Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Zusammenfassung

Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.

Zusammenfassung

Spezifische Gen-Transkription ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Der biologische Prozess wird durch Transkriptionsfaktoren vermittelt, die genomischen regulatorischen Regionen einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die zu chemischen Modifikationen unterzogen werden. Modifikationen von Histonen führen weiter zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen-Transkription, also eine andere Ebene der Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zu bringen. Embryonale Stammzellen (ES - Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh Zellaggregate) oder in der 2D - Kultur der frühen Schritte der Herzentwicklung. Sie bieten im Prinzip genügend Material für Chromatinimmunpräzipitation (CHIP), eine Technologie, im Großen und Ganzen verwendet Gen regulatorischen Regionen zu identifizieren. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine humane Zellmodell Kardiogenese. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonalen Mausgeweben fürUntersuchung spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, sequentielle ChIP gefolgt von PCR oder Chip-Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.

Einleitung

Das Herz ist das erste Organ gebildet wird und in dem Embryo funktionalen zu werden. Das Herz wird aus vielen Zelllinien aufgebaut , die von den ersten und zweiten embryonalen Herzfelder ¹ entstehen. Von der nach der Befruchtung Blastozyste zu dem geformten Herz bis zu inszenieren, haben embryonale Zellen so viele Zellschicksal Entscheidungen zu treffen. Gen-Transkription wird in einem zeit- und ortsabhängig geregelt und ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Ein derartiges Verfahren ist durch spezifische Transkriptionsfaktoren vermittelt, die innerhalb des Genoms einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen Regulationsregionen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die Modifikationen wie Acetylierung unterworfen sind, Methylierung, Ubiquitinierung und / oder Phosphorylierung. Histonmodifikation führt zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen - Transkription in Abhängigkeit von dem Lysin - Rest von Histon ² modifiziert.

jove_content "> Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde Jahre angelegt ³ vor und ist derzeit das am weitesten verbreitete Technologie, um Ziele von entweder modifizierten Histone oder Transkriptionsfaktoren zu identifizieren , ^4. Nach Immunpräzipitation von Histonen oder Transkriptionsfaktoren können gebundene DNA sein entweder amplifiziert durch Polymerasekettenreaktion (PCR) oder sequenziert. ChIP ist technisch herausfordernder Gelretardationsassays ⁵ überwinden. jedoch ChIP keine direkte bedeutet die Bindung eines Transkriptionsfaktors an DNA, ein Vorteil Gelretardation Assays. auf der anderen Seite, ChIP kombiniert, um die DNA-Sequenzierung hat eine neue genomweite Perspektive auf die Genregulation geöffnet.

ES - Zellen (ES - Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh., Zellaggregate) oder in der 2D - Kultur die frühen Schritte der Herzentwicklung ⁶ und bieten im Prinzip genügend Material für ChIP. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine menschliche Zellmodell von cardiogenesis obwohl ihr kardiogenen Potential hängt von ihrer epigenetischen Signatur ^7. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonale Mausgeweben für spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich zu untersuchen. Jedoch wird das Genom in einer zeit- und zelltypspezifisch ⁸ transkribiert. Epigenetische Regulation der Gen-Transkription hat in lokalisierten Regionen untersucht werden. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, gefolgt sequentielle ChIP durch PCR oder Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.

Protokoll

1. DNA-Protein-Quervernetzung

1. Fix in 15 - ml - Röhrchen geerntet-ES - Zellen (2 × 10 ⁶ Zellen für regelmäßige ChIP, 2 x 10 ⁵ Zellen für Mikrochip), Embryoidkörpern (EVG) erzeugt aus ES - Zellen und embryonalen Herzgewebe seziert von E9.5 Mausembryonen (atrioventricular Kanal, Ausflusstraktes und Ventrikel) mit 1% Formaldehyd in PBS für Zellen oder in Permeabilisierung PB2 Puffer für embryonalem Gewebe. Die Röhrchen auf Orbitalschüttler bei einer Geschwindigkeit von 60 rpm bei Raumtemperatur für genau 10 min.
2. Beenden Sie die Vernetzungsreaktion durch Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 mM Zugabe und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler bei einer Geschwindigkeit von 60 Umdrehungen pro Minute.

2. Zellyse und Chromatin Fragmentation

1. Zweimal waschen vernetzte resuspendierten Zellen in 10 ml PBS 1x oder embryonale in 1 ml PB2 resuspendiert Gewebe. Zentrifuge bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Die Überstände verwerfen.
2. Hinzufügen , Proteaseinhibitoren PB1 oder PB2 zu puffern (2 ug / ml Leupeptin, 1 & mgr; g / ml Aprotinin und 0,1 mM PMSF) (Tabelle 1). Zellpellet oder embryonalem Gewebe aus Schritt 2.1 in 1 ml Puffer PB1 bzw. PB2. Pipettieren auf und ab und die Zellen oder Gewebe resuspendieren. Verwenden, um eine 1 ml Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel Zellen oder Gewebe zu homogenisieren. Inkubieren bei 4 ° C (auf ein Rad) für 10 min.
3. Spin down bei 3000 × g für 5 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
4. Das Pellet in 300 ul jeweiligen SB - Puffer (Tabelle 1) in ein sauberes Röhrchen mit Protease - Inhibitoren ergänzt (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei) jede DNA - Abbau zu verhindern. Inkubieren für 15 bis 30 Minuten auf Eis.
5. Beschallen die Proben bei 4 ° C , um das Chromatin mit einem Beschallungsgerät gemäß Programmen in Tabelle 2 für jedes Material aufgeführt abzuscheren. Stellen Sie Beschallungsdauer in Abhängigkeit von der nächsten Anwendung ( dh PCR oder Sequenzierung). Geschoren DNA Größe sollte für die PCR und 300 bp für die Sequenzierung etwa 500 bp.
6. Zentrifuge beschallt für 10 min Zelllysat bei 6.000 × g bei 4 ° C, den Überstand (chromatin) in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen und das Pellet verworfen.
7. Man verdünnt das Chromatin in Lösung (Überstand Puffer B) für 10-mal mit Wasser und zu beurteilen, um die optische Dichte unter Verwendung von 1,5 & mgr; l in einem Nano-Spektralphotometer. Besorgen Sie sich die Konzentration von Proteinen in ug / ul der folgenden Formel berechnet: 1,55 x OD _{280 bis 0,76} x OD _260.

Puffer	Nutzung	Zusammensetzung				Materialien
EIN	Permeabilisierungs	PB1: 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCl; 0,5% NP40				Alle
		PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 60 mM KCl, 0,5% TRITON X-100				Embryonale Gewebe
B	Lysis / Beschallen	SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8				ESC
		SB2: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,9; 140 mM; 1 mM EDTA; 0,1% Desoxycholat; 0,1% SDS				EBs
		SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl; 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA; 1% TRITON-X100, 0 0,1% SDS, 0,5% Laurylsarcosin				Embryonale Gewebe
C	ChIP-Puffer	150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,5% NP40; 1% TRITON-X100.				Alle
D	DNA / Protein-Elution	D1: 1% SDS; 100mM NaHCO3 D2: 50 mM Tris pH 7,6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS
E	DNA-Bindungs ​​Perlen Vorbereitung	E: 20% PEG 8000; 2,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA

Tabelle 1. ChIP - Puffer.

Stoff	Ultraschall - Behandlung Programm
Embryonische Stammzellen	15 Zyklen von 30 sec und 30 sec OFF
Embryoidkörpern	30 Zyklen von 30 sec und 30 sec OFF
embryonalem Gewebe	21 Zyklen von 30 sec und 30 sec OFF

Tabelle 2. Ultraschall - Behandlung Programme.

3. Immunpräzipitation undWäscht

1. 3 x waschen Protein A-konjugierten Perlen mit Puffer C. Nehmen Sie 100 ul Kügelchen in ein sauberes 1,5 - ml - Röhrchen und 1 ml Puffer C (Tabelle 1). Das Rohr wird dann auf einen Magneten übertragen; mindestens 1 Minute warten und den Überstand aspirieren. Zweimal wiederholen den Waschschritt.
2. Inkubieren Antikörper , der gegen modifizierte Histone oder Transkriptionsfaktors (Konzentrationen in Tabelle 3) mit 20 & mgr; l gewaschener Protein - A - konjugierten Perlen und 1 ml Puffer C mit Protease - Inhibitoren in ein sauberes 1,5 - ml - Röhrchen ergänzt. Stellen Sie die Proben auf einem Rotator bei 40 Upm für mindestens 2 h bei 4 ° C.
3. Wash-Antikörper-Kügelchen-Komplexen 3-mal mit 1 ml Puffer C (manipulation in 3.1 beschrieben).
4. Bereiten Sie zwei Röhren, ein Gehalt von 150 ug Chromatin und Antikörper-Perlen-Komplexe und das andere Röhrchen mit 150 ug des Chromatins und 20 ul gewaschenen Perlen; 1 ml Puffer C, ergänzt mit Proteaseinhibitoren zu jedem Röhrchenund inkubiere die Proben auf einem rotierenden Rad bei 40 rpm über Nacht bei 4 ° C.
   HINWEIS: Die Konzentration des Chromatins mindestens 300 & mgr; g sein müssen, ein Transkriptionsfaktor oder für sequentielle ChIP immunpräzipitieren.

Standard	Konzentration (ng / ul)	Volumen (ul)	Die Gesamt - DNA - Konzentration (ng)
EIN	10.0	1	10.0
B	5.00	1	5.00
C	2,50	1	2,50
D	1,25	1	1,25
E	0,625	1	0,625
F	0,3125	1	00,3125
G	0,156	1	0,156
H	0.0	1	0.0

Tabelle 3. Standards Konzentrationen.

4. DNA-Elution, Querlenker-Reversal und Proteinase K Digestion

1. Stellen Sie die Proben in der magnetischen Rack. Gewinnen Sie den Überstand ungebundenen Antikörper Chromatin enthält.
   HINWEIS: Die Proben können rasch in diesem Schritt und gelagert bei -80 ° C in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Chromatin kann in anderen Immunpräzipitationstests mit anderen Antikörpern verwendet werden. Waschen jeder Probe 3 mal mit 1 ml Puffer C (manipulation zuvor beschrieben).
2. Eluieren des Antikörper-gebundenen Proteins durch Zugabe von 150 ul Puffer D1 oder D2 , falls sequentieller ChIP (Tabelle 1) gewaschen ChIP Materialien und Inkubation für 20 min die Proben bei 50 ° C in einem Heizblock durchgeführt werden muss.
3. Entfernen Sie Rohre ausder Heizblock und setzen Proben in der Magnetträger, erholen Sie den Überstand in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei) und die Perlen zu verwerfen.
4. Verwenden Überstand für eine sequentielle ChIP Zugabe von 1 bis 3 ug des zweiten Antikörpers in 2 Volumina Puffer C oder Rückwärtsvernetzungs durch Zugabe von 5 M NaCl auf eine Endkonzentration von 200 mM zu erhalten.
5. Vorbereiten eines Eingangsabtastwert von Chromatin in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei) die gleiche Menge an Chromatin wie die der IP-Probe (150 ug) in einem Endvolumen von 150 & mgr; l Wasser unter Berücksichtigung (RNase DNase freies Wasser). Hinzufügen 5M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 200 mM. Inkubieren Proben über Nacht bei 65 ° C.
6. Am nächsten Tag entfernen Proben aus dem Heizblock, fügen 250 mM EDTA zu einer Endkonzentration von 12,5 mM und Proteinase K zu erhalten, um eine Endkonzentration von 250 ug / ml in dem Chip-Material zu erhalten und für 2 Stunden in die auf 55 ° C verdauen Heizblock.

5. DNA-Isolierung der Basis von DNA-bindenden Perlen

1. Herstellung von Perlen
   1. Starten Sie die Perlen bei Raumtemperatur zu bringen, für mindestens 30 Minuten, Wirbel die Kügelchen sehr gründlich. Perlen sesshaft, so schnell arbeiten beim Pipettieren. 1 ml der Perlen in sauberes 1,5-ml-Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei).
   2. Auf Magnet, warten Sie 2 - 3 min für die Lösung zu klären, Überstand verwerfen. Entfernen von Magneten, 1 ml 0,5 M EDTA und mischen durch kurzes Vortexen.
   3. Wiederholen Sie Schritt 5.1.2 zweimal und Überstand verwerfen am Ende.
   4. Entfernen von Magneten, 1 ml Puffer E und resuspendieren langsam die Perlen. Übertragen Sie die ganze Mischung (Perlen in Puffer E) in 50 ml Puffer E. Platz auf einem Schüttler und lassen Sie es für 1 Stunde bei Raumtemperatur langsam mischen.
   5. Test-DNA-bindenden Perlen nach dem Reinigungsprotokoll unter Verwendung von 3 beschriebenen experimentellen Bedingungen: 50 ul Perlen / 50 ul DNA (1 Volumen / 1 Volumen) wurden 100 ul Perlen/ 50 & mgr; l DNA (2 Bände / 1 Volumen) und 125 & mgr; l Perlen / 50 ul DNA (2,5 Volumen / 1 Volumen). Lassen migrieren gereinigter DNA auf einem 1,5% Agarosegel der Größe der Bruchstücke (1A) zu überprüfen.
2. DNA Purification
   1. In 425 ul (2,5 Volumen) von DNA-bindenden magnetischen Kügelchen zu jeder DNA-Probe (etwa 170 ul). Resuspendieren langsam durch Pipettieren auf und ab (ca. 10 mal) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
   2. Setzen Sie auf Magnet für 5 Minuten, dann Überstand aspirieren und verwerfen (auf Magnet).
   3. In 600 ul frisch aus 80% Ethanol auf das Rohr auf dem Magneten, mindestens 1 Minute warten, absaugen Überstand und zu verwerfen und dann den vorherigen Schritt wiederholen noch einmal.
   4. Geben Sie eine schnelle Runde, für 5 Sekunden (Mikrofuge), legen Sie den Schlauch auf dem Magneten und entfernt die letzten Tropfen Ethanol. Trocknen lassen für 1 min bei RT
   5. Eluieren der DNA durch Zugabe von 20 & mgr; l DNase RNase freies Wasser. Entfernen von Magnet und die Probe vortexen.
   6. Inkubieren für 3 Minuten bei Raumtemperatur und dann legen Proben auf Magneten. Absaugen eluierte DNA in ein neues Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei).
   7. Führen Sie die DNA aus dem Eingangsfraktion auf einem 1,5% Agarosegel der Größe von DNA - Fragmenten (1B) zu überprüfen.

6. DNA-Quantifizierung mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektionsinstrument

1. Serienmäßig in der DNA - Wasser 1 ug (1 kb Leiter) verdünnen insgesamt 7 Verdünnungen zu geben , sowie eine nicht-DNA - Punkt (Verdünnungen in der Tabelle gesammelt 3).
2. Bereiten Sie eine Lösung von PCR-Green I-Farbstoff, ausreichend für alle Proben (gereinigte DNA und Standardverdünnungen AH): verdünnen Sie die Grüne Farbstoff in 1x TE-Puffer 10.000fach.
3. 1 ul jeder DNA-Proben (gereinigte DNA und Standardverdünnungen AH) bis 10 & mgr; l 1x grünen Farbstoff-Mix in Kapillaren Küvetten in einem Fluorimeter bei 488 nm Wellenlänge gelesen werden. Für die nicht-DNA-Test, verwenden Sie 1 ul des 1x TE-Puffer.
4. Baueneine Kalibrierungskurve eine Grafik-Software und die relativen Konzentrationen auf den Bereich von DNA-Proben in ng / & mgr; l bestimmen. Die DNA wird dann bereit für PCR oder Sequenzierung Bibliotheken zu machen.

7. PCR

1. Die Auswahl der Primer
   1. Design-Primer von Interesse, die genomischen Regionen von Interesse abzufragen. Design-Primer Enhancer-Regionen von Genen unter Verwendung des UCSC Genom-Browser zu verstärken. Enhancers werden voraussichtlich auch H3K4me1 oder p300 ChIP-seq ⁹ Daten in GEO Datensatz.
2. PCR
   1. Run-PCR-Reaktionen für 45 Zyklen (8 sec 95 ° C, 8 sec 60 ° C, 8 sec 72 ° C) unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Thermocycler in 25 ul grünen Farbstoff-Mix, 2 ng DNA und 0,5 & mgr; l Primer-Gemisch (20 uM Stammlösung) ^10.
3. Die Analyse der Anreicherung
   1. Berechnen Absolute Anreicherungs vorausgesetzt, wurden ¹¹ höchstens 1% der Nukleosomen immunpräzipitiert.
   2. consider die genomische als angereichert, wenn 10 ng IP Proben eine größere Anreicherung zeigen, wenn auf 0,1 ng Input-DNA verglichen.
   3. Express-Ergebnisse als fache Erhöhung der Anreicherung über eine nicht angereicherten Bereich nach der Normalisierung mit dem Eingang und Einstellung mit einem unspezifischen Kontrollprobe.
   4. Betrachten wir die Eingangs DNA von 100 (Verdünnungsfaktor oder DF) verdünnt werden.
   5. Normalisieren der Eingang mit der folgenden Gleichung 2 ^-ΔCt x 100%, wobei -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input x DF].
   6. Passen Sie Steuerung mit Hilfe der folgenden Gleichung (ACt [IP] -ΔCt [NS]), wobei NS die unspezifische Probe (keine Antikörper IP oder IgG IP).
   7. Berechne den fache Anreicherung der Probe als 2 ^-ΔΔCt. Eine Datei mit allen Schritten von Berechnungen mit den Formeln in denen nur jede PCR Probe eingegeben werden kann, wird die Analyse der Ergebnisse zu erleichtern.

Ergebnisse

1A stellt zunächst die Herstellung von DNA-bindenden Perlen und Qualitätskontrolle unter Verwendung von DNA in verschiedenen Größen (1 kb Leiter). 0ne, 2 und 2,5 Volumina (1 bis 3) der Kügelchen wurde zu einem Volumen der Probe hinzugefügt hohem und niedrigem Molekulargröße DNA-Fragmente zu reinigen.

Figuren 1 B, C, D sind typische Beispiele für DNA - Gelen von Voll beschallter DNA ex...

Diskussion

Epigenetik ist ein wichtiger Bereich der Forschung in der Entwicklungsbiologie geworden. Wie ein genetisches Programm in embryonalen Zellen aktiviert wird, um die Zellen zu erwerben eine bestimmte Identität innerhalb einer embryonalen Linie zu ermöglichen, hat eine Schlüsselfrage für Entwicklungsbiologen für lange Zeit gewesen.

ChIP wurde in den letzten Jahren und kombiniert, um die DNA-Sequenzierung folgende Verbesserung der Auflösung der Sequenzierung im Großen und Ganzen verwendet....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F8775	Cell Fixation
Glycine	Sigma	G8898	Cross-link stop
Aprotinin	Fluka	10820	Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate	Sigma	L2882	Proteases inhibitor
PMSF	Sigma	P7626	Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads	Life technologies	10001D	Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads	Thermo Scientific	15002-01	DNA purification
Proteinase K	Life technologies	25530-015	Protein digestion
DNA BR standard	Life technologies	Q32850	Calibration range
Syber green	Molecular Probes	S-11484	DNA quantification
TE buffer	Invitrogen	P7589	DNA quantification
PBX 1x	Life technologies	14190-094	Washing
DNase RNase free water	Life technologies	10977-035	Dilution
Axygen tube	Axygen	MCT-175-C	ChIP purifiction
Antibody	Company	Reference	ChIP concentration
H3K27ac	Abcam	ab4729	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1	Diagenode	C15410194 (pAb-194-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3	Diagenode	C15410058 (pAb-058-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2	Diagenode	C15410060 (pAb-060-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3	Diagenode	C15410030 (pAb-030-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3	Diagenode	C15410069 (pAb-069-050)	3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues