Yetiştirme İlk Besleme Zebra balığı için komple ve Güncelleme "Rotifer Polikültür Metodu"

Özet

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Özet

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio), bilimsel disiplinlerin giderek artan sayıda kullanılan bir seçkin laboratuvar hayvanları da dahil olmak üzere, ancak gelişim genetiği, toksikoloji, davranış, yetiştiricilik, rejeneratif biyoloji ve birçok insan bozukluklarının ¹ modellenmesi ile sınırlı değildir ^{- 5.} Türlerin laboratuarda bakımı nispeten kolay olmasına rağmen, kendi kültürlerine ⁶ ile ilgili yönetim zorlukları bir dizi vardır. Bunların en göze çarpan balık ilk gaz mesane enflasyon ⁷ sonraki beslemeye başlar, özellikle larva yetiştiriciliği olduğunu. Büyüme 5 gün özellikle kritik ⁷ olmak - Normal, kontrollü koşullar altında, bu gelişimsel olay aşağıdaki 3 5 ~ at gün sonrası döllenme (dpf) oluşur. Yem öğeleri, Diges uygun büyüklükte olmalıdır - bu aşamada merkezi teknik zorluk yeterince birinci besleme larvaların beslenme ihtiyaçlarını karşılamak içinkültür tankları aşırı atık oluşturmadan neredeyse sürekli olarak cazip ve uygun ludur,. Tarihsel bu rutin su değişimi ^8,9 ile birlikte, tanklarda balık yem sayısız küçük miktarlarda sunarak genellikle elde edilmiştir. Bu yöntemler, bir dereceye kadar başarılı olsa da, bunlar, verimsiz yüksek işçilik girdileri gerektirir ve sadece değişken ve büyüme ve hayatta kalma ¹⁰ sınırlı fiyat döndürür.

Doğada, Zebra balığı larvaları muhtemelen su kolonu ¹¹ bol küçük zooplankton mevcut beslenirler. Bu nedenle, bu tür Paramecium, rotifer ve Artemia olarak canlı yayınları dahil larva protokolleri genellikle ⁷ en verimli. 2010 yılında, En İyi ve ortak yazarlar bu eksojen beslenme ¹² ilk 5 gün tuzlu su rotifer ile birlikte statik, tuzlu suda larva zebrafish büyümek mümkün olduğunu gösterdi. Koşum Bu yaklaşım,es rotifer kültürlerin doğal yüksek verimlilik, düşük emek girdisi ^12,13 ile larva büyüme ve hayatta kalma verimleri çok yüksek fiyatlar, su kirletmeden bol, oldukça besleyici av sağlamak. Son yıllarda, tüm dünyada laboratuvarlar giderek artan sayıda, bu protokolün varyasyonlarını benimsemiş ve birçok şimdi yetiştirme sistemlerinin ¹⁴ desteklemek için sürekli bir şekilde rotifer kültüre edilir.

Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, rotifer / Zebra balığı polyculture ve rotifer üretimi hem yöntemleri rafine ve daha standart ve kolayca ölçeklenebilir olma geliştirilmiştir. Bu makalede, 1 için adım adım yönergeler) sürekli ve sağlam rotifer üretimi ve 2) eksojen beslenmenin ilk 5 gün balık sağlam büyümeyi desteklemek için kullanılan rotifer / Zebra balığı polikültür sisteminin kurulmasını sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Rotifer Kültürü

1. 100 L Kültür Gemi kullanarak Kültür Sisteminin Temel Bileşenleri
   1. Rotifer kültür kurulumu için tüm bileşenleri toplayın. Rotifer kültür kurulum rotifer büyümek için bir kültür kabına (CV) oluşur; Benzer bir kap çıktıya da rotatorların (çıktıya da kültür kabı, FCV) korumak; yuvarlak dipli bir kuluçka kavanoz yosun yem karışımı (AFM) depolanması için (Reservoir, FR Yem); bir hava beslemesi (AS) CV, FCV'nin ve FR havalandırmak için; CV ve FCV içine yosun yem verilmesini kontrol etmek için bir ölçüm zamanlayıcısı (PMT) ile bir peristaltik pompa; ve CV içinde oturur bir ipi partikül filtresi (FPF).
      NOT: malzeme ve bileşenlerinin tam listesi Malzeme Listesi'nde sağlanmaktadır.
2. Yapılandırma
   1. Kültürler kolayca toplama cont içine uydurma bir drenaj yoluyla hasat edilebilir ve böylece bir stand veya masa üzerinde CV ve FCV ElevateAiner (Şekil 1). Her bir kültür kabı içinde sert bir boru uzunluğu konusundaki bağlamak için esnek bir hava besleme hortumu kullanın. Boru CV veya FCV altına hava sağlamak için yeterince uzun olduğundan emin olun.
   2. AFM içeren FR altına uzanan sert bir boru uzunluğu AS bağlanmak için bir küçük kapasiteli hava hattı kullanın. Hava akışını düzenleyen, her hava hattına bir valf takın. Besleme boru ile PMT ile FR bağlayın ve üstüne yakın, CV / FCV'nin tarafına açılan bir deliğe PMT hortumunu çalıştırın. Şekil 1.
3. Başlamak
   1. Ters osmoz, su (RO) ile birlikte kullanılabilir hacmi% 90 kültür kabı doldurun. RO mevcut değilse, temiz, dechlorinated belediye su kullanın; Bununla birlikte, bir biyo-güvenlik risk değerlendirmesi herhangi bir potansiyel olarak patojenik organizmalar kaynağı, su içinde mevcut olmasını sağlamak için gerçekleştirilmelidir. NOT: Bu tür bir analiz gerçekleştirilebilirHerhangi bir yetkili su test laboratuarı tarafından.
   2. 15 g / L tuzluluk ulaşmak için akvaryum tuz ile kültür gemi su Doz. Bir "yuvarlanan kaynama" korur, böylece teknenin içine hava akışını alan ve tamamen havalandırma ile eriyene kadar yavaşça kültür teknesine tuz ölçülen miktarını ekleyin. Tam oksijen sağlamak için> 1 saat boyunca su havalandırma devam edin.
   3. Yosun yem karışımı olun. Temiz 3 L için taze (0 ppm) suda NaHCO ₃ 100 g ve amonyak nötrleştirici (sodyum hydroxymethylsulfonate) 100 g ilave kloru giderilmiş. Bu son reajanı kültürü ekipman sterilize musluk suyu ya da ağartma kalıntılarından herhangi bir kalıntı klor nötrleştirme edilmesi ilave yararını sağlarlar. Bu bileşiklerin tamamen eriyene olduğundan emin olmak için önemlidir. Daha sonra yosun konsantresi (biyokütle kuru ağırlık ~% 15) 1 L ilave edin. 4 ° C 'de FR ve saklamak için besleme karışımı ekleyin.
   4. 10 milyon - 5 marş kültürü ekle havalandırılmış 15 g / L tuzluluk su içeren CV Brachionus plicatilis rotifer. Rotiferler nakliye ya da depolama sırasında soğutulmuş, bunlar olmalıdır yavaş yavaş kültür kabı içinde suyun sıcaklığına alıştırıldı (30 dakika ya da daha uzun sırasında) (25-27 ° C).
   5. PMT açın ve rotifer kültürü kabına yosun besleme pompalamaya başlar. PMT zamanlayıcı özelliğini kullanarak, o ~ yosun yem karışımı 1.6 ml günde, kültürde milyon rotifer başına teslim edilir, böylece yosun besleme karışımının doğum hızını ayarlamak. 24 saatlik bir süre boyunca düzenli aralıklarla küçük porsiyonlar halinde beslenmeye dağıtın; besleme daha sık, daha iyi.
   6. El belirli bir süre (örneğin, 1 dakika) için PMT açarak pompanın teslim oranını kalibre ve bir silindire veya behere bu aralık sırasında pompalar yosun toplamak. Örneğin, PMT dozlarının alg 5 ml 1 dakika içinde, o doz hızı olurdu5 ml yosun / dakika.
   7. 1.6 ml, milyonlarca, mevcut rotifer sayısı çarpılarak gerekli günlük beslenme oranını hesaplayın. Örneğin, 100,000,000 rotifer bir popülasyon ile Rotifer kültürü ~ gün (100 x 1.6 mi) başına besleme 160 ml gerektirecektir.
   8. 24 saatlik bir süre boyunca düzenli aralıklarla günlük toplam yem ihtiyacını doz PMT ayarlayın. Örneğin, 160 ml'lik bir toplam günlük besleme miktarı teslim kısımlar halinde teslim edilebilmektedir kez 8 kez günlük 4 dakika boyunca 5 ml / dk'lık bir dozlama pompası oranı ile bir PMT seti kullanılarak bir 24 saatlik bir süre boyunca her 3 st (5 ml / dakika x 4 dak = 20 ml x 8 besleme = 160 ml) eklenmiştir.
   9. Hasat öncesi, 72 saat - bu gerekli nüfus üretir kadar kültür 48, tipik, büyümeye izin verin. 24 saatte, yukarı post-başlatmak kültür kabına ipi parçacık filtreleri eklemek ve normal bakım başlar.
4. Bakım
   NOT: Kültür sürekli olarak çalışır ve rutin gerektirirİdeal aşağıdaki sırayla, her gün aynı saatte yapılmalıdır e bakım.
   1. Temiz mevcut hacmin% 90 FCV'nin doldurun, 10 g / L akvaryum tuzları ile dozda tatlı su, kloru giderilmiş. Su kuyusu karışık olduğunu ve tuz hepsi tamamen çözülür emin olun. Bir "yuvarlanan kaynatın" korur, böylece damar içine hava akışını ayarlayın. Bir refraktometre ile tuzluluk ölçün ve tuzluluk 10 g / L olduğundan emin olun. Bunu aşmak için bu hedefe ulaşmak değil, kritik öneme sahiptir.
   2. Kültür farklı bölgelerinden gelen, 3 ml bir transfer pipet veya autopipettor kullanarak her - daha sonra 2 3 örnekleri toplamak, kültür, iyi karışmış olduğundan emin olun: CV rotifer tadına bakın. Bir tüp içinde, bu örnekleri birleştirin ve uygun boyutu (örneğin, 10 mi) şişesine yerleştirilir.
   3. Aktarım 1 - bir petri kabı üzerine birleştirilen numunenin 2 ml bir tahlil mikroskobu altında görüntülendi böylece. Kültür kalitesini kontrol edin (davranışını yüzmerotiferler, müstakil yumurta varlığı, kirletici protozoa).
   4. Örnek 50% Lugols iyot solüsyonu 100 ul ekleyerek kalan Birleştirilen numunede rotatorların hareketsiz. Saniyeler içinde Lugols eklenmesinden sonra, yüzme durdurmak için rotifer gözlemlemek. Şimdi, kolayca rotifer saymak.
      Not: Etanol, seyreltik ağartma ya da sirke Lugols yerine kullanılabilir. Sirke (2 damla / 10 ml) olmanın avantajları vardır tehlikesiz, ve rotifer sözleşme yapma olamaz ağartıcı ve iyot çözümleri gibi depolama gücünü kaybetme, böylece kirpikler corona ve "ayak" genişletilmiş kalır ve hayvanlar daha doğal görünüyor.
   5. Daha sonra hızlı bir plastik pipet bir ~ 2 ml'lik alt örnek almak, (hareketsiz rotiferler hızla yerleşmek) numune iyice karıştırılır olduğundan emin olun ve bir Sedgewick-Mertek sayma slayt içine 1 ml dağıtmak (20 x 50 1 mm kareler) (Şekil 2 ). Diseksiyon veya bileşik mikroskop kullanarak, bozulmamış rotifer ve t saymakBu rotifer bağlı yumurta otal numarası (Şekil 2). ~ 100 rotifer saymak için gerekli olarak slayt alanının kadar sayın. Ml başına rotifer sayısını hesaplayın ve bir elektronik tablo veya defterine bu kaydedin.
   6. Hasat ~ CV rotifer hacminin% 30: yavaşça CV altındaki vanayı açın, hava temini ve diş ipi filtresini çıkarın ve su 53 mikron elek ile birlikte bir plankton toplayıcıya akmasını sağlayın. Bir kova ya da drenaja filtreleme sonra kolektör altından dışarı akan suyu toplamak. Rotifer zarar görmesini önlemek için orta akışına nazik kullanın. Rotifer ekranda kurumasına izin vermeyin.
   7. Tutarlılık nedenlerden dolayı, rotiferler standart bir sayıda, her gün FCV oluşturulması tavsiye edilir. Bu nedenle, bilinen CV rotifer yoğunluğu ve hasat hacmine göre, tutarlı bir nihai yoğunluk elde etmek FCV toplam hacmini ayarlamak (örn., 1500 rotiferler / ml). Hasat roti ekleFCV için fers: (- 15 g / L 10) yavaşça temiz tuzlu su dolu bir yıkama şişesi kullanılarak tahsilat ekranından rotifer aktarın. FCV üzerinde ekranı ters çevirin ve tuzlu su hafif bir akım ile FCV'nin içine rotifer yıkayın. FCV için (~ günde milyon rotifer başına 1.57 ml) beslemeyi sağlamak için PMT başlatın.
   8. Temiz, yumuşak bir naylon fırça veya ovma pad ile CV tüm içini fırçalayın.
   9. Suyun hacmi, hasat kaybı karşılamak üzere, bir 5 galonluk bir kova temiz RO su ölçülü bir miktarda tuz, uygun miktarının ilave edilmesi ile 15 g / L su için yeni bir karışımını yapın. Kova su tuz ekleyin ve tamamen eriyene kadar kuvvetlice karıştırın ve sonra CV ekleyin.
   10. Bir lavaboda bir yüksek basınçlı püskürtme kullanarak, enkaz serbest kalıncaya kadar ipi filtreyi durulayın ve ardından CV iade.
   11. Rotifer / ml günlük sayımına göre, her dozlama olayın süresini değiştirerek CV teslim alglerin yem oranlarını ayarlayın.Teslim edilecek besleme uygun miktarını belirlemek için, yukarıdaki aşama 1.3.8 verilen hesaplamalar kullanın.
   12. Yaklaşık 24 saat sonra, işlemi tekrarlayın. Yukarıda tarif edilen (- 1.4.10 1.4.2 adımları) ile aynı şekilde (bir önceki gün için gerekli değil) FCV kalan rotatorların hasat başlayın. Taze ve temiz kloru giderilmiş su (5 g / L tuz) 2 L bunları konsantre edin. Bu yedek kaynağı olarak 4 ° C'de saklandı veya bu protokolde tarif edilenin ötesinde, balık sonraki aşamalarını beslemek için de kullanılabilir.
       NOT: Bu protokol 2 kadar izin - CV rotifer ciddi sonuçları olmadan hasat atlandığını tahammül çünkü, (normal otomatik besleme) ile azaltılmış kültür bakımı 3 gün.

2. Polikültür

1. Kurmak
   1. Nazikçe steril fis ile durulama ardından çay-süzgecinden kökenli embriyolar dökülmesi ve bir yumurtlama olayı Zebra balığı embriyolar toplayınh su (veya uygun koşullu çözümün herhangi diğer non-kontamine kaynak; örneğin, embriyo orta, E3, vb) petri kutularının içine bir yıkama şişesinden.
   2. 5 gün süre ile çanak başına 50 embriyo - 40 arasında bir yoğunlukta petri kaplarına 28 ° C - 25 ° embriyolar inkübe edin.
   3. 5 gün sonrası fertilizasyon veya yumurtadan larva% 90 daha aktif su kolonunda kadar yüzme üzerindeki polikültür fazı başlayın.
2. Aşılama
   1. Doğrudan 3.5 L kreş tankına FCV'nin gelen rotifer kültürü 500 ml ekleyin; Rotifer kültür suyun dahil polyculture sırasında rotifer besin içeriği tutar alg besleme sağlar.
   2. Yavaşça kreş tankına tek petri larvaları dökün. Hiçbir larvalar çanak kalmadığından emin olun.
   3. 1 L'lik bir son hacim ve son bir s ulaşmak için tanka bir sirkülasyon sisteminde veya özel su kaynağından, temiz durumunu balık suyu 500 ml ilave edilir5 g / L alinity.
      NOT: Bu tuzluluk Zebra balığı larvaları hayatta olumsuz tuzluluk olumsuz etkiledi olacak> 7 g / L ve rotifer hayatta ise etkilenecek çünkü kritik tuzluluk <2 g / L ise.
3. Polikültür aşaması
   NOT: polikültür fazı (gün 5-9 sonrası fertilizasyon karşılık, 5 gün toplam) en fazla 4 gün sonrası aşılama için sürmelidir.
   1. Rotifer ve balık mevcut ve büyüyen olduğundan emin olmak için, bu dönemde en az bir kez günde polikültür tankı gözlemleyin. Rotifer su kolonu boyunca görünür olduğundan emin olun. Fishs rotifer arasında yüzme, su sütunu içinde de görünür olduğundan emin olun.
   2. Tanktan normal su akışını başlatın. Bir ekran yerleştirin veya tankın dışarı atılır olmadığını larvaların sağlamak için drenaj portu üzerinden bölme.
      NOT: Bu fazın sonunda, balık, Artemia gibi daha büyük avlarını tüketmek için yeterince büyük olacak125 mikron - 75 boyut aralığında nauplii veya işlenmiş yem öğeler.
      Not: Örnek polyculture tankı içindeki rotiferin popülasyon dinamikleri adımları 1.4.2 tarif edildiği gibi aynı şekilde tanktan rotatorların / sayma örnekleme ile ölçüldü - 1.4.5. Tamamlanana kadar bu polyculture aşamasının başından itibaren günde bir kez yapılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada açıklanan sürekli rotifer kültürü sistemi dinamik ve günlük beslenme ve hasat oranlarında farklılıklar varsa rotifer numaraları zamanla küçük bir ölçüde dalgalanması için normaldir. Boston Çocuk Hastanesi su tesislerinde aktif kültürlerin bir rotiferler nüfusu, yukarıda tarif edilen şekilde hazırlanmış, 30 gün (Şekil 3) izlendi. Bu süre içinde ortalama kültür yoğunluğu 1.330 rotiferler / ml'lik bir maksimum...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Aynı tankta rotifer birlikte Zebra balığı larvaları ilk besleme balık beslemek için sürekli rotifer kültürü sisteminin kurulması ve bakımı ve kültüre: erken larva zebrafish beslenmesi için rotifer polikültür yönteminin başarılı bir şekilde uygulanması etkili iki görevler için protokoller gerektirir.

İlk Lawrence ve yazarları ¹⁴ tarafından açıklanan Zebra balığı laboratuvarlar için sürekli bir tuzlu su rotifer üretim sistemi kurulum değiştiri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel	Aquaneering	Custom	Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD	Grainger	38M003	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing	Cole Parmer		Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 million	Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb tub	Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S25533B	pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter bag	Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz bottle	All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket	Grainger Supply	43Y530	Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute	Fisher Scientific	S99481	Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer	Kitchenworks	971972	Used for collecting zebrafish embryos after spawning