飼育第1の給電ゼブラフィッシュの完全および更新された「ワムシPolyculture方法」

要約

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

要約

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

概要

^{5 -}ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、発生遺伝学、毒物学、行動、水産養殖、再生生物学、多くのヒトの疾患¹のモデル化を含むがこれらに限定されない科学分野の増加、で利用卓越した実験動物です。種は実験室で維持することは比較的容易であるが、彼 ​​らの文化⁶に関連する管理上の課題がいくつかあります。これらの中で最も顕著なのは魚が第一ガス膀胱インフレ⁷以降のフィードを開始する場合は特に、幼虫の飼育です。成長の5日⁷特に重要である-通常の、制御された条件の下では、この発達イベントには、次の3で、受精後（DPF）〜5日後に発生します。フィード項目は、diges適切なサイズでなければなりません - この段階で中心的な技術的な難しさは十分に第1の給電幼虫の栄養要求を満たすためにあります培養タンクに過度の廃棄物を作成せずに、ほぼ連続的に魅力的、および使用可能なtible、。歴史的にこのルーチン水交換^8,9とともに、タンクで魚に餌の多数の少量を提供することで、一般的に達成されました。これらの方法はある程度成功しているが、それらは、非効率的で高い労働投入を必要とし、唯一の変数と成長と生存¹⁰の制限されたレートを返します。

自然界では、ゼブラフィッシュの幼虫は、おそらく水柱¹¹に豊富に小さな動物プランクトンの存在を餌に。このため、このようなゾウリムシ 、ワムシ、およびアルテミアなどのライブフィードを組み込むlarvicultureプロトコルは、通常^、7最も効率的です。 2010年、最もよく、共著者は、外因性の摂食¹²の最初の5日間塩水ワムシと一緒に静的な、汽水水に幼虫のゼブラフィッシュを成長させることが可能であることを実証しました。このアプローチは、どのハーネスエスワムシ培養の自然な高生産性が低い労働投入^12,13と幼虫の成長および生存の収率が非常に高い料金、水を汚染することなく、十分な、栄養価の高い獲物を提供します。近年では、世界中の研究室の数は増加し、このプロトコルのバリエーションを採用しており、その多くが今保育園のシステム^{14をサポートするために、}連続的にワムシを培養しています。

過去数年にわたり、ワムシ/ゼブラフィッシュpolycultureとワムシ生産の両方のための方法は、洗練され、より標準化されたと容易に拡張可能になるように改善されました。この記事では、1のためのステップバイステップの手順）は、連続かつ堅牢なワムシの生産と2）外因性の給餌の最初の5日間魚の力強い成長をサポートするために使用ワムシ/ゼブラフィッシュpolycultureシステムの確立を提供します。

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プロトコル

1.ワムシ文化

1. 100 L培養容器を用いて培養システムの基本コンポーネント
   1. ワムシ培養のセットアップのためのすべてのコンポーネントを収集します。ワムシ培養セットアップはワムシを成長させるために培養容器（CV）で構成されています。送り出しのワムシ（送り出し培養容器、FCV）を維持するために、同様の容器。藻類の供給混合物（AFM）を格納するための丸底孵化瓶（貯水池、FRフィード）。 CV、FCVおよびFRを通気するための空気供給（AS）; CVとFCVに藻フィードの配信を制御するために、測光タイマー（PMT）と蠕動ポンプ。 CVの内側に座って、フロス粒子フィルタ（FPF）。
      注 ：サプライ品およびコンポーネントの完全なリストは、 物質一覧に記載されています。
2. コンフィギュレーション
   1. 文化が簡単に収集続きに嵌合ドレインを経て収穫することができるように、スタンドまたはテーブルの上にCVとFCVを昇格ainer（ 図1）。各培養容器内の剛性チューブの長さにASを接続するための柔軟な空気供給チューブを使用してください。チューブは、CVやFCVの底に空気を提供するのに十分な長さであることを確認してください。
   2. AFMが含まれているFRの下まで延びて、剛性チューブの長さにASを接続するために小容量のエアラインを使用してください。空気の流れを調整するために、各エアラインにバルブを取り付けます。飼料供給チューブとのPMTにFRを接続し、上部付近に、CV / FCVの側面に開けた穴に、PMTからチューブを実行します。 図1。
3. 起動
   1. 逆浸透水（RO）で使用可能な容量の90％に培養容器を埋めます。 ROが使用できない場合は、きれいな、脱塩素水道水を使用します。しかし、バイオセキュリティのリスク評価には、潜在的に病原性生物が源水に存在しないことを確実にするために実行する必要があります。注：このような分析を行うことができますいずれかの資格を水試験所によって。
   2. 15グラム/ Lの塩分濃度に達するように水槽塩と培養容器の水を用量。それは「ローリング沸騰」を維持す​​るように容器内に空気の流れを設定し、それは完全に通気することによって溶解されるまで、ゆっくりと培養容器に一定量の塩を加えます。それは完全に酸素化であることを確実にするために> 1時間水に空気​​を混入続けます。
   3. 藻類の供給混合物を作ります。クリーンの3リットルに、新鮮な（0 ppm）で水を脱塩素アンモニア中和剤（ナトリウムhydroxymethylsulfonate）の_NaHCO 3および100グラムの100グラムを追加します。この最後の試薬は、培養器材の消毒から水道水や漂白剤残留物から残留塩素を中和するという付加的な利点を提供します。これは、これらの化合物が完全に溶解されることを保証することが重要です。そして、藻類の濃縮物（バイオマス乾燥重量〜15％）の1 Lを追加します。 4℃でFRおよびストアへの供給混合物を追加します。
   4. 千万 - 5のスターター培養物を追加します。 通気さ15グラム/ Lの塩分の水を含むCVにBrachionus plicatilisワムシ。ワムシは、出荷または貯蔵中に冷却されている場合、それらは以下のようになり、徐々に培養容器内の水の温度に順応させ（30分以上の間）（25 - 27゜C）。
   5. PMTの電源をオンにし、ワムシ培養容器内に藻フィードをポンピング開始。 〜藻類供給混合物の1.6ミリリットル、1日あたり、培養中に百万ワムシごとに配信されるように、PMTのタイマー機能を使用すると、藻類の供給混合物の送達速度を設定します。 24時間の期間にわたって定期的に少量ずつ授乳を配布。授乳より頻繁に、より良いです。
   6. 手動で設定された期間（ 例えば、1分）のためにPMTをオンにしてポンプの吐出流量を校正し、メスシリンダーやビーカーにこのインターバルの間にポンプ藻類を収集します。例えば、PMTの用量藻類5mlの1分であれば、線量率は次のようになります5 mlの藻類/分。
   7. 1.6ミリリットルによって、何百万人で、現在のワムシの数を乗じて、必要な毎日の供給速度を計算します。例えば、億ワムシの人口サイズのワムシ培養の1日あたりの供給の〜160ミリリットル（100×1.6 ml）を必要とするであろう。
   8. 24時間の期間を通して一定の間隔で合計一日の供給要件を投薬するPMTを設定します。例えば、の送達は、160 mlの総毎日の送り量は、部分に5 mlの4分間/分の投薬ポンプ速度とPMTのセットを使用して、24時間の期間にわたって一回3時間、毎日8回（5を送達することができml /分×4分= 20ミリリットル×8授乳= 160ミリリットル）。
   9. 収穫前に、72時間 - それは必要な人口を生成するまでの文化は一般的に48のために、成長できるようにします。 24時間で、最大始動後培養容器にフロス粒子フィルタを追加して、通常の保守を開始します。
4. メンテナンス
   注：文化は継続的に動作し、routinが必要です理想的には、次の順序で、毎日同じ時刻に行われるべきである電子整備。
   1. クリーンで利用可能な容量の90％にFCVを記入し、10グラム/ Lの水族館塩を投与された、新鮮な水を脱塩素。水が十分に混合すること、及び塩の全てが完全に溶解していることを確認してください。それは「ローリングボイル」を維持す​​るように容器内に空気の流れを設定します。屈折計で塩分を測定し、塩分濃度が10g / Lであることを確認してください。この目標を達成するために、それを超えない重要なことです。
   2. 文化の異なる部分から、3ミリリットルホールピペットやautopipettorを使用して、各 - その後、2の3つのサンプルを収集し、文化が十分に混合されていることを確認します。CVにおけるワムシのサンプル。これらのサンプルは、便利なサイズ（ 例えば、10 ml）をチューブまたはバイアルに結合します。
   3. それは、解剖顕微鏡下で可視化することができるように、ペトリ皿に合わせたサンプルを2ml - トランスファー1。文化の品質をチェックします（の振る舞い​​を泳ぎますワムシ、切り離された卵の存在、汚染原虫）。
   4. 50％Lugols試料にヨウ素溶液100μlを加えることによって、残りの混合試料中のワムシを固定します。秒以内にLugolsを添加した後、水泳を停止するにはワムシを観察します。さて、簡単にワムシを数えます。
      注：エタノール、希釈漂白剤、または酢はLugolsの代わりに使用することができます。酢（2滴/ 10 ml）をあることの利点を有している非危険、およびワムシの契約をすることはできません漂白剤とヨウ素溶液などの記憶装置に強度を失うので、繊毛のコロナと「足」は、拡張のままではなく、動物がより自然に見えます。
   5. その後すぐにプラスチック製のピペットで〜2ミリリットルのサブサンプルを取り、（固定化されたワムシは急速に沈降する）、サンプルが十分に混合されていることを確認し、Sedgewick-ラフターカウントスライドに1ミリリットルを分配（20×50 1 mmの正方形）（ 図2 ）。解剖や化合物の顕微鏡を使用して、無傷のワムシをカウントし、トンこれらのワムシ（図2）に接続されている卵のotal数。 〜100ワムシをカウントするために、必要に応じてスライド領域の多くを数えます。 1ml当たりのワムシの数を計算して、スプレッドシートやログブックでこれを記録します。
   6. CVにおけるワムシの量の収穫は〜30％：、空気供給およびフロスフィルターを取り外し、ゆっくりとCVの下部にあるバルブを開け、水が53ミクロンメッシュスクリーンでプランクトンのコレクタに流入することを可能にします。バケツやドレインにフィルタリングした後、集電体の底から流れ出る水を収集します。ワムシの損傷を防ぐために、適度な流れに優しいを使用してください。ワムシは、画面上で乾燥させないでください。
   7. 一貫性の理由から、毎日ワムシの標準数のFCVを確立することが望ましいです。したがって、既知のCVのワムシ密度と収穫量に基づいて、一貫性の最終密度を達成するために、FCVの総音量を調整（ 例えば 、1500ワムシ/ mlで）。収穫ロティを追加FCVへFERSは：（ - 15グラム/ Lの10）静かにきれいな海水で満たされた洗浄ボトルを使用して、コレクション画面からワムシを転送します。 FCVの上に画面を反転し、食塩水の穏やかな流れでFCVにワムシを洗います。 FCVへの供給（一日あたり百万ワムシ当たり〜1.57ミリリットル）を提供するためのPMTを開始します。
   8. きれいな、柔らかいナイロンブラシやスクラブパッドでCVの内部全体をスクラブ。
   9. 水の量を置き換えるために5ガロンのバケツにきれいなRO水の測定量に塩の適切な量を添加することにより、15グラム/ Lの水の新しいミックスを作る収穫する失いました。バケツの水に塩を加え、完全に溶解するまで激しく攪拌した後、CVに追加します。
   10. シンクに高圧スプレーを使用して、それは破片がなくなるまでフロスフィルターを洗浄した後、CVにそれを返します。
   11. ワムシ/ mlの毎日の数に応じて、各投与イベントの持続時間を変更することにより、CVに送達藻類の供給量を調整します。配信される飼料の適切な量を決定するために、上記のステップ1.3.8で提供さの計算を使用してください。
   12. 約24時間後、プロセスを繰り返します。上記の（ - 1.4.10 1.4.2ステップ）と同様に（前日に不要であった）、FCVに残っているワムシを収穫することにより開始します。新鮮な、きれいな脱塩素水（5グラム/ Lの塩）の2リットルでそれらを濃縮します。これらは、バックアップ電源として4℃で保存するか、このプロトコルに記載されるものを超えて、魚の後の段階を供給するために使用することができます。
       注：このプロトコルは、2まで許可 - CVにおけるワムシが深刻な結果なしで収穫の省略を許容することができるので、（通常の自動給紙に）減少培養維持の3日間。

2. Polyculture

1. セットアップ
   1. ティーストレーナーを通して生成された胚を注ぎ、その後静かに滅菌FISですすぐことにより産卵イベントからゼブラフィッシュの胚を収集時間、水（または適切に調整され、溶液の他の非汚染源、 例えば、胚培地、E3など）ペトリ皿に洗浄瓶から。
   2. 5日間皿当たり50胚 - 40の密度でペトリ皿中で28℃ - 25で胚を培養します。
   3. 5日後に受精、または孵化した幼虫の90％以上が積極的に水柱の中に泳いでいるのpolycultureフェーズを開始します。
2. 接種
   1. 3.5 L保育園タンクにFCVから直接ワムシ培養液500ミリリットルを追加します。ワムシ培養水を含めることはpolyculture中ワムシの栄養成分を維持藻類フィードを提供します。
   2. ゆっくり保育園タンクに1ペトリ皿から幼虫を注ぎます。何の幼虫が皿に残っていないことを確認してください。
   3. 1 Lの最終体積と最終秒に到達するためにタンクに再循環システムまたは専用の水源からのクリーンな、コンディショニング魚水500mlを加えます5 G / Lのalinity。
      注：塩分は塩分<2グラム/ Lの場合> 7グラム/ Lとワムシの生存率はマイナスの影響を受けるの場合はゼブラフィッシュの幼虫の生存率がマイナスの影響を受けるため、この塩分濃度は非常に重要です。
3. Polyculture段階
   注：polyculture段階は（日5-9受精後に対応し、5日間の合計）までの4日後の接種に続くべきです。
   1. ワムシや魚が存在し、成長していることを確認するために、この期間中に少なくとも1日1回あたりpolycultureタンクを確認します。ワムシは水柱全体に表示されていることを確認してください。 fishsはワムシの中で泳いで、水柱の中にも表示されていることを確認してください。
   2. タンクを介して通常の水の流れを開始します。スクリーンを配置したり、タンクからフラッシュされない幼虫を確保するための排水口の上にバッフル。
      注：この段階の終わりに、魚は、 アルテミアのようなより大きな獲物のアイテムを消費するのに十分な大きさになります125ミクロン - 75のサイズ範囲のノープリウスまたは処理フィード項目。
      注：代表polycultureタンク内のワムシ個体群動態はステップ1.4.2で説明したのと同じ方法で、タンクからワムシをカウント/サンプリングによって測定した - 1.4.5。それが完了するまでこれがpolycultureフェーズの開始から一日一回行われました。

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結果

ここに記載の連続ワムシの培養システムは動的であり、そして毎日の給餌、収穫率のばらつきがある場合ワムシ数が経時小さい程度に変動することは正常です。ボストン小児病院での養殖施設での積極的な文化の一つでワムシの人口は、上記のように維持し、30日（ 図3）をモニターしました。この期間中の平均培養密度は1330ワムシ/ mlの最大値及び510ワ?...

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ディスカッション

魚を養うために、連続ワムシ培養系の確立と維持、及び同タンク内のワムシと一緒に最初に送りゼブラフィッシュの幼虫を培養：早期幼虫のゼブラフィッシュを供給するためのワムシpolyculture方法の実装を成功させるには、二つのタスクのための有効なプロトコルが必要です。

最初のローレンスおよび共著者^14で説明したゼブラフィッシュの研究室用の連続塩水?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel	Aquaneering	Custom	Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD	Grainger	38M003	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing	Cole Parmer		Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 million	Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb tub	Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S25533B	pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter bag	Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz bottle	All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket	Grainger Supply	43Y530	Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute	Fisher Scientific	S99481	Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer	Kitchenworks	971972	Used for collecting zebrafish embryos after spawning