양육 먼저 먹이 제브라 피쉬의 전체 및 업데이트 "로티퍼 다종 양식 방법"

요약

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

초록

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

서문

제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)는), 과학 분야의 증가에 이용 탁월한 실험 동물을 포함하지만 발달 유전학, 독성학, 행동 양식, 재생 생물학, 많은 사람의 장애 ^1의 모델링에 국한되지 ^{- 5.} 종 실험실에서 유지하기가 비교적 용이하지만, 그 배양 ^6와 연관된 관리 문제가 있습니다. 이 중 가장 눈에 띄는 물고기는 제 1 가스 방광 인플레이션 ⁷ 이후에 공급하기 시작 특히, 유생 양육이다. 성장 5 일, 특히 중요한 ^{7 인} - 정상, 통제 된 조건에서이 발달 이벤트는 다음과 같은 3가 5 ~에서 일 이후 수정 (DPF)를 발생합니다. 공급 아이템, diges 적절한 크기이어야 -이 단계 동안 중앙 기술적 어려움 적절히 제 1 급전 유충의 영양 요구를 충족하는 것이다배양 탱크에 과도한 폐기물을 만들지 않고 거의 지속적으로 매력적인, 가능한 tible,,. 역사적으로이 일상 물 교환 ^8,9과 함께 탱크에 물고기 사료의 수많은 작은 양을 제공하여 일반적으로 달성되었다. 이들 방법은 어느 정도 성공하지만, 그들은, 비효율적 높은 노동 입력을 요구하고, 전용 변수 및 성장과 생존 ^(10)의 제한 속도를 반환한다.

자연에서, 제브라 피쉬 애벌레는 아마도 물 열 ^(11)이 풍부 작은 동물성 플랑크톤의 존재에 공급. 이러한 이유로, 그러한 짚신, 피퍼 및 아테 라이브 피드를 포함 larviculture 프로토콜은 전형적으로 ⁷ 가장 효율적이다. 2010 년, 최고 및 공동 저자는 외생 공급 ^(12)의 처음 5 일 동안 바닷물 로티퍼와 함께 정적, 소금기있는 물 속에서 애벌레 제브라 피쉬를 성장 가능하다는 것을 보여 주었다. 활용이 접근,ES 로티퍼 배양의 자연 높은 생산성이 낮은 노동 투입 ^{(12, 13)와} 유생의 성장과 생존의 수익률이 매우 높은 요금, 물을 오염하지 않고 충분한, 매우 영양가있는 먹이를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 전 세계 실험실의 증가는이 프로토콜의 변형을 채택하고, 많은 사람들이 지금 보육 시스템 ^(14)을 지원하기 위해 연속적인 방식으로 로티퍼를 배양한다.

지난 몇 년 동안, 로티퍼 / 제브라 피쉬 다종 양식 및 로티퍼 생산 모두를위한 방법은 정제보다 표준화와 쉽게 확장되고 개선되었습니다. 이 기사는 1에 대한 단계별 지침) 지속적이고 강력한 로티퍼 생산과 2) 외생 공급의 처음 5 일 동안 물고기의 강력한 성장을 지원하는 데 사용되는 로티퍼 / 제브라 피쉬 다종 양식 시스템의 구축을 제공합니다.

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프로토콜

1. 로티퍼 문화

1. 100 L 배양 용기를 사용하여 문화 시스템의 기본 구성 요소
   1. 로티퍼 배양 설정을위한 모든 구성 요소를 수집합니다. 로티퍼 배양 설치는 로티퍼 성장하는 배양 용기 (CV)로 구성; 유사한 용기의 피드 아웃 피퍼 (피드 아웃 배양 용기, FCV)을 유지하는 단계; 둥근 바닥 부화 항아리 조류의 공급 혼합물 (AFM)의 저장 (저수지, FR 피드); 공기 공급 (AS)는 CV, FCV와 FR을 공기에 쐬다; CV 및 FCV로 조류 사료의 전달을 제어하기 위해 측정 타이머 (PMT)와 연동 펌프; 및 CV 안에 앉아 치실 입자 필터 (FPF).
      주 : 공급과 구성 요소의 완전한 목록은 자재 목록에 제공된다.
2. 구성
   1. 문화를 쉽게 수집 계속으로 피팅의 드레인을 통해 수확 할 수 있도록 스탠드 또는 테이블에 이력서와 FCV 상승ainer (그림 1). 각 배양 용기에 강성 튜브의 길이로 AS를 연결하는가요 성 공기 공급 튜브를 사용한다. 튜브는 CV 또는 FCV의 바닥에 공기를 제공하기에 충분히 긴 있는지 확인합니다.
   2. AFM을 포함하는 FR의 바닥까지 연장 강성 튜브 길이로 연결 AS 소용량 공기 라인을 사용한다. 공기를 조절하기 위해 각각의 공기 라인에 밸브를 설치한다. 공급 배달 튜브와 PMT에 프랑스를 연결하고 상단, CV / FCV의 측면에 드릴 구멍에 PMT에서 튜브를 실행합니다. 그림 1.
3. 시작
   1. 역삼 투 물 (RO)와 함께 사용할 수있는 볼륨의 90 %를 배양 용기를 채우십시오. RO를 사용할 수없는 경우, 청소, 탈 염소 처리시 물을 사용; 그러나, 생물 보안 위험 평가에는 병원성 유기체 원수에 존재하지 않도록 수행되어야한다. 참고 사항 : 분석이 수행 될 수있다어떤 자격을 갖춘 물 시험 기관에 의해.
   2. 15g / L의 염도 도달 수족관 소금 배양 용기 물 선량. 그것이 "롤링 종기를"유지하도록 용기 내로 공기 흐름을 설정하고 완전히 통기하여 용해 될 때까지 천천히 배양 용기에 측정 된 염의 양을 추가한다. 완전히 산소 될 수 있도록> 1 시간 동안 물을 폭기를 계속합니다.
   3. 조류 공급 혼합물을 확인합니다. 깨끗한 3 L에, 신선한 (0 PPM)는 _NaHCO3을 물 100 g 및 암모니아 중화제 (나트륨 hydroxymethylsulfonate) 100 g을 넣고 탈 염소. 이 지난 시약은 문화 장비의 살균에서 수돗물 또는 표백제 잔류 물에서 잔류 염소를 중화의 추가 혜택을 제공한다. 이것은 이들 화합물이 완전히 용해되는 것을 보장하는 것이 중요하다. 그리고 조류 농축액 (바이오 매스 건조 중량 ~ 15 %)의 1 패를 추가합니다. 4 ° C에서 프랑스와 저장소에 공급 혼합물을 추가합니다.
   4. 5-10000000의 스타터 문화 추가 포 15g / L의 염분 물을 포함하는 이력서에 Brachionus plicatilis 로티퍼. 피퍼가 운송 또는 저장 동안 차게 된 경우, 그들은되어야 서서히 배양 용기 내의 물의 온도와 같아 (30 분 이상 동안) (25-27 °의 C).
   5. PMT를 켜고 로티퍼 배양 용기에 조류 피드를 펌핑 시작합니다. PMT의 타이머 기능을 이용하여, 그 ~ 조류 사료 혼합물을 1.6 ml의 하루 배양 백만 당 피퍼 전달되도록 조류 사료 혼합물의 전송 속도를 설정한다. 24 시간 기간에 걸쳐 일정한 간격으로 조금씩 수유를 분배; 수유 더 자주, 더 나은.
   6. 수동으로 일정 기간 (예를 들면, 1 분)에 대한 PMT에 돌려 펌프의 전달 속도를 보정하고 눈금 실린더 또는 비이커에이 간격 동안 펌프 조류를 수집합니다. 예를 들어, PMT 투약 조류 5 ㎖를 1 분에 있다면, 선량률 것5 ml의 조류 / 분.
   7. 1.6 ml로, 백만, 본 피퍼의 개수를 곱하여 필요한 일일 급식 속도를 계산한다. 예를 들어, 1 억 로티퍼의 인구 규모와 로티퍼 문화는 ~ 날 (100 × 1.6 ㎖) 당 공급 160 ml의 필요합니다.
   8. 24 시간 기간에 걸쳐 일정한 간격으로 총 일일 사료 요구 선량 PMT를 설정한다. 예를 들면, 160 ml로 하루 총 공급량의 전달이 부분에서 제공 될 수 회 8 회 일일 4 분 동안 5 ㎖ / 분의 정량 펌프 속도 PMT 세트를 사용하여 24 시간의 기간 동안 매 3 시간 (5 ㎖ / 분 × 4 분 = 20 ㎖ × 8 수유 = 160 mL)을 첨가 하였다.
   9. 수확하기 전에, 72 시간 -이 필요한 인구를 생성 할 때까지 문화 (48)에 대해 일반적으로 성장하도록 허용합니다. 24 시간에서 최대 후 시작 배양 용기에 치실 입자 필터를 추가하고 일반 유지 보수를 시작합니다.
4. 유지
   참고 : 문화는 지속적으로 운영하고 routin 필요이상적으로 다음과 같은 순서로, 매일 같은 시간에 수행되어야 E 유지.
   1. 깨끗하고 가능한 볼륨의 90 %를 FCV를 작성, 10g / L의 수족관 염을 투여 신선한 물, 탈 염소. 물이 잘 혼합되어 있는지 소금의 모든 완전히 용해되어 있는지 확인합니다. 그것은 "롤링 종기"를 유지하도록 용기에 공기 흐름을 설정합니다. 굴절계와 염도를 측정하고 염도가 10g / L 있는지 확인합니다. 그것은을 초과 할이 목표를 달성하지하는 것이 중요하다.
   2. 문화의 다른 부분에서, 3 ㎖ 전송 피펫 또는 autopipettor를 사용하여 각 - 다음 2 3 샘플을 수집, 문화가 잘 혼합되어 있는지 확인 : 이력서에있는 로티퍼 샘플. 튜브에 이러한 샘플을 결합 또는 편리한 크기 (예를 들어, 10 ㎖)의 유리 병.
   3. 전사 1 - 배양 접시 상 결합 시료 2 ml를 이는 해부 현미경 하에서 가시화 될 수 있도록. 문화의 품질을 확인 (의 동작을 수영로티퍼, 분리 된 계란의 존재, 오염 원생 동물).
   4. 샘플 50 % Lugols 요오드 용액 100 ㎕를 첨가함으로써 결합 된 나머지 샘플 피퍼 고정시킨다. 초 이내에 Lugols 첨가 한 후, 수영을 중지 로티퍼를 관찰합니다. 이제 쉽게 로티퍼를 계산합니다.
      주 : 에탄올, 묽은 표백제, 식초 또는 Lugols 대신에 사용될 수있다. 식초 (2 방울 / 10 ㎖)이라는 장점이 무해, 및 피퍼 계약을 할 수 표백제 및 요오드 용액과 같은 저장 영역에 강도를 잃고, 그래서 섬모의 코로나 및 "발"확장 남아 있지 동물은 자연 보인다.
   5. 신속 플라스틱 피펫에서 ~ 2 ML의 표본을, (고정 로티퍼가 빠르게 정착 할 것이다) 시료가 잘 혼합되어 있는지 확인하고 세지-서까래 계산 슬라이드에 1 ml의 분배 (20 × 50 1 mm의 사각형) (그림 2 ). 해부 또는 복합 현미경을 사용하여, 그대로 로티퍼와 T를 계산이 로티퍼에 부착 된 계란의 otal 수 (그림 2). ~ 100 로티퍼를 계산하기 위해 필요에 따라 슬라이드 영역의 정도를 계산합니다. 피퍼 mL의 수를 계산하고, 스프레드 시트 또는이 로그 북에 기록한다.
   6. 수확 ~ CV의 로티퍼의 볼륨의 30 % : 천천히 이력서의 하단에있는 밸브를 열고, 공기 공급 및 치실 필터를 제거하고 물이 53 μm의 메쉬 스크린 플랑크톤 컬렉터로 유입 할 수 있습니다. 버킷 또는 드레인으로 여과 후 집 전체의 저부 유출 물을 수집한다. 피퍼 손상을 방지하기 위해 중간 흐름에 부드러운을 사용합니다. 피퍼가 화면에 건조 허용하지 않습니다.
   7. 일관성 이유로, 피퍼의 표준 번호 매일와 FCV를 확립하는 것이 바람직하다. 따라서, 공지의 CV 로티퍼 밀도 및 수확 부피를 기준으로, 일관된 최종 농도를 달성하기 위해 FCV의 전체 볼륨을 조절 (예., 1500 피퍼 / ㎖). 수확 로티 추가FCV에 FERS는 (- 15 그램 / 리터 10) 조심스럽게 깨끗한 바닷물로 채워진 세척 병을 사용하여 수집 화면에서 로티퍼를 전송합니다. FCV를 통해 화면 전환과 소금물의 부드러운 스트림 FCV에 로티퍼를 씻는다. FCV에 (~ 하루 만 로티퍼 당 1.57 ㎖) 피드를 제공하는 PMT를 시작합니다.
   8. 깨끗하고 부드러운 나일론 브러시 나 스크럽 패드와 CV의 전체 내부를 스크럽.
   9. 물의 양이 수확 손실 대체 5갤런 양동이 깨끗한 RO 물의 측정 된 양의 소금을 적당량 첨가하여 15g / L 물의 새로운 혼합물을 만든다. 양동이에 물에 소금을 추가하고이 완전히 용해 될 때까지 격렬하게 교반 한 후 이력서에 추가 할 수 있습니다.
   10. 싱크대에 고압 스프레이를 사용하여, 그것은 파편 될 때까지 치실 필터를 씻어하고 이력서에 반환.
   11. 피퍼 / ㎖의 일일 횟수에 따라, 각각의 투여 이벤트의 기간을 변경하여 CV로 전달되는 조류의 공급 속도를 조정한다.전달되는 사료의 적절한 양을 결정하기 위해 위의 단계 1.3.8에서 제공 계산을 사용한다.
   12. 약 24 시간 후, 프로세스를 반복합니다. 전술 한 (- 1.4.10 1.4.2 단계)와 동일한 방식으로 (전날에 필요하지 않은)에 잔류 FCV 피퍼를 수확하여 시작. 신선하고 깨끗한 물 탈 염소 (5g / L의 염)의 2 L에서 그들을 집중. 이러한 백업 전원으로 4 ℃에서 저장되거나이 프로토콜에서 설명하는 것 이상의, 물고기의 후기 단계를 공급하는데 사용될 수있다.
       참고 :이 프로토콜은 2 개까지 허용 - 이력서에있는 로티퍼가 심각한 결과없이 수확의 생략을 허용 할 수 있기 때문에, (일반 자동 급지) 감소 문화의 유지 보수의 3 일.

2. 다종 양식

1. 설정
   1. 부드럽게 멸균 FIS와 린스 후 차 여과기를 통해 만들어지는 배아를 주입에 의해 산란 이벤트에서 제브라 피쉬 배아를 수집시간 물 (또는 적절하게 조절 솔루션의 다른 비 오염 소스, 예를 들어, 배아 매체, E3 등) 배양 접시에 세척 병.
   2. 5 일간 접시 당 50 배아 - (40)의 밀도로 배양 접시에 28 ° C를 - 25 배아를 품어.
   3. 5 일 후 수정, 또는 부화 유충의 90 % 이상이 적극적으로 물 칼럼에서 수영의 다종 양식 단계를 시작합니다.
2. 접종
   1. 직접 3.5 L 보육 탱크로 FCV에서 로티퍼 문화의 500 ML을 추가; 로티퍼 배양 물을 포함은 다종 양식 동안 로티퍼의 영양 성분을 유지 조류 피드를 제공합니다.
   2. 조심스럽게 보육 탱크에 하나의 배양 접시에서 애벌레를 붓는다. 더 애벌레 접시에 남아 있는지 확인합니다.
   3. 1 L의 최종 부피 및 마지막 S 도달하는 탱크로 재순환 시스템 또는 전용의 급수 원으로부터 깨끗한 조건 물고기 물 500㎖를 추가5g / L의 alinity.
      참고 :이 염분은 제브라 피쉬 애벌레의 생존에 부정적인 염분에 부정적인 영향을받을 것입니다> 7g / L 및 로티퍼 생존 경우 영향을받을 수 있기 때문에 중요하다 염분 <2g / L 경우.
3. 다종 양식 단계
   참고 : 다종 양식의 단계 (5-9 일 후 수정에 해당하는 5 일 총)까지 4 일 후 접종 지속해야한다.
   1. 로티퍼와 물고기가 있고 성장하고 있는지 확인하기 위해이 기간 동안 적어도 하루에 한 번 다종 양식 탱크를 관찰합니다. 피퍼가 물 열을 통해 볼 수 있습니다 있는지 확인합니다. fishs가 로티퍼 중 수영, 물 열 내에 볼 수 있는지 확인합니다.
   2. 탱크를 통해 정상적인 물 흐름을 시작합니다. 화면을 놓거나 탱크에서 플러시되지 않은 유충을 보장하기 위해 드레인 포트를 통해 배플.
      주 :이 단계의 끝에서, 물고기는 아테 같은 큰 먹이 아이템을 소비 할 수 있도록 충분히 커야 할 것이다125 μm의 - (75)의 크기 범위 유생 또는 가공 공급 아이템.
      주 : 대표 다종 탱크 내의 로티퍼 인구 역학이 단계 1.4.2에서 설명 된 바와 같이 동일한 방식으로 탱크로부터 피퍼 카운팅 / 샘플링하여 측정 하였다 - 1.4.5. 그것이 완료 될 때까지 다종 단계의 처음부터 하루에 한번 수행 하였다.

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결과

여기에 기술 된 연속 로티퍼 배양 시스템은 동적이며, 매일 공급 및 수확 속도의 변동이있는 경우 로티퍼 번호는 시간이 지남에 작은 정도 변동하는 것은 통상이다. 보스턴 어린이 병원 양식장의 활성 배양 중 하나 피퍼의 인구는, 상기와 같이 유지 30 일 (도 3)에 대해 모니터링 하였다. 이 기간 동안 배양 평균 밀도는 1,330 피퍼 / ml의 최대 및 피퍼 510 / ml의 최?...

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토론

같은 탱크에 로티퍼와 함께 zebrafish의 애벌레를 처음 공급 물고기를 공급하는 연속 로티퍼 배양 시스템의 구축과 유지 보수 및 배양 : 초기 애벌레 제브라 피쉬를 공급하기위한 로티퍼의 다종 양식 방법의 성공적인 구현은 효과적인 두 가지 작업을위한 프로토콜을 필요로한다.

처음 로렌스와 공동 저자 ^(14)에 의해 설명 된 제브라 피쉬의 실험실 연속 바닷물 로티퍼 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel	Aquaneering	Custom	Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD	Grainger	38M003	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing	Cole Parmer		Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 million	Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb tub	Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S25533B	pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter bag	Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz bottle	All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket	Grainger Supply	43Y530	Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute	Fisher Scientific	S99481	Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer	Kitchenworks	971972	Used for collecting zebrafish embryos after spawning