תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Summary

תקנת כוונון עדינה של שעתוק גנים בבסיס החלטת גורל תא עוברי. בזאת, אנו מתארים מבחני immunoprecipitation הכרומטין לשמש כדי לחקור תקנה אפיגנטיים של שני בידול הלב של תאי גזע ופיתוח הלב של עוברי עכברים.

Abstract

שעתוק גנים ספציפית הוא תהליך ביולוגי מפתח העומד בבסיס החלטת גורל תא במהלך התפתחות עוברית. התהליך הביולוגי מתווך על ידי גורמי תעתוק אשר נקלטים אזורי רגולטוריים הגנומי כוללים משפר ומקדם של גני מכונן לב. DNA הוא כרוך סביב ההיסטונים כי הם נתונים שינויים כימיים. שינויים של היסטונים נוסף להוביל שעתוק גנים מודחק, מופעל או שקול, ובכך להביא לרמה אחרת של רגולצית כוונון העדינה של שעתוק גנים. תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) שיסכמו בתוך גופי embryoid (כלומר, אגרגטים תא) או בתרבות 2D השלבים המוקדמים של פיתוח לב. הם מספקים חומר העיקרון מספיק immunoprecipitation הכרומטין (שבב), טכנולוגיה בשימוש נרחב לזהות אזורים רגולטוריים הגן. יתר על כן, בתאי גזע עובריים אנושיים מייצגים מודל תאים אנושי של cardiogenesis. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות, רקמות עובריות העכבר לאפשרחוקר נופים אפיגנטיים ספציפיים הדרושים לצורך קביעת זהות תא. בזאת, אנו מתארים פרוטוקולים של שבב, שבב רציף ואחריו PCR או שבב רצף באמצעות תאי גזע עובריים, גופי embryoid ואזורים עובריים ספציפיים לב. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור את הרגולציה אפיגנטיים של שעתוק גני לב.

Introduction

הלב הוא האיבר הראשון להיווצר להיות פונקציונלי בעובר. הלב בנוי שושלות תאים רבות שעולות משדות הלב העובריים הראשונים ושני ^1. מן הבלסטוציסט לאחר הפרית שלב א 'עד בצורת הלב, תאים עובריים יש אפוא לקבל החלטות תא גורל רבות. שעתוק גנים מוסדר באופן הזמן- ומרחב תלוי הוא תהליך ביולוגי מפתח העומד בבסיס החלטת גורל תא במהלך התפתחות עוברית. תהליך כזה מתווך על ידי גורמי שעתוק ספציפיים המחייבים אזורים רגולטוריים בתוך הגנום כולל משפר ומקדם של גני מכונן לב. DNA הוא כרוך סביב ההיסטונים כי הם נתונים שינויים כגון acetylation, מתילציה, ubiquitinylation, ו / או זרחון. שינוי היסטון מוביל שעתוק גנים מודחק, מופעל או שקול תלוי בו שאריות של היסטון ליזין היא שונות ^2.

jove_content "> assay immunoprecipitation הכרומטין (שבב) הוגדר שנים ³ ו משתמשת בטכנולוגיה הנמצא בשימוש הנרחב ביותר כדי לזהות מטרות של היסטונים שונה משני או גורמי שעתוק ^4. בעקבות immunoprecipitation של היסטונים או גורמי שעתוק, DNA כבול יכול להיות או מוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימרז (PCR) או רצף. שבב שהתגברה טכנית יותר מבחני פיגור ג'ל מאתגר ^5. אולם שבב אינה מעידה ישירה מחייב גורם שעתוק ל- DNA, יתרון של assay ג'ל פיגור. מצד שני, שבב בשילוב כדי רצפי DNA פתח פרספקטיבת הגנום כולו חדשה על ויסות גנים.

בתאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) שיסכמו בתוך גופי embryoid (כלומר., אגרגטים תא) או בתרבות 2D השלבים המוקדמים של פיתוח לב ⁶ ולספק חומר עיקרון מספיק שבב. יתר על כן, בתאי גזע עובריים אנושיים מייצגים מודל תאים אנושי של CArdiogenesis למרות הפוטנציאל קרדיוגני שלהם תלויה בחתימה אפיגנטיים שלהם ^7. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות, רקמות עובריות העכבר לאפשר לחקירת נופים אפיגנטיים ספציפיים הדרושים לצורך קביעת זהות התא. עם זאת, הגנום הוא עבד באופן סוג ספציפי הזמן- ותא ^8. תקנה אפיגנטיים של שעתוק הגנים יש להיחקר בתוך אזורים נקודתיים. בזאת, אנו מתארים פרוטוקולים של שבב, שבב רציף ואחריו PCR או רצף באמצעות תאי גזע עובריים, גופי embryoid ואזורים עובריים ספציפיים לב. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור את הרגולציה אפיגנטיים של שעתוק גני לב.

Protocol

1. חלבון דנ"א Cross-linking

1. תקן ב 15 מיליליטר צינורות שנקטפו-ES תאים (2 x 10 ⁶ תאים עבור שבב רגיל, 2 x 10 ⁵ תאים עבור Microchip), גופי embryoid (EBS) המופקים מתאי גזע עובריים רקמות לב עובריות גזורים מן עוברי עכברי E9.5 (חדרים ועליות תעלה, בדרכי חדר יצוא) באמצעות פורמלדהיד 1% PBS עבור תאים או במאגר PB2 permeabilization עבור רקמות עובריות. מניחים את הצינורות על שייקר מסלולית במהירות של 60 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בדיוק.
2. עצור את התגובה cross-linking ידי הוספת גליצין לריכוז סופי של 125 מ"מ ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית במהירות של 60 סל"ד.

פיצול 2. תא תמוגה הכרומטין

1. שטפו פעמיים תאים צולבים resuspended ב 10 מ"ל PBS 1x או רקמות עובריות resuspended ב 1 מ"ל PB2. צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. מחק את supernatants.
2. הוסף מעכבי פרוטאז למאגר PB1 או PB2 (2 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin, 1 מיקרוגרם / מ"ל Aprotinin, ו 0.1 מ"מ PMSF) (טבלה 1). Resuspend התא גלולה או רקמה עוברית משלב 2.1 ב 1 מ"ל של הצפת PB1 או PB2 בהתאמה. Pipet למעלה ולמטה ו resuspend תאים או רקמות. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 21 מד כדי homogenize תאים או רקמות. דגירה ב 4 ° C. (על גלגל) במשך 10 דקות.
3. ספין למטה ב 3000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
4. Resuspend גלולה ב 300 μl של מאגרי SB בהתאמה (לוח 1) השלימו עם מעכבי פרוטאז בתוך שפופרת נקיה (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם) כדי למנוע כל שפלת DNA. דגירה של 15 עד 30 דקות על קרח.
5. Sonicate דגימות ב 4 ° C. כדי לכסח את הכרומטין באמצעות sonicator פי התוכניות המפורטות בטבלה 2 עבור כל חומר. התאם משך sonication בהתאם היישום הבא ( כלומר, PCR או רצף). גודל DNA טעון צריך להיות סביב 500 נ"ב עבור PCR ו -300 נ"ב על רצף.
6. צנטריפוגה sonicated תא lysate למשך 10 דקות ב 6000 XG ב 4 ° C, להעביר את supernatant (הכרומטין) בצינור 1.5 מ"ל נקי וזורקים את הכדור.
7. לדלל את הכרומטין בתמיסה (B חיץ supernatant) במשך 10 פעמים עם מים להעריך את הצפיפות האופטית באמצעות 1.5 μl ב ספקטרופוטומטר-ננו. השג את הריכוז של החלבונים מיקרוגרם / μl באמצעות הנוסחה הבאה: 1.55 x OD ₂₈₀ - 0.76 x OD _260.

בַּלָם	שימוש	הרכב				חומרים
א	permeabilization	PB1: 5 מ"מ צינורות pH 8; 85 מ 'M KCl; 0.5% NP40				את כל
		PB2: 15 מ"מ HEPES pH 7.6, 15 mM NaCl, 4 מ"מ MgCl2 60 מ"מ KCl, 0.5% Triton X-100				רקמה עוברית
B	תמוגה / Sonication	SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8				יציאה
		SB2: 50 מ"מ HEPES-KOH pH7.9; 140 מ"מ; 1 מ"מ EDTA; 0.1% deoxycholate; 0.1% SDS				EBS
		SB3: 15 מ"מ HEPES pH7.6, 15 מ"מ NaCl; 60 מ"מ KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 מ"מ EGTA; 1% Triton-X100, 0 1% SDS, 0.5% laurylsarcosine				רקמה עוברית
C	חיץ שבב	150 מ"מ NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 5 mM EDTA; 0.5% NP40; 1% Triton-X100.				את כל
D	דנ"א / חלבון Elution	D1: 1% SDS; 100מ"מ NaHCO 3 D2: 50 המ"מימ טריס pH 7.6 / 5 EDTA מ"מ, 15 המ"מ DTT, 2% SDS
E	הכנת חרוזי DNA מחייבים	E: 20% PEG 8000; 2.5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 מ"מ EDTA

מאגרי שבב בטבלת 1..

חוֹמֶר	תוכנית sonication
תאי גזע עובריים	15 מחזורים של 30 שניות על 30 שניות OFF
גופי Embryoid	30 מחזורים של 30 שניות על 30 שניות OFF
רקמות עובריות	21 מחזורים של 30 שניות על 30 שניות OFF

תוכניות טבלה 2. Sonication.

3. Immunoprecipitation ורוחץ

1. לשטוף חרוזים 3 פעמים חלבון A-מצומדות עם חיץ C. קח 100 μl של חרוזים בצינור 1.5 מ"ל נקי ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ C (טבלה 1). הצינור הוא הועבר לאחר מכן על גבי מגנט; להמתין דקות 1 ו לשאוב supernatant. חזור פעמים על שלב הכביסה.
2. דגירת נוגדן שהועלה נגד היסטונים שונים או גורם שעתוק (ריכוזים המפורטים בטבלה 3) עם 20 μl של חלבון שרחץ חרוזי מצומדות 1 מיליליטר של החיץ C בתוספת מעכבי פרוטאז צינור 1.5 מיליליטר נקי. הגדר את הדגימות על כתף ב 40 סל"ד במשך שעה לפחות 2 ב 4 ° C.
3. נוגדן-חרוזים לשטוף קומפלקסי 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ C (מניפולציה המתוארים 3.1).
4. כן 2 צינורות, אחד המכיל 150 מיקרוגרם של מתחמי הכרומטין נוגדן-חרוזי הצינור האחר המכיל 150 מיקרוגרם של הכרומטין 20 μl של חרוזי שטף; הוסף 1 מ"ל של חיץ C בתוספת מעכבי פרוטאז על צינור אחדדגירת הדגימות על גלגל מסתובב ב 40 סל"ד הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: ריכוז הכרומטין חייב להיות לפחות 300 מיקרוגרם כדי immunoprecipitate גורמות שעתוק או עבור שבב רציף.

תֶקֶן	ריכוז (ng / μl)	נפח (μl)	ריכוז ה- DNA סה"כ (נ"ג)
א	10.0	1	10.0
B	5.00	1	5.00
C	2.50	1	2.50
D	1.25	1	1.25
E	0.625	1	0.625
F	.3125	1	0.3125
G	0.156	1	0.156
H	0.0	1	0.0

ריכוזים לתקני לוח 3..

4. DNA Elution, היפוך חוצה הקישור proteinase K עיכול

1. הגדר את הדגימות המתלות המגנטית. לשחזר את supernatant המכיל הכרומטין נוגדן מאוגד.
   הערה: דוגמאות אפשר להקפיא במהירות בחנקן נוזלי באותו צעד ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס. הכרומטין יכול לשמש מבחני immunoprecipitation אחרים עם נוגדן אחר. לשטוף כל מדגם 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ C (מניפולציה שתואר קודם).
2. Elute החלבון כבול-נוגדנים על ידי הוספת 150 μl של חיץ D1 או D2 אם שבב רציפים חייב להיעשות (טבלה 1) לחומרי שבב שטף דגירת הדגימות במשך 20 דקות ב 50 מעלות צלזיוס בתוך גוש חימום.
3. הסר צינורות מ בלוק חימום ולשים דגימות מתלה מגנטי, לשחזר את supernatant בצינור 1.5 מ"ל נקי (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם) וזורקים את החרוזים.
4. השתמש supernatant עבור שבב רציפי הוספת 1 עד 3 מיקרוגרם של הנוגדן השני ב 2 כרכים של החיץ C או הפוך crosslink ידי הוספת 5 M NaCl כדי לקבל ריכוז סופי של 200 מ"מ.
5. כן מדגם קלט של הכרומטין בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר נקי (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם) לוקח את אותה כמות של הכרומטין כמו זה של מדגם IP (150 מיקרוגרם) בנפח סופי של 150 μl של מים (מים חופשיים RNase DNase). להוסיף 5M NaCl לריכוז סופי של 200 מ"מ. דגירה דגימות לילה בשעה C 65 °.
6. למחרת, להסיר דגימות מהגוש חימום, להוסיף 250 מ"מ EDTA כדי לקבל ריכוז סופי של 12.5 מ"מ ו proteinase K כדי לקבל ריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ"ל ​​בחומר שבב ולעכל על 55 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ב בלוק חימום.

ss = "jove_title"> 5. בידוד DNA באמצעות חרוזים ה- DNA מחייבת

1. הכנת חרוזים
   1. התחל להביא את החרוזים בטמפרטורת החדר למשך לפחות 30 דקות, מערבולת החרוזים ביסודיות מאוד. חרוזים להתיישב, כך לעבוד מהר כאשר pipetting. העברת 1 מ"ל של חרוזים בצינור 1.5 מ"ל נקי (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם).
   2. גדר על מגנט, לחכות 2 - 3 דקות עבור הפתרון להבהיר, supernatant שנזרק. הסר מגנט, להוסיף 1 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA ומערבבים ידי vortexing קצר.
   3. חזור על שלב 5.1.2 פעמיים, וזורקים supernatant בסוף.
   4. הסר מגנט, להוסיף 1 מ"ל של חיץ E ולאט לאט resuspend את החרוזים. מעבירים את תערובת כולו (החרוזים E חיץ) לתוך 50 מ"ל של חיץ א מקום על שייקר ולתת לו ומערבלים במהירות איטית בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
   5. מבחן ה- DNA מחייבת חרוזים בעקבות פרוטוקול טיהור המתוארים להלן באמצעות 3 תנאי הניסוי: 50 μl של חרוזים / 50 μl של ה- DNA (1 נפח / נפח 1), 100 μl של חרוזים/ 50 μl של ה- DNA (2 כרכים / 1 נפח) 125 μl של חרוזים / 50 μl של ה- DNA (2.5 כרכים / 1 נפח). בואו להעביר DNA מטוהרים על ג'ל agarose 1.5% כדי לבדוק את גודל שברי (איור 1 א).
2. טיהור DNA
   1. להוסיף 425 μl (2.5 כרכים) של DNA מחייב חרוזים מגנטיים לכל דגימת DNA (כ -170 μl). Resuspend לאט על ידי pipetting למעלה ולמטה (כ -10 פעמים) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
   2. מניחים על מגנט במשך 5 דקות, ואז לשאוב supernatant וזורקים (על מגנט).
   3. להוסיף 600 μl של אתנול טרי 80% אל הצינור על מגנט, לחכות 1 דקות, לשאוב supernatant וזורק ולאחר מכן חזור על השלב הקודם שוב.
   4. תן סיבוב מהיר, במשך 5 שניות (microfuge), במקום צינור על מגנט ולהסיר את הטיפות האחרונות של אתנול. תן יבש דקות 1 ב RT
   5. Elute את ה- DNA על ידי הוספת 20 μl של מים חינם DNase RNase. סר מגנט מערבולת המדגם.
   6. דגירה של 3 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למקם דגימות על מגנט. DNA eluted לשאוב לתוך צינור חדש (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם).
   7. הפעל את ה- DNA מן השבר קלט על ג'ל agarose 1.5% כדי לבדוק את הגודל של קטעי DNA (איור 1 ב).

6. כימות DNA באמצעות מכשיר גילוי הקרינה

1. סדרתי לדלל בדנ"א מיקרוגרם מים 1 (1 סולם kb) לתת סך של 7 דילולים בתוספת נקודה לא-דנ"א (דילולים שנאסף בטבלה 3).
2. הכן פתרון של צבע PCR הירוק אני, מספיק עבור כל הדגימות (דנ"א דילולים תקן מטוהרים AH): לדלל 10,000x לצבוע ירוק במאגר 1x TE.
3. הוסף 1 μl של כל דגימות דנ"א (DNA דילולים תקן מטוהרים AH) עד 10 תמהיל צבע ירוק 1x μl ב cuvettes נימים להיקרא בתוך fluorimeter באורך גל 488 ננומטר. עבור assay לא-DNA, השתמש 1 μl של חיץ 1x TE.
4. לִבנוֹתעקומת כיול באמצעות תוכנות גרפיקה לקבוע את הריכוזים היחסיים לטווח בדגימת DNA הנמצאת ng / μl. ה- DNA הוא אז מוכן PCR או לעשות ספריות רצף.

7. PCR

1. מבחר פריימרים
   1. פריימרים תכנון עניין לחקור את האזורים הגנומי של עניין. פריימרים עיצוב להגביר אזורים משפר גנים באמצעות דפדפן הגנום UCSC. משפרים הם חזו נוספים באמצעות H3K4me1 או p300 שבב seq ⁹ נתונים זמינים בערכת נתוני GEO.
2. PCR
   1. הפעלה PCR תגובות עבור 45 מחזורים (8 שניות 95 מעלות צלזיוס, 8 שניות 60 ° C, 8 שניות 72 ° C) להשתמש thermocycler PCR בזמן אמת 25 μl תערובת צבע ירוק, 2 ng DNA, ו -0.5 μl תערובת פריימר (20 מיקרומטר פתרון המניות) ^10.
3. ניתוח של העשרה
   1. חישוב העשרה מוחלטת והניחה שלכל היותר 1% של הנוקלאוזום היו immunoprecipitated ^11.
   2. consideהאות R גנומי כמו מועשר אם 10 דגימות ng IP להראות העשרה יותר בהשוואה ל 0.1 ng של DNA קלט.
   3. אין מהיר תוצאות כמו גידול של פי העשרה על אזור שאינו מועשר לאחר נורמליזציה לכניסת וכוונון עם מדגם השליטה הלא ספציפית.
   4. קחו למשל את ה- DNA קלט על דילול 100 (גורם לדילול או DF).
   5. לנרמל את קלט באמצעות המשוואה הבאה 2 ^-ΔCt x 100%, כאשר -ΔCt = Ct [IP] - Ct [קלט x DF].
   6. התאם שליטה באמצעות המשוואה הבאה (ΔCt [IP] -ΔCt [NS]) שבו NS הוא מדגם שאינם ספציפיים (לא נוגדן ה- IP, או IgG IP).
   7. חשב את ההעשרה פי המדגם כפי 2 ^-ΔΔCt. קובץ כולל את כל השלבים של חישובים עם נוסחאות בה רק מדגם PCR ניתן להזין יקל על ניתוח של התוצאות.

תוצאות

איור 1 א הממחיש ראשון בהכנת חרוזי בקרת איכות-DNA מחייבת שימוש ב- DNA בגדלים שונים (סולם 1 kb). 0ne, 2 ו 2.5 כרכים (1 עד 3) חרוזים התווספו בכרך אחד של המדגם כדי לטהר שברי DNA בגודל מולקולרי גבוהים ונמוכים.

Discussion

אפיגנטיקה הפך תחום חשוב של מחקר בביולוגיה התפתחותית. איך תכנית גנטית מופעלת בתאים עובריים כדי לאפשר לתאי רכישת זהות ספציפית בתוך שושלת עוברית כבר במשך זמן רב שאלת מפתח עבור ביולוגים התפתחותיים.

שבב נעשה שימוש נרחב בתוך בשנים האח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F8775	Cell Fixation
Glycine	Sigma	G8898	Cross-link stop
Aprotinin	Fluka	10820	Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate	Sigma	L2882	Proteases inhibitor
PMSF	Sigma	P7626	Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads	Life technologies	10001D	Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads	Thermo Scientific	15002-01	DNA purification
Proteinase K	Life technologies	25530-015	Protein digestion
DNA BR standard	Life technologies	Q32850	Calibration range
Syber green	Molecular Probes	S-11484	DNA quantification
TE buffer	Invitrogen	P7589	DNA quantification
PBX 1x	Life technologies	14190-094	Washing
DNase RNase free water	Life technologies	10977-035	Dilution
Axygen tube	Axygen	MCT-175-C	ChIP purifiction
Antibody	Company	Reference	ChIP concentration
H3K27ac	Abcam	ab4729	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1	Diagenode	C15410194 (pAb-194-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3	Diagenode	C15410058 (pAb-058-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2	Diagenode	C15410060 (pAb-060-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3	Diagenode	C15410030 (pAb-030-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3	Diagenode	C15410069 (pAb-069-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues