור על התהליך. התחל על ידי קצירת rotifers שנותר בFCV (שלא היה זקוק ליום הקודם) באותו אופן כפי שתוארו לעיל (שלבים 1.4.2 - 1.4.10). לרכז אותם ב 2 ליטר של מים טריים, נקיים dechlorinated (מלח L / 5 ז). אלה יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס כפי שאספקת גיבוי, או נהגו להאכיל שלבים מאוחר יותר של דגים, מעבר למה שמתואר בפרוטוקול זה.
       הערה: פרוטוקול זה מאפשר עד 2 - 3 ימים של תחזוקה מופחתת תרבות (עם הזנה אוטומטית רגילה), כי rotifers בקורות החיים יכול לסבול מחדל של יבולים ללא השלכות חמורות.

2. פוליקולטורה

1. להכין
   1. לאסוף עוברי דג הזברה מאירוע השרצה על ידי שפיכת עוברים הולידו דרך תה מסננת ולאחר מכן בעדינות שטיפה עם FIS סטריליהמים h (או כל מקור אחר שאינם מזוהם של פתרון מותנה כראוי; למשל, בינוני עובר, E3, וכו ') מבקבוק לשטוף לתוך צלחות פטרי.
   2. דגירה עובר ב25 - 28 מעלות צלזיוס בצלחות פטרי בצפיפות של 40 - 50 עובר לכל צלחת במשך 5 ימים.
   3. תתחיל את שלב פוליקולטורה ביום 5 לאחר הפריה, או כאשר יותר מ -90% מהזחלים שבקעו באופן פעיל בחייה בעמודת המים.
2. הַרכָּבָה
   1. הוסף 500 מיליליטר של תרבות rotifer ישירות מFCV לטנק משתלת 3.5 L; הכללה של מים תרבות rotifer מספקת הזנה של אצות ששומרת על הערך התזונתי של rotifers במהלך פוליקולטורה.
   2. בעדינות לשפוך את הזחלים מצלחת פטרי אחת לתוך טנק חדר הילדים. ודא שאין זחלים יישארו בצלחת.
   3. הוסף 500 מיליליטר של מים נקיים, ממוזגים דגים ממערכת הסירקולציה המחודשת או מקור מים ייעודי לטנק להגיע נפח סופי של 1 ליטר ושל אחרוןalinity של 5 גר '/ ל'.
      הערה: מליחות זה קריטי כי הישרדות זחלי דג הזברה תושפע לרעה אם המליחות היא> 7 גרם / L והישרדות rotifer יושפע לרעה אם מליחות <2 g / L.
3. שלב פוליקולטורה
   הערה: שלב פוליקולטורה צריך להימשך עד 4 ימים לאחר חיסון (כולל של 5 ימים, מתאים לימים 5-9 לאחר הפריה).
   1. שים לב למכל פוליקולטורה לפחות פעם ביום בתקופה זו על מנת להבטיח שrotifers ודגים נמצאים וגדל. ודא שrotifers גלוי לאורך כל עמודת המים. ודא שfishs הם גם נראים בתוך עמודת המים, שחיה בין rotifers.
   2. התחל זרימת מים רגילה באמצעות הטנק. הנח מסך או לבלבל מעל נמל הניקוז כדי להבטיח זחלים שאינם סמוקים מהטנק.
      הערה: בסופו של שלב זה, הדגים יהיו גדולים מספיק כדי לצרוך פריטי טרף גדולים יותר כגון הארטמיהפריטי מזון Nauplii או מעובד בטווח הגודל של 75-125 מיקרומטר.
      הערה: דינמיקת אוכלוסיית rotifer בתוך טנק פוליקולטורה נציג נמדדה על ידי דגימה / ספירת rotifers מהמכל באותו אופן כפי שתואר בצעדים 1.4.2 - 1.4.5. זה נעשה פעם אחת בכל יום מההתחלה של שלב פוליקולטורה עד שהושלם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מערכת תרבות rotifer רציפה המתוארת כאן היא דינמית, וזה נורמלי למספרי rotifer להשתנות במידה מועטת לאורך זמן אם יש וריאציות בשיעורי האכלה וקציר יומיים. האוכלוסייה של rotifers באחת התרבויות הפעילה במתקני החקלאות הימית בבית החולים לילדים בבוסטון, נשמר באופן מתואר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

יישום מוצלח של שיטת פוליקולטורה rotifer האכלה דג הזברה זחל מוקדם דורש פרוטוקולים יעילים לשתי משימות: ההקמה ותחזוקה של מערכת תרבות rotifer רציפה כדי להאכיל את הדגים, וculturing הראשון-האכלת זחלי דג הזברה יחד עם rotifers באותו הטנק.

ההתקנה למערכת ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel	Aquaneering	Custom	Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD	Grainger	38M003	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing	Cole Parmer		Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 million	Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb tub	Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S25533B	pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter bag	Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz bottle	All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket	Grainger Supply	43Y530	Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute	Fisher Scientific	S99481	Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer	Kitchenworks	971972	Used for collecting zebrafish embryos after spawning