배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

요약

유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.

초록

특정 유전자 전사는 배아 개발하는 동안 세포 운명 결정의 기초가 중요한 생물학적 과정이다. 생물학적 공정은 증강 및 심근 구성 적 유전자의 프로모터를 포함 유전자 조절 영역을 결합 전사 인자에 의해 매개된다. DNA는 화학적 변형을 실시한다 히스톤 주위에 싸여있다. 히스톤의 수정은 추가하여 유전자 전사의 미세 조정 규제의 또 다른 레벨을 가져, 활성화, 억압 또는 태세 유전자 전사로 이어집니다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)가 심장 개발의 초기 단계에 배양체 (즉, 세포 집합체) 내에 또는 2D 배양 요점을 되풀이. 그들은 염색질 면역 침전 (칩)를위한 원칙 충분한 재료 제공, 기술은 크게 유전자 조절 영역을 식별하는 데 사용. 또한, 인간 ES 세포 cardiogenesis의 인간 세포 모델을 나타낸다. 개발의 나중 단계에서 마우스 배아 조직을 허용셀 정체성 결정에 필요한 특정 후생 유전 학적 풍경을 조사. 여기서, 우리는 PCR 또는 ES 세포, 배아 체 심장 특정 배아 영역을 사용하여 칩 시퀀싱 뒤에 칩, 연속 칩의 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 심장 유전자 전사의 후생 유전 학적 조절 조사를 할 수 있습니다.

서문

심장은 제 장기가 형성 될 상기 배아 기능하게하는 것이다. 심장은 제 1 및 제 2 배아 심장 필드 ^1에서 발생하는 많은 세포 계통에서 만들어집니다. 후 시비 배반포는 모양의 마음까지 무대에서 배아 세포는 많은 세포 운명 결정을하는 것이 있습니다. 유전자 전사는 시간과 공간에 의존하는 방식으로 규제 및 배아 개발하는 동안 세포 운명 결정의 기초가 중요한 생물학적 과정이다. 이러한 공정은 증강 및 심근 구조적 유전자의 프로모터를 포함하는 게놈 내에서 조절 영역을 특정 결합 전사 인자에 의해 매개된다. DNA는 예컨대 아세틸 화, 메틸화, ubiquitinylation 및 / 또는 인산화와 같은 변형을 실시 히스톤 감싸된다. 히스톤 변형 히스톤의 리신 잔기 ⁽²⁾ 개질 된 따라 활성화 또는 억압 태세 유전자 전사를 이끈다.

jove_content "> 염색질 면역 분석법 (칩) 년전 ³ 설정된 가장 광범위하게 사용되는 기술은 수정 된 히스톤 또는 전사 인자 ^4. 히스톤 또는 전사 인자의 면역 따라 하나의 타겟을 식별하기 위해 현재, 결합 된 DNA 일 수있다 어느 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭 또는 염기 서열. 칩은 기술적으로 어려운 겔 지연 분석법 ^(5)를 극복하고있다. 그러나 칩 DNA 겔 지연 분석법의 장점에 대한 전사 인자의 결합을 직접적으로 암시하지 않는다. 한편, 칩상의 DNA 염기 서열에 결합하여 유전자 조절에 대한 새로운 게놈 넓은 시각을 열었습니다.

ES 세포 (ES 세포) 배양체 내 요점을 되풀이 (즉. 세포 응집체) 또는 2D 배양 심근 ⁶ 개발의 초기 단계에서 및 칩 원리 충분한 재료에 제공한다. 또한, 인간 ES 세포는 CA의 인간 세포 모델을 나타낸다자신의 심인성 가능성이 있지만 rdiogenesis은 후생 유전 학적 서명 ^(7)에 따라 달라집니다. 개발의 나중 단계에서 마우스 배아 조직 세포 정체성의 결정에 필요한 특정 후생 유전 학적 풍경을 조사를 허용합니다. 그러나, 게놈은 시간과 세포 유형 특정 방식으로 ⁸ 전사된다. 유전자 전사의 성적인 규제는 지역화 된 영역 내에서 연구되어야한다. 여기서, 우리는 PCR 또는 시퀀싱 ES 세포, 배아 체 심장 특정 배아 영역을 사용하여 다음 칩, 연속 칩의 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 심장 유전자 전사의 후생 유전 학적 조절 조사를 할 수 있습니다.

프로토콜

1. DNA 단백질 교차 결합

1. ES 세포와 배아 심장 조직에서 생성 된 15 ml의 튜브에 고정 수확-ES 세포 (일반 칩 2 × 10 ⁶ 세포, 마이크로 칩 2 × 10 ⁵ 세포), 배아 체 (사채)을 E9.5 마우스 배아에서 해부 (방실 운하, 유출 기관 및 뇌실) 세포 또는 배아 조직에 대한 permeabilization의 PB2 버퍼에 PBS에 1 %의 포름 알데히드를 사용하여. 정확히 10 분 동안 실온에서 60 rpm의 속도로 진탕에 튜브를 놓는다.
2. 125 mM의 최종 농도 글리신을 첨가하여 가교 반응을 정지하고 60 rpm의 속도로 진탕 기에서 실온에서 5 분 동안 배양한다.

2. 세포 용해 및 염색질 조각화

1. PBS 1X 또는 배아 조직을 1 ml의 PB2에 재현 탁 ml의 두 배 (10)에 재현 탁 가교 세포를 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
2. PB1 또는 PB2 (2 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 1 μg의 / ㎖ 아프로 티닌, 0.1 mM의 PMSF) (표 1) 버퍼 프로테아제 억제제를 추가합니다. 각각 버퍼 PB1 또는 PB2 1 ml의 2.1 단계에서 세포 펠렛 또는 배아 조직을 재현 탁. 피펫 상하과 세포 나 조직을 재현 탁. 세포 나 조직을 균질화 21 게이지 바늘로 1 ML의 주사기를 사용합니다. 10 분 동안 (바퀴)에 4 ° C에서 품어.
3. 4 ° C에서 5 분 동안 3,000 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 버린다.
4. 깨끗한 튜브 프로테아제 억제제가 보충 각 SB 버퍼 (표 1) 300 μL에 펠렛을 재현 탁 (RNA 분해 효소, DNase- 인증 및 발열원이없는)의 모든 DNA 저하를 방지 할 수있다. 얼음에 15 ~ 30 분 동안 품어.
5. 각 재료에 대해, 표 2에 나열된 프로그램에 따른 초음파 처리기를 사용하여 염색질 전단 4 ℃에서 샘플을 초음파 처리. <(다음의 용도에 따라 초음파 처리 시간을 조정EM> 즉, PCR 또는 시퀀싱). 전단 DNA 크기는 PCR 500 bp의 시퀀싱 300 bp의 주위해야한다.
6. 원심 분리기는 깨끗한 1.5 ML 튜브에 뜨는 (염색질)을 전송하고 펠렛을 폐기, 4 ° C에서 6,000 XG에 10 분 동안 세포 용 해물을 초음파.
7. 물로 10 회 용액 염색질 (상등액을 완충액 B)을 희석하고, 나노 분광 1.5 μL를 사용하여 광학 밀도를 평가한다. 0.76 X OD _260-1.55 X OD ₂₈₀ : 다음 공식을 사용하여 μg의 / ㎕의 단백질의 농도를 얻습니다.

완충기	이용	구성				재료
에이	Permeabilization	PB1 : 5 밀리미터 파이프의 pH 8; 85mM의 KCl; 0.5 % NP40				모든
		PB2 : 15 mM의 HEPES pH가 7.6, 15 mM의 NaCl을 4 mM의 MgCl2를 60 mM의 KCl을 0.5 % 트리톤 X-100				배아 조직
비	용해 / 초음파 처리	SB1 : 1 % SDS; 10 mM의 EDTA; 50mM 트리스 - 염산 pH를 8				ESC
		SB2는 50mM HEPES-KOH pH7.9; 140 밀리미터; 를 1mM EDTA; 0.1 % 데 옥시 콜레이트; 0.1 % SDS				사채
		SB3 : 15 mM의 HEPES pH7.6, 15 mM의 염화나트륨; 60 밀리미터의 KCl, 1mM의 EDTA, 0.5 mM의 EGTA; 1 % 트리톤 X100 0, 0.1 % SDS, 0.5 % laurylsarcosine				배아 조직
기음	칩 버퍼	150 mM의 NaCl을; 50mM 트리스 - 염산 pH를 7.5; 5 mM의 EDTA; 0.5 % NP40; 1 % TRITON-X100.				모든
디	DNA / 단백질 용출	D1 : 1 % SDS; (100)밀리미터의 NaHCO3 D2 : 50 mM 트리스 pH를 7.6 / 5 mM의 EDTA, 15 mM의 DTT, 2 % SDS
이자형	DNA 바인딩 비드 준비	E : 20 % PEG 8000; 2.5 M의 NaCl; 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8; 를 1mM EDTA

표 1. 칩 버퍼.

자료	초음파 프로그램
배아 줄기 세포	30 초 ON의 15주기와 OFF 30 초
배아 체	30 초 ON의 30주기와 OFF 30 초
배아 조직	30 초 ON의 21주기와 OFF 30 초

표 2. 초음파 처리 프로그램.

3. 면역 침전 및세척

1. 버퍼 C로 3 회 단백질 A-복합 구슬을 씻으십시오. 깨끗한 1.5 ML 튜브에 비즈 100 μl를 타고 버퍼 C (표 1) 1 ㎖를 추가합니다. 튜브는 다음에 자석로 전사되고; 1 분 동안 기다린 뜨는을 대기음. 두 번 세척 단계를 반복합니다.
2. 깨끗한 1.5 ㎖의 튜브에 프로테아제 억제제가 보충 20 ㎕의 세정 된 단백질 공역 비즈 완충액 C 1 ㎖ 변성 히스톤 또는 전사 인자 (표 3 농도)에 대해 발생 된 항체를 부화. 4 ° C에서 최소 2 시간 동안 40 rpm으로 회 전자에 샘플을 설정합니다.
3. 워시 항체 - 비드를 완충액 C 1 ㎖ (3.1에 ​​기재된 조작)로 3 회 복합체.
4. 준비 2 튜브를 함유 한 150 염색질 항체 - 구슬 단지의 μg의 세척 구슬 150 염색질의 μg의 20 μl를 포함하는 다른 관; 각 튜브에 프로테아제 억제제가 보충 완충액 C 1 ㎖를 추가4 ℃에서 하룻밤 동안 40 rpm으로 회전하는 바퀴에 샘플을 품어.
   참고 : 염색질의 농도는 적어도 300 μg의는 전사 인자 또는 순차적 칩을 면역 침전 할 수 있어야합니다.

표준	농도 (NG / μL)	볼륨 (μL)	총 DNA 농도 (NG)
에이	10.0	1	10.0
비	5.00	1	5.00
기음	2.50	1	2.50
디	1.25	1	1.25
이자형	0.625	1	0.625
에프	0.3125	1	00.3125
지	0.156	1	0.156
H	0.0	1	0.0

표 3. 표준 농도.

4. DNA 용출, 크로스 링크 취소 및 테 K 소화

1. 자기 랙에 샘플을 설정합니다. 언 바운드 항체 염색질을 포함하는 상층 액을 복구 할 수 있습니다.
   주의 : 샘플을 신속하게 스텝 액체 질소에 냉동 -80 ℃에서 저장 될 수있다. 염색질 다른 항체와 다른 면역 분석법에 사용할 수있다. 버퍼 C 1 ㎖ (전술 조작)와 각 샘플 3 회 반복한다.
2. 순차 칩 세정 칩의 재료 (표 1)을 수행 할 경우 버퍼 D1 또는 D2의 150 μl를 첨가하여 항체 - 결합 된 단백질을 용출하고, 가열 블럭에서 50 ℃에서 20 분 동안 샘플을 배양한다.
3. 에서 튜브를 제거가열 블록 및 자기 랙에 샘플을 넣어, (RNA 분해 효소, DNase- 및 발열 물질이없는 인증) 깨끗한 1.5 ML 튜브에 뜨는을 복구하고 구슬을 버린다.
4. 버퍼 C 2 권 제 3 μg의 항체에 1을 가산 순차 칩 상층 액을 사용하여 200 mM의 최종 농도를 얻기 위해 5 M NaCl을 첨가하여 가교 역방향.
5. 깨끗한 1.5 ㎖의 튜브에 염색질의 입력 샘플을 제조 (RNA 분해 효소, DNase- 인증 및 발열 성)을 물 150 μL의 최종 부피에서 IP 샘플 (150 μg의)의 것과 염색질 동일한 양의 복용 (의 RNase DNase의 무료 물). 200 mm의 최종 농도 500의 NaCl을 추가합니다. 65 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어.
6. 다음날, 가열 블록으로부터 샘플을 분리 칩 재료 250 μg / ML의 최종 농도를 수득하고, 2 시간 동안 55 ° C에서 소화 12.5 mM 내지 티나 제 K를 최종 농도를 얻기 위해 250 mM의 EDTA를 추가 가열 블록.

5. DNA 분리 DNA 결합 비즈를 사용하여

1. 구슬의 준비
   1. 적어도 30 분, 와류에 대한 비드 철저히을 실온에서 비드를 가지고 시작한다. 비즈 정착, 그래서 피펫 팅 할 때 빠르게 작동합니다. 깨끗한 1.5 ML 튜브에 전송 구슬 1 ㎖ (RNA 분해 효소, DNase- 및 발열 물질이없는 인증).
   2. 이 솔루션은 명확히하기 위해 3 분, 폐기 뜨는 - 자석에 설정이 기다립니다. 자석에서 제거 0.5 M EDTA 1 ㎖를 추가하고 간단한 텍싱하여 혼합한다.
   3. 단계를 반복 5.1.2 두 번, 그리고 마지막에 상층 액을 버린다.
   4. 자석에서 제거 버퍼 E 1 ㎖를 추가하고 천천히 구슬을 재현 탁. 쉐이커에 버퍼 E. 놓고 50 ㎖로 전 혼합 (버퍼 E 구슬)를 전송하고 실온에서 1 시간 동안 서서히 혼합 하였다.
   5. 비드를 50 μL / DNA (1 부피 / 1 부피) 50 μL, 비드 100 ㎕ : 시험 3의 실험 조건을 이용하여 후술하는 정제 프로토콜 다음 비드 DNA 결합/ DNA의 50 μL (2 권 / 1 볼륨) 및 구슬 125 μL / DNA의 50 μL (2.5 볼륨 / 1 볼륨). 조각 (도 1a)의 크기를 확인하기 위해 1.5 % 아가 로즈 겔에서 정제 된 DNA를 이전하자.
2. DNA 정제
   1. 각각의 DNA 샘플 (약 170 μL)에 자석 구슬을 결합 DNA의 425 μL (2.5 권)를 추가합니다. 하 (약 10 배)를 피펫 팅에 의해 서서히 재현 탁하고 실온에서 10 분간 배양한다.
   2. 다음 뜨는 기음과 (자석에) 폐기, 5 분 동안 자석에 놓습니다.
   3. 1 분, 기음 뜨는를 기다리고 폐기 한 후 한 번 더 이전 단계를 반복 자석에 튜브에 갓 80 % 에탄올 600 μl를 추가합니다.
   4. 빠른 스핀을주고 5 초 (미세 원심 분리)를 위해, 자석에 튜브를 놓고 에탄올의 마지막 방울을 제거합니다. 실온에서 1 분 동안 건조하자
   5. DNase의 자유의 RNase 물 20 μl를 첨가하여 DNA를 용출시킨다. 자석에서 제거하고 샘플을 소용돌이.
   6. 실온에서 3 분 동안 품어 다음 자석에 샘플을 배치합니다. 새로운 튜브에 대기음 용출 된 DNA는 (RNA 분해 효소, DNase- 및 발열 물질이없는 인증).
   7. DNA 단편 (도 1b)의 크기를 확인하기 위해 1.5 % 아가 로즈 겔의 입력 부분으로부터 DNA를 실행.

6. DNA 정량은 형광 탐지 장비를 사용하여

1. 직렬 7 희석 플러스 노 DNA 포인트 (표 3에 모여 희석)의 총을주고 물 1 μg의 DNA를 (1킬로바이트 사다리)에 희석.
2. PCR 그린 I 염료 용액을 제조, 모든 샘플 (정제 DNA 및 표준 희석 AH)에 대한 충분한 : 1X TE 버퍼에서 녹색 염료를 10000 희석.
3. 모세 혈관의 큐벳에 10 ㎕의 1 배 녹색 염료 믹스 각각의 DNA 샘플 (정제 DNA 및 표준 희석 AH) 1 μl를 추가는 488 nm 파장에서 형광 계에서 읽을 수 있습니다. 무 DNA 분석의 경우, 1X TE 완충액 1 μl를 사용한다.
4. 짓다검량선 그래픽 소프트웨어를 사용하여 NG / μL의 DNA 샘플들의 범위에 대한 상대 농도를 결정한다. DNA를 PCR을위한 다음 준비 또는 시퀀싱 라이브러리를 만들 수 있습니다.

7. PCR

1. 프라이머의 선택
   1. 관심의 디자인 프라이머는 관심의 게놈 영역을 심문한다. 프라이머 디자인은 UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 유전자의 인핸서 영역을 증폭한다. 증강은 더 GEO 데이터 세트에서 ⁹ 자료 없음 H3K4me1 또는 P300 칩-서열을 이용하여 예측된다.
2. PCR
   1. 45 사이클 (8 초 ~ 95 ° C, 8 초, 60 ℃, 8 초 72 ° C) 25 μL 녹색 색소 혼합이 NG의 DNA 및 0.5 ㎕를 프라이머 믹스 실시간 PCR 용 열 순환기를 사용하는 실행 PCR 반응 (20 μM 원액) ^10.
3. 농축 분석
   1. 뉴 클레오의 최대 1 %가 ¹¹ 면역 있다고 가정하고 절대 농축을 계산합니다.
   2. ConsideR 입력 DNA의 0.1 NG에 비해 10 NG의 IP 샘플이 큰 농축을 보여 주면 농축으로 게놈.
   3. 비특이적 대조군 샘플과 입력 및 조정을 정상화 비 농후 영역 위에 농축의 배 증가와 같은 결과를 표현한다.
   4. 입력 DNA가 100 (희석 배수 또는 DF)에 의해 희석 될 것이 좋습니다.
   5. 코네티컷 [DF X 입력] - 다음의 수학 식 2 ^-ΔCt × 100 % -ΔCt = 코네티컷 [IP]를 사용하여 입력을 정상화.
   6. 다음 식을 이용하여 제어를 조정 (ΔCT [IP] -ΔCt [NS]) NS는 비특이적 샘플 (항체없는 IP 또는 IgG의 IP)는이다.
   7. 2 ^-ΔΔCt로 샘플의 배 농축을 계산합니다. 각 PCR 샘플 결과의 분석을 용이하게 입력 할 수있는 방식으로 모든 계산 단계를 포함하는 파일.

결과

도 1a는 제 DNA 결합 비즈 다른 크기 (1킬로바이트 사다리)의 DNA를 이용하여 품질 관리의 제조를 예시한다. 0ne, 구슬이 2.5 부피 (1 내지 3)는 고 및 저 분자량 크기의 DNA 단편을 정제 할 수있는 샘플의 하나의 볼륨에 첨가 하였다.

도 1 B, C, D는 각각 마우스 ES 세포 또는 배아 체 (25 E9.5 심실 풀링) 배아 심장 ...

토론

후성 유전학이 발달 생물학 연구의 중요한 분야가되고있다. 유전 적 프로그램이 배아 혈통 내에서 특정 ID를 인수로 셀 수 있도록 배아 세포에서 활성화하는 방법을 오랜 시간 동안 발달 생물 학자에 대한 핵심적인 질문이었다.

칩은 크게 마지막 년 이내에 사용 순서의 해상도 향상 다음 DNA 염기 서열에 결합하고있다. 이 넓은 의존적으로 게놈의 셀 또는 특정 배아 및 성인 조...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F8775	Cell Fixation
Glycine	Sigma	G8898	Cross-link stop
Aprotinin	Fluka	10820	Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate	Sigma	L2882	Proteases inhibitor
PMSF	Sigma	P7626	Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads	Life technologies	10001D	Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads	Thermo Scientific	15002-01	DNA purification
Proteinase K	Life technologies	25530-015	Protein digestion
DNA BR standard	Life technologies	Q32850	Calibration range
Syber green	Molecular Probes	S-11484	DNA quantification
TE buffer	Invitrogen	P7589	DNA quantification
PBX 1x	Life technologies	14190-094	Washing
DNase RNase free water	Life technologies	10977-035	Dilution
Axygen tube	Axygen	MCT-175-C	ChIP purifiction
Antibody	Company	Reference	ChIP concentration
H3K27ac	Abcam	ab4729	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1	Diagenode	C15410194 (pAb-194-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3	Diagenode	C15410058 (pAb-058-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2	Diagenode	C15410060 (pAb-060-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3	Diagenode	C15410030 (pAb-030-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3	Diagenode	C15410069 (pAb-069-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues