Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Özet

Gen transkripsiyonu bir ince ayar düzenlemesi embriyonik hücre kaderi kararı temelini oluşturmaktadır. Bu yazıda, kök hücre ve fare embriyoları kalp gelişimi hem kalp farklılaşma epigenetik düzenleme araştırmak için kullanılan kromatin immünopresipitasyon analizler açıklanmaktadır.

Özet

Özgü gen transkripsiyonu embriyonik gelişim sırasında hücre kaderi kararı altında yatan önemli bir biyolojik süreçtir. Biyolojik işlem arttırıcılar ve kardiyak yapısal genlerin promoterleri de dahil olmak üzere genomik düzenleyici bölgeleri bağlanan transkripsiyon faktörleri tarafından aracılık edilir. DNA, kimyasal modifikasyonlar maruz histonlar sarılır. histon modifikasyonları daha böylece gen transkripsiyonu ince ayar düzenlemesi bir seviye getiren, aktif, bastırılmış ya da kendine hakim gen transkripsiyonu yol açar. Embriyonik Kök hücreler (ES hücreleri) kalp gelişiminin erken adımlar embriyoid organları (yani, hücre agrega) içinde veya 2D kültüründe özetlemek. Onlar kromatin immunoprecipitation (ChIP) için prensip yeterli malzemenin temin, teknik geniş gen düzenleyici bölgeleri tanımlamak için kullanılan. Ayrıca insan ES hücreleri cardiogenesis bir insan hücre modeli temsil etmektedir. gelişimin ileriki aşamalarında, fare embriyonik dokular için izinHücre kimliğinin belirlenmesi için gerekli olan özel epigenetik manzara soruşturma. Bu yazıda, PCR veya ES hücreleri, embriyoid organları ve kardiyak spesifik embriyonik bölgeleri kullanarak ChIP-dizileme ile takip ChIP, ardışık ChIP protokollerini tanımlar. Bu protokoller kardiyak gen transkripsiyonu epigenetik düzenleme soruşturma için izin verir.

Giriş

Kalp ilk organ oluşturulacak ve embriyo fonksiyonel olmaktır. Kalp birinci ve ikinci embriyonik kalp alanları ¹ kaynaklanan birçok hücre soyları inşa edilmiştir. sonrası fertilizasyon blastosist şekilli kalp kadar sahneleyecek itibaren, embriyonik hücreler birçok hücre kader kararlar dolayısıyla var. Gen transkripsiyonu zaman ve uzay-bağlı bir şekilde düzenlenir ve embriyonik gelişim esnasında hücre kaderi karar altında yatan temel biyolojik bir süreçtir. Bu tür bir işlem arttırıcılar ve kardiyak yapısal genlerin promoterleri de dahil olmak üzere genomu içindeki düzenleyici bölgeleri bağlanan spesifik transkripsiyon faktörleri tarafından aracılık edilir. DNA, asetilasyon, metilasyon, ubikuitinilasyon ve / veya fosforilasyon gibi modifikasyonlara maruz histonlar sarılır. Histon modifikasyonu histonun lizin tortusu ² modifiye edildiği olarak aktif, baskılanmış ya da kendine hakim gen transkripsiyonu yol açar.

jove_content "> Kromatin immünopresipitasyon deneyi (ChIP) yıl önce ³ kurulmuştur ve en yaygın olarak kullanılan teknoloji modifiye histon ya da transkripsiyon faktörleri ^4. histon veya transkripsiyon faktörlerinin immunoprecipitation takiben ya hedeflerini belirlemek için şu anda, ciltli DNA olabilir ya da polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilir veya dizilenmiştir. ChIP teknik olarak daha zor jel retardasyon testleri ⁵ üstesinden gelmiştir. Bununla birlikte yonga DNA, jel retardasyon tahlilinde bir avantajı, bir transkripsiyon faktörü bağlanma doğrudan anlamına gelmez. Öte yandan, bir çip üzerinde DNA dizilimi kombine gen düzenlemesi üzerinde yeni bir genom perspektif açtı.

ES hücreleri (ES hücreleri) embriyoid organları içinde özetlemek (yani., Hücre agrega) veya 2D kültürü kalp gelişimi ⁶ erken aşamaları ve ChIP için prensip yeterli malzemenin sağlamaktadır. Ayrıca insan ES hücreleri bir Ca insan hücre modeli temsil ederbunların kardiyojenik potansiyeli, ancak rdiogenesis kendi epigenetik imza ⁷ bağlıdır. gelişimin ileriki aşamalarında, fare embriyonik dokular, hücre kimliğinin belirlenmesi için gerekli olan özel epigenetik manzara soruşturma için izin verir. Bununla birlikte, genom, bir zaman ve hücre tipine özgü bir şekilde ⁸ transkripsiyonu. Gen transkripsiyonu epigenetik düzenlemesi lokalize bölgelerde çalışılması gerekmektedir. Bu yazıda, PCR veya sıralama ES hücreleri, embriyoid organları ve kardiyak spesifik embriyonik bölgeleri kullanarak takip ChIP, ardışık ChIP protokollerini tanımlar. Bu protokoller kardiyak gen transkripsiyonu epigenetik düzenleme soruşturma için izin verir.

Protokol

1. DNA-protein çapraz bağlanması

1. ES hücreleri ve embriyonik kalpte üretilen 15 ml tüpler saptamak hasat-ES hücreleri (normal yongası için 2 x 10 ⁶ hücre, mikroçip 2 x 10 ⁵ hücre), embriyoid organları (EBS) E9.5 fare embriyolarının (atriyoventriküler kanal, çıkış yolu ve ventrikül) hücreleri ya da embriyonik dokular için permeabilizasyon tampon maddesi içinde PB2 PBS içinde% 1 formaldehid kullanılmıştır. tam olarak 10 dakika için oda sıcaklığında 60 rpm'lik bir hızda orbital çalkalayıcı üzerinde tüpler yerleştirin.
2. 125 mM'lik bir son konsantrasyona değin glisin eklenerek çapraz bağlanma reaksiyonu durdurun ve 60 rpm bir hızda orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.

2. Hücre Lizis ve Kromatin Parçalanma

1. PBS 1X veya embriyo dokular 1 mi PB2 içinde yeniden süspansiyon haline mi iki kez 10 içinde yeniden süspansiyon haline çapraz bağlanmış hücreleri yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin. süpernatantlar atın.
2. PB1 ve PB2 (2 ug / ml löpeptin, 1 ug / ml Aprotinin, ve 0.1 mM PMSF) (Tablo 1) tampon proteaz inhibitörleri ekleyin. sırasıyla, Tampon PB1 ve PB2 1 ml Aşama 2.1 hücre pelleti veya embriyonik doku yeniden süspanse edin. Pipet yukarı ve aşağı ve hücreleri ya da dokuları tekrar süspansiyon. hücreler veya doku homojenize etmek için bir 21 gauge iğne ile 1 ml şırınga kullanın. 10 dakika süre ile (bir tekerlek), 4 ° C'de inkübe edin.
3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 3.000 xg'de Spin ve süpernatant atın.
4. Temiz bir tüp içinde, proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş, ilgili SB tampon (Tablo 1) 300 ul pelletini (RNase-, DNase- onaylı ve pirojensiz) herhangi bir DNA bozulmasını önlemek için. Buz üzerinde 15 ila 30 dakika süreyle inkübe edin.
5. Her malzeme için, Tablo 2'de listelenen programlara göre bir sonikatör kullanılarak kromatin kesme 4 ° C'de örnekleri sonikasyon. <(Sonraki uygulamaya bağlı olarak sonikasyon süresini ayarlamakem> yani PCR veya sıralama). Kesilmiş DNA boyutlu PCR için 500 bp ve dizileme için 300 bp civarında olmalıdır.
6. Santrifüj temiz 1.5 ml tüp içinde süpernatant (kromatin) transferi ve pelet atmak 4 ° C'de 6,000 x g'de 10 dakika boyunca hücre lizat sonike.
7. su ile 10 kez çözelti içinde kromatin (süpernatan tampon B) ile seyreltilir ve nano spektrofotometre 1.5 ul kullanılarak optik yoğunluk değerlendirmek. 0.76 x OD _260-1,55 x OD _280: aşağıdaki formül kullanılarak mikrogram / ​​ul protein konsantrasyonu elde.

Tampon	kullanım	kompozisyon				Malzemeler
bir	permeabilization	PB1: 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCI; % 0.5 NP40				Bütün
		PB2: 15 mM HEPES pH 7.6, 15 mM NaCI, 4 mM MgCI2 60 mM KCI,% 0.5 Triton X-100				embriyonik doku
B	Lizis / Sonikasyon	SB1:% 1 SDS; 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI pH 8				ESC
		SB2: 50 mM HEPES-KOH pH7.9; 140 mM; 1 mM EDTA; % 0.1 deoksikolat; % 0.1 SDS				EBS
		SB3: 15 mM Hepes pH 7.6, 15 mM NaCl; 60 mM KCI, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA; % 1 Triton-X100, 0 .1% SDS,% 0.5 laurilsarkozin				embriyonik doku
C	ChIP tampon	150 mM NaCI; 50 mM Tris-HCI, pH 7.5; 5 mM EDTA, % 0.5 NP40, % 1 Triton-X100.				Bütün
D	DNA / Protein elüsyonu	D1:% 1 SDS; 100mM NaHCO 3 D2: 50 mM Tris pH 7.6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT,% 2 SDS
E	DNA bağlama boncuk hazırlama	E:% 20 PEG 8000; 2.5 M NaCl; 10 mM Tris-HCI, pH 8; 1 mM EDTA

Tablo 1. Çips tamponlar.

Malzeme	sonication programı
Embriyonik kök hücreleri	30 sn ON 15 döngüleri ve KAPALI 30 sn
embriyoid organları	30 sn ON 30 döngü ve KAPALI 30 sn
Embriyonik dokular	30 sn ON 21 döngüleri ve KAPALI 30 sn

Tablo 2. Sonikasyon Programları.

3. immünopresipitasyon veyıkama

1. tampon C ile 3 kez Protein A-eşlenik boncuklar yıkayın. Temiz bir 1.5 ml tüp içinde tanelerin 100 ul alın ve tampon C (Tablo 1) 1 ml. Tüp daha sonra bir mıknatıs aktarılır; 1 dakika bekleyin ve süpernatant aspire. iki yıkama adımı yineleyin.
2. Temiz bir 1.5 ml tüp içinde proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş 20 yıkanmış protein ul bir konjüge boncuk ve tampon C 1 ml değiştirilmiş histonlann veya transkripsiyon faktörü (Tablo 3'te listelenen konsantrasyonlar) karşı bir antikorun inkübe edin. 4 ° C'de en az 2 saat boyunca 40 rpm'de, bir döndürücü üzerinde örnekleri ayarlayın.
3. Yıkama antikor boncuklar tampon C, 1 ml (3.1 tarif manipülasyon) ile 3 kez kompleksleri.
4. Hazırlayın 2 tüpler içeren bir 150 kromatin ve antikor-boncuk komplekslerinin ug ve yıkanmış boncuk 150 kromatin mikrogram ve 20 ul içeren diğer tüp; Her tüpe proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş tampon C 1 ml ekleyinve 4 ° C'de bir gece boyunca 40 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde örnekleri inkübe edin.
   Not: kromatin konsantrasyonu, en az 300 | ig bir transkripsiyon faktörü veya ardışık yongasının immünopresipitasyon olmalıdır.

Standart	yoğunluğu (ng / ml)	Hacim (ul)	Toplam DNA konsantrasyonu (ng)
bir	10.0	1	10.0
B	5.00	1	5.00
C	2.50	1	2.50
D	1.25	1	1.25
E	0.625	1	0.625
F	0.3125	1	00,3125
G	0.156	1	0.156
H	0.0	1	0.0

Tablo 3. Standartlar konsantrasyonları.

4. DNA Elüsyon, Çapraz bağ Ters ve Proteinaz K Sindirim

1. Manyetik rafa örnekleri ayarlayın. bağlanmamış antikor kromatin içeren süpernatant kurtarın.
   Not: Örnekler hızlı bir şekilde bu aşamada sıvı azot içinde dondurulmuş ve -80 ° C'de muhafaza edilebilir. Kromatin Diğer antikor diğer immünopresipitasyon işlemleri de kullanılabilir. tampon C, 1 ml (daha önce tarif edilen düzenleme) ile, her numune 3 kez yıkayın.
2. Sıralı ChIP yıkandı talaş malzemlerden (Tablo 1) yapılması gerekiyorsa tampon D1 ya da D2 150 ul ilave edilerek antikor bağlı proteinini ayrıştırmak ve bir ısıtma bloğu içinde 50 ° C'de 20 dakika boyunca numune inkübe edin.
3. tüpleri çıkarınısıtma bloğu ve manyetik rafa örnekleri koymak, (RNase-, DNase- ve pirojensiz onaylı) temiz bir 1.5 ml tüp süpernatant kurtarmak ve boncuk atın.
4. tampon C 2 hacim ikinci antikorun 3 ug 1 ekleyerek sıralı çip için süpernatan kullanarak veya 200 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere 5 M NaCl ilave edilerek çapraz ters.
5. Temiz bir 1.5 ml tüp içinde kromatin bir giriş, örnek hazırlama (RNase-, DNase- onaylı ve pirojensiz) su, 150 ul nihai hacim içinde, IP örnek (150 ug) bu kadar kromatin aynı miktarda alarak (RNase DNaz ücretsiz su). 200 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar 5M NaCI ekleyin. 65 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
6. Bir sonraki gün, ısıtma bloğundan numunelerin çıkarılması cips malzemesinin 250 ug / ml'lik bir son konsantrasyon elde etmek ve 2 saat süre ile 55 ° C 'de sindirimi 12.5 mm ve proteinaz K bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere, 250 mM EDTA ilave ısıtma bloğu.

5. DNA İzolasyon DNA bağlanan boncuklar kullanılarak

1. tanelerin hazırlanması
   1. En az 30 dakika, girdap için boncuklar iyice oda sıcaklığında boncuk getirmek başlayın. Boncuk yerleşmek, bu yüzden pipetlerken zaman hızlı çalışır. Temiz bir 1.5 ml tüp Transfer boncuk 1 ml (RNase-, DNase- ve pirojensiz onaylı).
   2. Çözelti netleştirmek için 3 dakika, ıskarta süpernatant - mıknatıs üzerinde yer alan 2 bekleyin. Mıknatısa çıkar 0.5 M EDTA 1 ml ilave edilir ve kısa bir vorteks ile karıştırın.
   3. Adımı tekrarlayın 5.1.2 kez, ve sonunda süpernatant atın.
   4. , Mıknatıs kaldırmak tampon E 1 ml ekleyin ve yavaş yavaş boncuklar tekrar süspansiyon. bir çalkalayıcı üzerinde bir tampon E yerine 50 ml tüm karışımı (Tampon E boncuklar) aktarmak ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın sağlar.
   5. boncuk tanelerin 50 ul / DNA (1 hacim / 1 hacim) 50 ul, boncuk 100 ul: test 3 deney koşulları kullanılarak aşağıda tarif saflaştırma protokolü takip boncuk DNA bağlayıcıDNA / 50 ul (2 hacim / 1 hacim) ve boncuk 125 ul / DNA 50 ul (2.5 hacim / 1 hacim). Fragmanları (Şekil 1A) boyutunu kontrol etmek için bir% 1.5 agaroz jel üzerinde saflaştırılmış DNA göç edelim.
2. DNA saflaştırma
   1. Her bir DNA örneği (yaklaşık 170 ul) manyetik boncuk bağlama DNA 425 ul (2.5 hacim) ilave. Aşağı (yaklaşık 10 kat) ve yukarı pipetlenerek yavaş yavaş yeniden süspanse edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   2. Daha sonra süpernatant aspire ve (mıknatıs üzerine) atmak, 5 dakika mıknatıs üzerine yerleştirin.
   3. 1 dakika, aspirat süpernatant bekleyin ve atın ve sonra bir kez daha önceki adımı tekrarlayın, mıknatıs üzerinde tüp taze yapılmış% 80 etanol 600 ul ekleyin.
   4. Hızlı bir spin vermek 5 sn (mikrofujü) için, mıknatıs üzerinde tüp yerleştirmek ve etanol son damla kaldırın. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca kuruması
   5. DNaz RNazsız su 20 ul ekleyerek DNA Zehir. mıknatıs çıkarın ve örnek vorteks.
   6. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra bir mıknatıs üzerinde örnekleri yer. yeni bir tüp içine aspire Yıkanarak ayrılan DNA (RNase-, DNase- ve pirojensiz onaylı).
   7. DNA fragmanları (Şekil 1B) boyutunu kontrol etmek için bir% 1.5 agaroz jel üzerinde giriş fraksiyonu DNA çalıştırın.

6. DNA Niceleme bir Floresan Algılama Instrument kullanma

1. Seri olarak 7 dilüsyon artı herhangi bir DNA alanına (Tablo 3 'de elde edilen seyreltme) bir toplamını elde etmek üzere su 1 ug DNA (1 kb merdiven) içerisinde seyreltin.
2. PCR Green I bir boya çözeltisi hazırlanır, bütün örneklerde (saflaştınldı, DNA ve standart dilüsyonlar AH) için yeterli: 1X TE tampon maddesi içinde yeşil boya 10,000X seyreltin.
3. kılcal damarların küvetlerde 10 ul 1x yeşil boya karışımı her DNA örnekleri (saflaştırılmış DNA ve standart dilüsyonlar AH) 1 ul ekleyin 488 nm dalga boyunda bir florimetrede okunmalıdır. Resim-DNA testi için, 1 x TE tamponu 1 ul kullanımı.
4. İnşa etmekBir kalibrasyon eğrisi grafik yazılımı kullanılarak ve ng / | il DNA örneklerinin aralığına görece derişimlerini saptamak. DNA, PCR için hazır bir hale gelir ve dizileme kütüphaneler için.

7. PCR

1. primerlerin seçimi
   1. ilgi astar tasarımı ilgi genomik bölgeleri sorgulamak için. Tasarım primerler UCSC genom tarayıcısı kullanarak genlerin arttırıcı bölgelerini yükseltmek için. Arttırıcılar daha GEO veri kümesinde ⁹ Eldeki veriler H3K4me1 veya p300 ChIP-seq kullanılarak tahmin edilmektedir.
2. PCR
   1. 45 döngü (8 saniye 95 ° C, 8 saniye 60 ° C, 8 saniye, 72 ° C) 25 ul yeşil boya karışımı, 2 u.g DNA ve 0.5 ul primer karışımı bir gerçek-zamanlı PCR PCR kullanarak Çalışma PCR reaksiyonları (20 mcM stok çözelti) ^10.
3. zenginleştirme analizi
   1. Nükleozom en çok% 1 ¹¹ immunoprecipitated olduğunu varsayarak Mutlak zenginleştirmeyi hesaplayın.
   2. inceler giriş DNA 0.1 ng ile karşılaştırıldığında 10 ng IP örnekleri daha büyük bir zenginleşme gösteriyorsa zenginleştirilmiş olarak genomik.
   3. spesifik olmayan bir kontrol numunesi ile giriş ve ayarlamasına normalleştirme sonra zenginleştirilmemiş bölge üzerinde zenginleştirme misli artış olarak sonuçları ifade eder.
   4. giriş DNA 100 (seyreltme faktörü veya DF) ile seyreltilmesi düşünün.
   5. Ct [DF x Girdi] - aşağıdaki denklem 2 ^-ΔCt x 100%, -ΔCt = Ct [IP] kullanarak giriş normalleştirmek.
   6. Aşağıdaki denklem kullanılarak kontrolünü ayarlayın (ACt [IP] -ΔCt [NS]) AD spesifik olmayan numune (hiçbir antikor IP veya IgG IP) olduğu.
   7. 2 ^-ΔΔCt olarak numunenin kat zenginleştirme hesaplayın. sadece her PCR örneklerinin sonuçlarının analizini kolaylaştıracak girilebilir hangi formülleri ile hesaplamaların tüm adımları içeren bir dosya.

Sonuçlar

Şekil 1A, ilk DNA bağlayıcı boncuk ve farklı boyutlarda (1 kb merdiven) DNA kullanılarak kalite kontrol hazırlanmasını görüntülemektedir. 0NE, boncuk 2 ve 2.5 hacim (1 ila 3), yüksek ve düşük moleküler boy DNA fragmanlarının saflaştırmak için örnek bir hacim ilave edilmiştir.

Şekil 1 B, C, D, sırasıyla fare ES hücreleri, embriyoid organları ya da (25 E9.5 ventrikü...

Tartışmalar

Epigenetik gelişim biyolojisinde önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. genetik program embriyonik soyu içinde özel bir kimlik edinme hücreleri izin embriyonik hücreler aktive nasıl uzun süre gelişimsel biyologlar için bir kilit soru olmuştur.

ChIP genel olarak son yıllarda içinde kullanılan ve sıralama çözünürlükte iyileştirilmesi ile DNA sekanslaması için kombine edilmiştir. Bu geniş bağımlı şekilde bir genom hücreleri veya belirli embriyonik ve yeti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F8775	Cell Fixation
Glycine	Sigma	G8898	Cross-link stop
Aprotinin	Fluka	10820	Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate	Sigma	L2882	Proteases inhibitor
PMSF	Sigma	P7626	Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads	Life technologies	10001D	Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads	Thermo Scientific	15002-01	DNA purification
Proteinase K	Life technologies	25530-015	Protein digestion
DNA BR standard	Life technologies	Q32850	Calibration range
Syber green	Molecular Probes	S-11484	DNA quantification
TE buffer	Invitrogen	P7589	DNA quantification
PBX 1x	Life technologies	14190-094	Washing
DNase RNase free water	Life technologies	10977-035	Dilution
Axygen tube	Axygen	MCT-175-C	ChIP purifiction
Antibody	Company	Reference	ChIP concentration
H3K27ac	Abcam	ab4729	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1	Diagenode	C15410194 (pAb-194-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3	Diagenode	C15410058 (pAb-058-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2	Diagenode	C15410060 (pAb-060-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3	Diagenode	C15410030 (pAb-030-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3	Diagenode	C15410069 (pAb-069-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues