Полный и обновленный "Коловратки поликультуры Метод" для выращивания первого кормления данио рерио

Резюме

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Аннотация

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Введение

Данио (Danio rerio) является выдающимся лабораторным животным используется в растущем числе научных дисциплин, в том числе, но не ограничиваясь генетики развития, токсикологии, поведения, аквакультуры, регенеративной биологии и моделирования многих человеческих расстройств ^{1 - 5.} Хотя вид сравнительно легко поддерживать в лаборатории, существует ряд проблем управления, связанных с их культурой ^6. Наиболее известным из них является личиночной разведение, особенно когда рыба впервые начинают кормить после инфляции газ мочевого пузыря ^7. В нормальных условиях, контролируемых, это событие происходит в развития ~ 5 дней после оплодотворения (DPF), с учетом следующих 3 - 5 дней роста является особенно критической ^7. Центральный техническая трудность на этом этапе является адекватно отвечать питательные требования первого личинок кормления - элементы подачи должна быть соответствующего размера, Digesвержены, привлекательный, и доступны на почти постоянной основе, не создавая чрезмерного отходов в культивирования танков. Исторически это было достигнуто, как правило, путем предоставления многочисленных небольших количеств корма для рыбы в резервуарах, наряду с обычной водообмена ^8,9. Хотя эти методы в какой-то степени успешными, они неэффективны, требуют высоких затрат труда, и вернуться только переменную и ограниченные темпы роста и выживания ^10.

В природе, по-видимому данио личинки питаются обильными небольшой зоопланктона настоящее время в толще воды ^11. По этой причине, larviculture протоколы, которые включают живые каналы, такие как Рагатесшт, коловраток и Artemia обычно наиболее эффективным ^7. В 2010 году, лучшее и соавторы показали, что можно было выращивать личинок данио в статическом, солоноватой воды наряду с морских коловраток за первые 5 дней экзогенного питания ^12. Этот подход, который использоватьES естественный высокая производительность коловраток культур, чтобы обеспечить достаточное, очень питательный добычу, не загрязняя воду, дает очень высокие темпы роста личинок и выживания с низкой трудоемкости ^12,13. В последние годы все большее число лабораторий по всему миру приняли изменения этого протокола, и сейчас многие культивирования коловраток в непрерывном режиме, чтобы поддержать детские системы ^14.

За последние несколько лет, как методы коловратки / данио поликультуры и производства коловратки были уточнены и улучшены, чтобы стать более стандартизированными и легко масштабируемым. Эта статья предусматривает шаг за шагом инструкции для 1) непрерывный и надежный производства коловраток и 2) создание коловратки / данио системы поликультуры используется для поддержки высоких темпов роста рыбы в течение первых 5 дней экзогенного питания.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Коловратки Культура

1. Основные компоненты системы культуры, используя сосуд 100 л культуры
   1. Соберите все компоненты, необходимые для установки коловраток культуры. Установка коловраток культура состоит из сосуда для культивирования (CV), чтобы расти коловраток; подобный сосуд для поддержания feedout коловраток (feedout культура сосудов, FCV); с круглым дном вылупления банку (поток водохранилище, FR) для хранения корма водоросли смеси (АСМ); подачи воздуха (АС) для аэрации резюме, FCV и FR; перистальтический насос с таймером замера (ФЭУ) для управления доставку корма водорослей в CV и FCV; и фильтр нить частиц (FPF), который сидит внутри CV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полный список расходных материалов и компонентов обеспечивается в список материалов.
2. Конфигурация
   1. Поднимите резюме и FCV на стенде или столе так, что культуры могут быть легко собраны с помощью дренажный штуцер в сборник продолжениеainer (Рисунок 1). Использование гибкий шланг подачи воздуха для подключения как к длине жесткой трубке в каждом культуральном сосуде. Убедитесь, что трубка достаточно долго, чтобы подавать воздух в нижней части CV или FCV.
   2. Использование воздушной линии малой мощности для подключения как к длине жесткой трубке, который простирается до нижней части FR, содержащей AFM. Установите клапан в каждой воздушной линии для регулирования потока воздуха. Подключите FR на ФЭУ с доставкой корма трубки, и запустить трубопровод от ФЭУ в отверстие, просверленное в стороне CV / FCV, ближе к началу. Рисунок 1.
3. Запускать
   1. Заполните культурального сосуда до 90% доступного объема с обратным осмосом воды (RO). Если РО не доступен, используйте чистую, дехлорированию муниципальной воды; Однако, оценка риска биологической защиты должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что никакие потенциально патогенные организмы не присутствуют в исходной воде. ПРИМЕЧАНИЕ: Такой анализ может быть проведенлюбой квалифицированный тестирования воды лаборатории.
   2. Доза культурального сосуда воду с аквариума соли достичь соленость 15 г / л. Установите воздушный поток в емкость так, чтобы она поддерживает "кипения", а затем медленно добавляют измеренное количество соли в сосуде для культивирования, пока не растворится полностью аэрацией. Продолжить аэрации воды в течение> 1 часа, чтобы гарантировать, что он полностью кислородом.
   3. Сделайте смесь корма водоросли. К 3 л чистой, свежей дехлорированию (0 частей на миллион) воды добавить 100 г NaHCO ₃ и 100 г аммиака (нейтрализатор hydroxymethylsulfonate натрия). Этот последний реагент обеспечивает дополнительное преимущество нейтрализации остаточного хлора из водопроводной воды или остатков отбеливающих веществ из дезинфекции питательной оборудования. Это имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы эти соединения полностью растворяют. Затем добавить 1 л концентрата водорослей (биомассы сухого веса ~ 15%). Добавить сырьевой смеси в FR и хранят при температуре 4 ° С.
   4. Добавить закваски 5 - 10 млн коловратки Brachionus plicatilis к резюме, содержащие газированную 15 г / л Соленость воды. Если коловратки были охлажденным во время транспортировки или хранения, они должны быть постепенно (в течение 30 мин или дольше) приспособиться к температуре воды в культуральный сосуд (25 - 27 ° C).
   5. Включите PMT и начать прокачку канал водорослей в коловраток сосуда для культивирования. Использование функции таймера ФЭУ, установить скорость доставки подачи смеси водорослей, так что ~ 1,6 мл водорослей исходной смеси подается на миллион коловраток в культуре, за день. Распределите кормление небольшими порциями через равные промежутки времени в течение периода 24 ч; Чем чаще кормления, тем лучше.
   6. Калибровка скорости доставки насоса вручную поворотом на ФЭУ в течение установленного периода (например, 1 мин) и собирают водоросли, что насосы в течение этого интервала в мерный цилиндр или стакан. Например, если в дозах PMT 5 мл водорослей в 1 мин, затем дозы были бы5 мл водорослей / мин.
   7. Рассчитать необходимое ежедневное скорость подачи путем умножения количества коловраток, присутствующих в миллионах, в 1,6 мл. Например, коловратка культура с численности населения 100 млн коловратках потребует ~ 160 мл корма в сутки (100 х 1,6 мл).
   8. Установите PMT дозировать общую суточную потребность корма на регулярные промежутки времени в течение периода 24 ч. Например, доставка из ежедневного количества корма 160 мл может быть доставлено в порциями каждые 3 ч в течение 24 ч с использованием набора PMT со скоростью дозирующего насоса 5 мл / мин в течение 4 мин, 8 раз в день (5 мл / мин х 4 мин = 20 мл х 8 кормление = 160 мл).
   9. Разрешить культура расти, пока не генерирует необходимую населения, как правило, в течение 48 - 72 ч, до сбора урожая. В 24 ч после запуска, добавьте ваты фильтры частиц в сосуд для культивирования и начать нормальную обслуживания.
4. Обслуживание
   Примечание: Культура работает в непрерывном режиме и требует Routinе технического обслуживания, что в идеале должна быть выполнена в то же время каждый день, в следующей последовательности.
   1. Заполните FCV до 90% доступного объема чистой, дехлорированная пресную воду, которым вводили 10 г / л аквариумной соли. Убедитесь, что вода хорошо перемешивается, и что все соли полного растворения. Установите поток воздуха в сосуд таким образом, что он поддерживает "кипеть" подвижного. Измерить соленость при помощи рефрактометра и гарантировать, что соленость 10 г / л. Это имеет решающее значение для достижения этой цели и не превышать его.
   2. Образец коловраток в резюме: Убедитесь, что культура является также смешанные, затем собрать 3 образца в 2 - 3 мл каждого помощью пипетки передачи или autopipettor, из разных частей культуры. Объедините эти образцы в трубке или флакон удобного размера (например, 10 мл).
   3. Передача 1 - 2 мл комбинированного образца на чашку Петри таким образом, чтобы его можно визуализировать при вскрытии микроскопом. Проверьте качество культуры (плавание поведение изколовратки, наличие отдельных яиц, загрязняя простейшие).
   4. Иммобилизации коловраток в оставшихся в сочетании образца добавлением 100 мкл 50% -ного раствора йода Lugols к образцу. В течение нескольких секунд после добавления Lugols соблюдать коловраток, чтобы остановить плавание. Теперь, легко подсчитать коловраток.
      Примечание: этанол, разбавленный отбеливатель или уксус можно использовать вместо Lugols. Уксус (2 капли / 10 мл) имеет преимущества быть неопасные, не теряя силы в хранении как отбеливатель и йода решений может, и не делает договор коловратки, поэтому корона ресничек и "ноги" остаются продлен и животные выглядят более естественно.
   5. Обеспечить, чтобы образец хорошо перемешивается (иммобилизованные коловратки будет быстро оседают), а затем быстро принимать мл подвыборку ~ 2 в пластмассовом пипетки и выдаваемых 1 мл в Седжвик-стропильных подсчета слайд (20 х 50 1 мм квадраты) (рис 2 ). Использование рассекает микроскоп или соединение, рассчитывать неповрежденные коловраток и тОБЩИЙ количество яиц, прикрепленных к этим коловраток (рисунок 2). Граф, как большая часть области, как слайд-стоит рассчитывать ~ 100 коловраток. Рассчитать количество коловраток в мл, и записать это в таблице или журнале.
   6. Урожай ~ 30% от объема коловраток в резюме: Удалить подачу воздуха и мулине фильтр, медленно откройте клапан в нижней части резюме и дайте воде стечь в планктона коллектора с сито 53 мкм. Сбор воды из нижней части коллектора после фильтрации в ведро или слив. Используйте нежный умеренной потока, чтобы избежать повреждения коловраток. Не позволяйте коловратки сушить на экране.
   7. По соображениям согласованности, целесообразно установить FCV со стандартным номером коловраток каждый день. Таким образом, на основе известной плотности CV коловратка и сбора объема, регулировать громкость общее FCV до получения однородной конечной плотности (например., 1500 коловратки / мл). Добавить заготовленную ротиFERS к FCV: Осторожно передачи коловраток с экрана сбора использования промывающего бутылку с чистой соленой водой (10 - 15 г / л). Обратить экран над FCV и мыть коловраток в FCV с нежным потоком соленой воды. Начните PMT доставить корм (~ 1,57 мл на миллион коловраток в день) в FCV.
   8. Скраб весь внутренность CV с чистой, мягкой нейлоновой щеткой или чистящей площадки.
   9. Создать новую смесь 15 г / л воды путем добавления соответствующего количества соли в отмеренное количество чистой воды обратного осмоса в 5 галлонов ведро, чтобы заменить объем воды теряется урожай. Добавьте соль к воде в ведре и перемешать энергично, пока она полностью не растворится, а затем добавить к CV.
   10. Использование спрей высокого давления в раковине, промыть фильтр мулине, пока он не свободен от мусора, а затем вернуть его в резюме.
   11. Регулировка скорости подачи водорослей подаваемого в CV, изменяя продолжительность каждой дозирующей случае, в соответствии с ежедневной подсчета коловраток / мл.С помощью расчетов, приведенные в шаге 1.3.8, выше, чтобы определить соответствующее количество корма будет доставлено.
   12. Примерно 24 часа спустя, повторить процесс. Сначала уборки коловраток оставшиеся в FCV (которые не были необходимы для предыдущий день) таким же образом, как описано выше (этапы 1.4.2 - 1.4.10). Концентрат их в 2 л свежей, чистой воды (дехлорированию 5 г / л соли). Они могут храниться при температуре 4 ° С в качестве резервного питания, или на корм поздние стадии рыбы, за то, что описано в данном протоколе.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол позволяет до 2 - 3 дней сниженным содержанием культуры (с нормальной автоматической подачи), потому что коловратки в CV может терпеть бездействие урожаев без серьезных последствий.

2. поликультуры

1. Настроить
   1. Сбор эмбрионов данио из события нереста путем заливки породил эмбрионов через ситечко, а затем аккуратно промывая стерильных мксч воды (или любой другой, не загрязненных источником соответствующим условного раствора; например, эмбрион среднего, Е3, и т.д.) из промывной бутылки в чашках Петри.
   2. Инкубируйте эмбрионов на 25 - 28 ° C в чашках Петри при плотности 40 - 50 эмбрионов на чашку в течение 5 дней.
   3. Начните фазу поликультура на 5-й день после оплодотворения, или когда больше, чем 90% вылупившихся личинок активно плавать в толще воды.
2. Прививка
   1. Добавить 500 мл коловратки культуры непосредственно из FCV до 3,5 л питомника бак; включение коловраток культуры воды обеспечивает подачу водорослей, который поддерживает содержание питательных из коловраток во поликультуры.
   2. Аккуратно влить личинок из одной чашки Петри в детском бака. Убедитесь, что нет личинки остаются в блюдо.
   3. Добавить 500 мл чистой, кондиционированной рыбы воды из системы рециркуляционного или специального источника воды в бак для достижения конечного объема 1 л и окончательное Salinity 5 г / л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот соленость важно, потому что данио выживание личинок будет негативному воздействию, если соленость> 7 г / л и выживания коловраток будет негативному воздействию, если соленость <2 г / л.
3. Поликультуры фаза
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза поликультура должен длиться до 4 дней после инокуляции (в общей сложности 5 дней, что соответствует 5-9 дней после оплодотворения).
   1. Соблюдайте поликультура бак по крайней мере, один раз в день в течение этого периода для того, чтобы коловратки и рыбы присутствуют и растет. Убедитесь, что коловратки могут видеть по всей толще воды. Убедитесь, что в Fishs также видны в толще воды, плавая среди коловраток.
   2. Начните нормальный поток воды через бак. Поместите экран или перегородка над сливной порт для обеспечения личинок не вымываются из резервуара.
      Примечание: В конце этого этапа, рыба будет достаточно большим, чтобы потреблять крупные предметы, такие как добычу Artemiaнауплии или обработанные предметы подача в диапазоне размеров от 75 - 125 мкм.
      Примечание: динамика коловратка населения внутри представительного поликультуры бака были измерены путем отбора проб / подсчета коловраток из резервуара таким же образом, как описано в шагах 1.4.2 - 1.4.5. Это было сделано один раз в день с начала фазы поликультуры, пока она не была завершена.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Система непрерывного коловраток культура описано здесь является динамичным, и это нормально для числа коловраток колебаться в небольшой степени в течение долгого времени, если есть изменения в повседневной ставки кормления и уборки. Население коловраток в одном из ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Успешная реализация метода поликультуры коловраток для кормления личинок данио раннего требует эффективных протоколов для двух задач: установление и поддержание системы непрерывного коловраток культуры, чтобы накормить рыбу, и культивирование первой кормления личинок данио вместе...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel	Aquaneering	Custom	Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD	Grainger	38M003	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing	Cole Parmer		Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 million	Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb tub	Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S25533B	pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter bag	Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz bottle	All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket	Grainger Supply	43Y530	Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute	Fisher Scientific	S99481	Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer	Kitchenworks	971972	Used for collecting zebrafish embryos after spawning