Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Résumé

Un règlement de réglage fin de la transcription des gènes à la base embryonnaire décision du destin cellulaire. Nous décrivons ici des analyses d'immunoprécipitation de chromatine utilisées pour étudier la régulation épigénétique de la différenciation cardiaque des cellules souches et le développement cardiaque d'embryons de souris.

Résumé

la transcription du gène spécifique est un processus biologique essentiel qui sous-tend la cellule décision de devenir au cours du développement embryonnaire. Le processus biologique est médiée par des facteurs de transcription qui lient les régions régulatrices génomiques comprenant des activateurs et des promoteurs de gènes constitutifs cardiaques. L'ADN est enroulé autour histones qui sont soumis à des modifications chimiques. Les modifications des histones conduisent en outre refoulé, activé ou en équilibre la transcription des gènes, ce qui porte un autre niveau de régulation de réglage fin de la transcription du gène. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) récapitulent au sein des corps embryoïdes (ie, des agrégats cellulaires) ou en culture 2D les étapes précoces du développement cardiaque. Ils fournissent en principe matériel suffisant pour chromatine immunoprécipitation (ChIP), une technologie largement utilisée pour identifier des régions régulatrices de gènes. En outre, les cellules ES humaines représentent un modèle de cellules humaines de cardiogenèse. Aux stades ultérieurs de développement, les tissus embryonnaires de souris permettentenquêter sur les paysages épigénétiques spécifiques nécessaires à la détermination de l'identité cellulaire. Nous décrivons ici les protocoles de ChIP, ChIP séquentielle suivie par PCR ou ChIP-séquençage en utilisant des cellules ES, des corps embryoïdes et régions embryonnaires spécifiques cardiaques. Ces protocoles permettent d'étudier la régulation épigénétique de la transcription du gène cardiaque.

Introduction

Le cœur est le premier organe à être formé et devenir fonctionnel dans l'embryon. Le coeur est construit à partir de plusieurs lignées cellulaires qui proviennent des premier et second champs cardiaques embryonnaires ^1. De stade blastocyste post-fécondation jusqu'à la forme de coeur, les cellules embryonnaires doivent donc prendre de nombreuses décisions du destin cellulaire. La transcription des gènes est régulée de manière dépendante du temps et de l'espace et est un processus biologique essentiel qui sous-tend la cellule décision de devenir au cours du développement embryonnaire. Un tel processus est médié par des facteurs de transcription spécifiques qui se lient à des régions régulatrices du génome comprenant les amplificateurs et les promoteurs des gènes constitutifs cardiaques. L'ADN est enroulé autour histones qui sont soumis à des modifications telles que l'acétylation, une méthylation, une ubiquitinylation, et / ou la phosphorylation. La modification des histones conduit à la transcription du gène refoulé, activé ou en équilibre en fonction de ce qui est modifié résidu de lysine de l' histone ^2.

jove_content "> chromatine immunoprécipitation dosage (ChIP) a été mis en place il y a ³ ans et est actuellement la technologie la plus largement utilisée dans le but d'identifier des cibles de soit histones modifiées ou des facteurs de transcription ^4. Après immunoprécipitation des histones ou des facteurs de transcription, ADN lié peut être soit amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou séquencée. ChIP a techniquement surmonter les plus difficiles des essais de retard sur gel ^5. Cependant ChIP ne signifie pas la liaison directe d'un facteur de transcription à l' ADN, un avantage du dosage de retard sur gel. d'autre part, ChIP combinée à un séquençage d'ADN a ouvert une nouvelle perspective du génome entier sur la régulation des gènes.

Les cellules ES (cellules ES) récapitulent à l'intérieur des corps embryoïdes ( par exemple des agrégats cellulaires.,) Ou en culture 2D les premières étapes du développement cardiaque ⁶ et fournissent , en principe , suffisamment de matériel pour les copeaux. En outre, les cellules ES humaines représentent un modèle cellulaire humaine de cardiogenesis bien que leur potentiel cardiogénique dépend de leur signature épigénétique ^7. Aux stades ultérieurs de développement, les tissus embryonnaires de souris permettent d'enquêter sur les paysages épigénétiques spécifiques nécessaires à la détermination de l'identité cellulaire. Cependant, le génome est transcrit dans un type spécifique de temps et de manière cellule ^8. la régulation épigénétique de la transcription génique doit être étudiée dans des régions localisées. Nous décrivons ici les protocoles de ChIP, ChIP séquentielle suivie par PCR ou séquençage en utilisant des cellules ES, des corps embryoïdes et régions embryonnaires spécifiques cardiaques. Ces protocoles permettent d'étudier la régulation épigénétique de la transcription du gène cardiaque.

Protocole

1. ADN-protéines réticulation

1. Fix dans 15 ml tubes cellules-ES récoltées (2 x 10 ⁶ cellules pour ChIP régulière, 2 x 10 ⁵ cellules Microchip), corps embryoïdes (EbS) générées à partir de cellules ES et les tissus cardiaques embryonnaires disséqués à partir d' embryons E9.5 de souris (auriculo - ventriculaire canal, voie d'éjection et le ventricule) en utilisant 1% de formaldéhyde dans du PBS pour les cellules ou dans perméabilisation tampon PB2 pour les tissus embryonnaires. Placer les tubes sur un agitateur orbital à une vitesse de 60 tours par minute à la température ambiante pendant exactement 10 minutes.
2. Arrêter la réaction de réticulation par addition de glycine à une concentration finale de 125 mM et on incube pendant 5 minutes à température ambiante dans un agitateur orbital à une vitesse de 60 tours par minute.

2. Lyse cellulaire et chromatine Fragmentation

1. Laver deux fois les cellules réticulées remises en suspension dans 10 ml de PBS 1x ou tissus embryonnaires remises en suspension dans 1 ml PB2. Centrifuger à 1000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Jeter les surnageants.
2. Ajouter des inhibiteurs de la protéase pour tamponner PB1 ou PB2 (2 pg / ml de leupeptine, 1 pg / ml d' aprotinine et 0,1 mM de PMSF) (tableau 1). Remettre en suspension le culot de cellules ou d'un tissu embryonnaire à l'étape 2.1 dans 1 ml de tampon PB1 ou PB2, respectivement. Pipet haut en bas et remettre en suspension les cellules ou les tissus. Utiliser une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 21 pour homogénéiser des cellules ou des tissus. Incuber à 4 ° C (sur une roue) pendant 10 min.
3. Isoler à 3000 xg pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
4. Reprendre le culot dans 300 pi de tampons SB respectifs (tableau 1) complété avec des inhibiteurs de la protéase dans un tube propre (certifié RNase, DNase et apyrogène) pour éviter toute dégradation de l' ADN. Incuber pendant 15 à 30 min sur la glace.
5. Soniquer les échantillons à 4 ° C pour cisailler la chromatine en utilisant un appareil à ultrasons selon des programmes listés dans le Tableau 2 pour chaque matériau. Ajuster la durée du traitement par ultrasons selon l'application suivante ( ie, PCR ou séquençage). la taille de l'ADN cisaillé devrait être d'environ 500 pb pour la PCR et 300 pb pour le séquençage.
6. Centrifugeuse soniqué lysat cellulaire pendant 10 min à 6000 x g à 4 ° C, transférer le surnageant (chromatine) dans un tube de 1,5 ml propre et jeter le culot.
7. Diluer la chromatine en solution (surnageant tampon B) pendant 10 heures avec de l'eau et à évaluer la densité optique en utilisant 1,5 ul dans un nano-spectrophotomètre. Obtenir la concentration de protéines dans pg / pl en utilisant la formule suivante: 1,55 x OD _{280 à 0,76} x ₂₆₀ OD.

Tampon	Utilisation	Composition				Matériaux
UNE	perméabilisation	PB1: TUYAUX 5 mM pH 8; 85 mM de KCl; 0,5% de NP40				Tout
		PB2: 15 mM d'HEPES pH 7,6, 15 mM de NaCl, 4 mM de MgCl2, 60 mM KCI, 0,5% de TRITON X-100				tissu embryonnaire
B	Lyse / sonication	SB1: 1% de SDS; EDTA 10 mM; 50 mM Tris-HCl pH 8				ESC
		SB2: 50 mM de HEPES-KOH à pH 7,9; 140 mM; 1 mM d'EDTA; 0,1% de désoxycholate; SDS à 0,1%				EB
		SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM de NaCl; 60 mM de KCl, 1 mM d'EDTA, 0,5 mM d'EGTA; 1% TRITON-X100, 0 0,1% de SDS, 0,5% laurylsarcosine				tissu embryonnaire
C	tampon ChIP	NaCl 150 mM; Tris-HCl 50 mM à pH 7,5; EDTA 5 mM; 0,5% NP40; 1% TRITON-X100.				Tout
ré	ADN / protéine Elution	D1: 1% de SDS; 100mM NaHCO 3 D2: 50 mM Tris pH mM EDTA 7,6 / 5 mM, DTT 15, 2% SDS
E	ADN perles de liaison préparation	E: 20% de PEG 8000; NaCl 2,5 M; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM d'EDTA

Tableau 1. tampons de copeau.

Matériel	Programme de sonication
Cellules souches embryonnaires	15 cycles de 30 s ON et OFF 30 sec
Les corps embryoïdes	30 cycles de 30 s ON et OFF 30 sec
tissus embryonnaires	21 cycles de 30 s ON et OFF 30 sec

Tableau 2. Programmes sonication.

3. Immunoprécipitation etLavages

1. Laver 3 fois billes de protéine A conjuguée avec du tampon C. Prendre 100 ul de billes dans un tube de 1,5 ml propre et ajouter 1 ml de tampon C (tableau 1). Le tube est ensuite transféré sur un aimant; attendre 1 min et aspirer le surnageant. Répéter deux fois l'étape de lavage.
2. Incuber un anticorps dirigé contre des histones modifiées ou des facteurs de transcription (concentrations énumérées dans le Tableau 3) avec 20 ul de la protéine A lavée perles conjuguées et 1 ml de tampon C supplémenté avec des inhibiteurs de la protéase dans un tube de 1,5 ml propre. Définissez les échantillons sur un rotateur à 40 tours par minute pendant au moins 2 heures à 4 ° C.
3. Laver les anticorps-billes des complexes 3 fois avec 1 ml de tampon C (manipulation décrite au point 3.1).
4. Préparer 2 tubes, l'un contenant 150 pg de complexes de chromatine et d'anticorps-perles et l'autre tube contenant 150 ug de chromatine et 20 pi de billes lavées; Ajouter 1 ml de tampon C supplémenté avec des inhibiteurs de protéase à chaque tubeet incuber les échantillons sur une roue tournant à 40 tours par minute pendant une nuit à 4 ° C.
   REMARQUE: La concentration de la chromatine doit être d'au moins 300 ug à immunoprécipiter un facteur de transcription ou des cartes à puce séquentielle.

Standard	concentration (ng / ul)	Volume (ul)	La concentration totale d'ADN (ng)
UNE	10.0	1	10.0
B	5,00	1	5,00
C	2.50	1	2.50
ré	1.25	1	1.25
E	0,625	1	0,625
F	0,3125	1	00,3125
g	0,156	1	0,156
H	0.0	1	0.0

Tableau 3. Normes concentrations.

4. DNA Elution, Cross-link Reversal et Proteinase K Digestion

1. Définissez les échantillons dans le rack magnétique. Récupérer le surnageant contenant non lié chromatine d'anticorps.
   NOTE: Les échantillons peuvent être rapidement congelés dans l'azote liquide à cette étape et stockés à -80 ° C. Chromatine peut être utilisé dans d'autres essais d'immunoprécipitation avec d'autres anticorps. Laver chaque échantillon 3 fois avec 1 ml de tampon C (manipulation décrite précédemment).
2. Eluer la protéine liée à l'anticorps en ajoutant 150 pi de tampon D1 ou D2 si ChIP séquentielle doit être fait (tableau 1) aux matériaux ChIP lavés et incuber les échantillons pendant 20 min à 50 ° C dans un bloc de chauffage.
3. Retirer les tubes dele bloc de chauffage et de mettre des échantillons dans le rack magnétique, récupérer le surnageant dans un tube de 1,5 ml propre (certifié RNase, DNase et apyrogène) et jeter les perles.
4. Utiliser le surnageant pour une puce séquentielle ajoutant 1 à 3 pg du deuxième anticorps dans 2 volumes de tampon C ou inverser réticulent par addition de 5 M de NaCl pour obtenir une concentration finale de 200 mM.
5. Préparer un échantillon d'entrée de la chromatine dans un tube de 1,5 ml propre (certifiée RNase, DNase et apyrogène) en prenant la même quantité de chromatine que celle de l'échantillon IP (150 ug) dans un volume final de 150 pi d'eau (RNase DNase eau libre). Ajouter NaCl 5 M pour une concentration finale de 200 mM. Incuber les échantillons pendant une nuit à 65 ° C.
6. Le jour suivant, prélever des échantillons à partir du bloc chauffant, ajouter 250 mM d'EDTA pour obtenir une concentration finale de 12,5 mM, et de la protéinase K pour obtenir une concentration finale de 250 pg / ml dans le matériau de la puce et la digestion à 55 ° C pendant 2 heures en bloc de chauffage.

5. L'isolement de l'ADN en utilisant des perles de liaison à l'ADN

1. Préparation de perles
   1. Commencer à mettre les perles à la température ambiante pendant au moins 30 min, vortex les perles très soigneusement. Perles installent, donc travailler rapidement lors du pipetage. Transfert 1 ml de perles en propre tube de 1,5 ml (certifié RNase, DNase et apyrogène).
   2. Situé sur l'aimant, attendez 2 - 3 min pour la solution pour clarifier, surnageant défausse. Retirer de l'aimant, ajouter 1 ml d'EDTA 0,5 M et mélanger en bref tourbillonnement.
   3. Répétez l'étape 5.1.2 deux fois, et éliminer le surnageant à la fin.
   4. Retirer de l'aimant, ajouter 1 ml de tampon E et resuspendre lentement les perles. Transférer le mélange entier (billes dans un tampon E) dans 50 ml de tampon E. Placer sur un agitateur et laissez-le mélanger lentement à la température ambiante pendant 1 h.
   5. Test billes liaison à l'ADN en suivant le protocole de purification décrit ci-dessous en utilisant les conditions expérimentales 3: 50 ul de billes / 50 pl d'ADN (1 volume / 1 en volume), 100 ul de billes/ 50 pi de l'ADN (2 volumes / 1 volume) et 125 ul de billes / 50 ul d'ADN (2,5 volumes / 1 volume). Laissez migrer l' ADN purifié sur un gel d'agarose à 1,5% pour vérifier la taille des fragments (figure 1A).
2. de purification d'ADN
   1. Ajouter 425 ul (2,5 volumes) de liaison à l'ADN des billes magnétiques à chaque échantillon d'ADN (environ 170 pi). Remettre en suspension lentement par pipetage vers le haut et vers le bas (environ 10 fois) et on incube à la température ambiante pendant 10 min.
   2. Placer sur l'aimant pendant 5 min, puis aspirer le surnageant et le jeter (sur l'aimant).
   3. Ajouter 600 pl de fraîchement préparé 80% d'éthanol dans le tube sur l'aimant, attendre 1 min, aspirer le surnageant et le jeter, puis répétez l'étape précédente une fois de plus.
   4. Donner un tour rapide, pendant 5 secondes (microfuge), placer le tube sur l'aimant et éliminer les dernières gouttes d'éthanol. Laisser sécher pendant 1 min à température ambiante
   5. Éluer l'ADN en ajoutant 20 pi de DNase RNase eau libre. Retirer de l'aimant et vortex l'échantillon.
   6. Incuber pendant 3 min à température ambiante puis placer les échantillons sur l'aimant. Aspirer ADN élue dans un nouveau tube (certifié RNase, DNase et apyrogène).
   7. Exécuter l'ADN à partir de la fraction d'entrée sur un gel d'agarose à 1,5% pour vérifier la taille des fragments d' ADN (figure 1B).

6. ADN Quantification l'aide d'un instrument de détection Fluorescence

1. Diluer en série dans l' eau 1 pg d' ADN (1 kb échelle) pour donner un total de 7 dilutions en plus un point de non-ADN (dilutions rassemblées dans le tableau 3).
2. Préparer une solution de colorant par PCR Green I, suffisante pour que tous les échantillons (ADN purifié et des dilutions standards AH): diluer le colorant vert 10.000 fois dans un tampon TE 1X.
3. Ajouter 1 pi de chacun des échantillons d'ADN (ADN purifié et des dilutions standards AH) à 10 ul 1x colorant vert mix dans les capillaires cuvettes à lire dans un fluorimètre à 488 nm de longueur d'onde. Pour l'essai de non-ADN, en utilisant 1 ul de tampon TE 1X.
4. Construireune courbe d'étalonnage en utilisant un logiciel graphique et déterminer les concentrations relatives à la gamme d'échantillons d'ADN en ng / ul. L'ADN est alors prêt pour la PCR ou bien pour réaliser des bibliothèques de séquençage.

7. PCR

1. Sélection d'amorces
   1. Conception des amorces d'intérêt pour interroger les régions génomiques d'intérêt. Concevoir des amorces pour amplifier les régions activateurs de gènes en utilisant le navigateur de génome UCSC. Enhancers sont en outre prévues en utilisant H3K4me1 ou p300 ChIP-seq données ⁹ disponibles dans la série de données GEO.
2. PCR
   1. réactions Run PCR pour 45 cycles (8 s 95 ° C, 8 s 60 ° C, 8 sec 72 ° C) en utilisant un thermocycleur PCR en temps réel dans 25 ul colorant vert mélange, ADN 2 ng, et 0,5 ul mélange d'amorces (20 iM solution mère) ^10.
3. Analyse d'enrichissement
   1. Calculer l' enrichissement absolu en supposant que tout au plus 1% du nucléosome ont été immunoprécipités ^11.
   2. consir la génomique comme si enrichi 10 échantillons ng IP montrent une plus grande enrichissement par rapport à 0,1 ng d'ADN d'entrée.
   3. Exprimer les résultats que l'augmentation d'un facteur d'enrichissement en plus d'une région non enrichie après normalisation à l'entrée et l'ajustement d'un échantillon témoin non spécifique.
   4. Examiner l'ADN d'entrée devant être dilué par 100 (facteur de dilution ou DF).
   5. Normaliser l'entrée en utilisant l'équation suivante 2 ^-ΔCt x 100%, où -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Entrée x DF].
   6. Régler la commande à l'aide de l'équation suivante (ACt [IP] -ΔCt [NS]) où NS est l'échantillon non spécifique (aucun anticorps IP ou IgG IP).
   7. Calculer l'enrichissement pli de l'échantillon 2 ^-ΔΔCt. Un fichier comprenant toutes les étapes de calculs avec des formules dans lesquelles seulement chaque échantillon PCR peut être entré facilitera l'analyse des résultats.

Résultats

La figure 1A illustre d' abord la préparation de perles de liaison à l' ADN et le contrôle de qualité en utilisant l' ADN de différentes tailles (1 kb de l' échelle). 0ne, 2 et 2,5 volumes (1 à 3) de billes a été ajouté à un volume de l'échantillon à purifier les fragments d'ADN de taille moléculaire élevée et faible.

Les figures 1 B, C, D sont des exemp...

Discussion

L'épigénétique est devenue un domaine important de la recherche en biologie du développement. Comment un programme génétique est activé dans les cellules embryonnaires pour permettre aux cellules d'acquérir une identité spécifique au sein d'une lignée embryonnaire a été pendant longtemps une question clé pour les biologistes du développement.

ChIP a été largement utilisé dans les dernières années, et combiné à un séquençage d'ADN suivante amélioration...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F8775	Cell Fixation
Glycine	Sigma	G8898	Cross-link stop
Aprotinin	Fluka	10820	Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate	Sigma	L2882	Proteases inhibitor
PMSF	Sigma	P7626	Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads	Life technologies	10001D	Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads	Thermo Scientific	15002-01	DNA purification
Proteinase K	Life technologies	25530-015	Protein digestion
DNA BR standard	Life technologies	Q32850	Calibration range
Syber green	Molecular Probes	S-11484	DNA quantification
TE buffer	Invitrogen	P7589	DNA quantification
PBX 1x	Life technologies	14190-094	Washing
DNase RNase free water	Life technologies	10977-035	Dilution
Axygen tube	Axygen	MCT-175-C	ChIP purifiction
Antibody	Company	Reference	ChIP concentration
H3K27ac	Abcam	ab4729	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1	Diagenode	C15410194 (pAb-194-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3	Diagenode	C15410058 (pAb-058-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2	Diagenode	C15410060 (pAb-060-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3	Diagenode	C15410030 (pAb-030-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3	Diagenode	C15410069 (pAb-069-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues