מבחן עייפות הליכון: A Assay פשוט, תפוקה גבוהה של התנהגות העייפות דמוית עבור העכבר

Summary

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

Abstract

עייפות היא סימפטום בולט הרבה מחלות והפרעות ומפחיתה איכות החיים של אנשים רבים. החוסר בפתוגנזה ברורה וכישלון ההתערבויות נוכחיות לטיפול עייפות כראוי בכל החולים משאיר צורך אפשרויות טיפול חדשות. למרות הצורך הטיפולי ואת החשיבות של מחקר פרה-קליני בעזרה לזהות טיפולים חדשניים מבטיחים, כמה מבחני פרה-קליניים של עייפות זמינים. יתר על כן, assay פרה-הקליני הנפוץ ביותר המשמש להערכת התנהגות עייפות דמוית, ריצת גלגל מרצון, אינו מתאים לשימוש עם זנים מסוימים של עכברים, לא יכול להיות רגיש תרופות להפחתת עייפות, ויש לו תפוקה נמוכה יחסית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר רומן, assay פרה-הקליני שאינו מהרצון של התנהגות כמו עייפות, מבחן עייפות הליכון, ומספק עדות יעילותה באיתור התנהגות כמו-עייפה בעכברים שטופלו עם תרופה כימותרפית ידועות כגורם עייפות בבני אדם ועייפות התנהגות-כמו ב אנימהls. assay זה עשוי להיות חלופה מועילה ריצה גלגל, כהתנהגות עייפות דמוית והתערבויות פוטנציאל ניתן להעריכם מספר גדול יותר של עכברים על מסגרת זמן קצרה יותר, ובכך לאפשר גילוי מהיר של אפשרויות טיפוליות חדשות.

Introduction

עייפות משפיעה על מגוון רחב של אנשים, יכולה להפחית את איכות החיים באופן משמעותי, ולעתים קרובות יש בפתוגנזה ברורה או ידועה. הסרטן הקשורות עייף (CRF), למשל, חווה על ידי רוב חולי הסרטן העוברים טיפולים יכולים להתמיד זמן רב לאחר טיפול בסרטן הושלם ובהעדר לסרטן לגילוי ^1. יתר על כן, עייפות היא גם סימפטום בולט מחלות והפרעות רבות אחרות, כולל תסמונת עייפות כרונית, דיכאון, סוכרת, ופיברומיאלגיה. למרבה המזל, ישנם שאינם תרופתי התערבויות המסוגלים לעזור כמה אנשים חווים עייפות (למשל, פעילות גופנית יכולה להפחית CRF עבור חלק מהחולים בסרטן השד ^2,3), אבל אנשים רבים עדיין חסרים טיפול יעיל. יתר על כן, טיפולים תרופתיים קיימים עבור CRF לא נמצאו להיות רחב, אם בכלל, ^4-7 יעיל.

למרות הצורך הטיפולי וחוסר druאפשרויות הטיפול גרם, מבחני הפרה-קליניים של עייפות כדי לסייע בגילוי ופיתוח של טיפולים עייפות הרומן חסרים, במיוחד במודלים של בעלי חיים. אחת מבחני פרה-קליניים בלבד של עייפות עבור מחקרים במכרסמים הוא פעילות ריצה גלגל מרצון (VWRA) ^9-15, שבו עכברים או מכרסמים אחרים מקבלים גישה חופשית גלגל ריצה ופעילות ולהפעלה היומית שלהם מתועד. במחקרים רבים, VWRA הוא המדד היחיד של התנהגות עייפות דמוית, עם התנהגות עייפות דמוית מוגדר (בכל VWRA או בפרוטוקול הנוכחי) כמו ירידה בפעילות הגופנית נמדדת בקבוצת הניסוי. למרות VWRA יכול לספק מידה אורכת שימושית של התנהגות העייפות דמוית, היא assay נמוכה יחסית תפוקה, ריצה משתנית באופן משמעותי בין זנים הטהורים עכבר ^16, וזה דורש נושאים ישוכנו בנפרד, אשר עשוי לגרום לשינויים בביצועי התנהגות ולבדוק ^17-19. מבחני אחרים, כגון ניטור התנהגות כלוב הביתהניתוח, יכול גם לספק אוסף נתונים רציף וכמה מערכות עשויות לאפשר נושאים שהוגדרו שוכנו בזוגות ^20. מבחנים אלו יש שירות, אך הוא עשוי להיות פחות רגיש כאמצעי לזיהוי התנהגות כמו-עייפות, כמו ריצת גלגל, הם גם תפוקה נמוכה.

בניגוד VWRA, בדיקות הליכון העכבר אל תסמוך פעילות התנדבותית ויכול להסתיים בתוך פרק זמן קצר, המאפשר קצב העברת נתונים גבוה יותר. בהשוואה VWRA, בדיקות אלה להעסיק מניעים חיצוניים. באופן ספציפי, יש בדרך כלל רשת מתכת מחושמלת ממוקמת לחלק האחורי של החגורה נעה לספק עכברים באמצעות שוק חשמלי הם צריכים להפסיק לרוץ. בנוסף לרשת ההלם הזה, עשויה להיות מוטיבציה עכברים לרוץ על ההליכון באמצעות כמה שיטות אחרות, כולל נגחו, דירבנו, או לגעת בהם ביד, מברשת, או כלי אחר ולכוון שאיפות קצרות אוויר לכיוונן. במקום עייפות, בדיקות הליכון עכבר לעתים קרובות משמשות למדידה אירובית ו / או anaerתרגיל obic קיבולת ^21-25. עכברים הם מוטיבציה לרוץ עד שהם אינם מסוגלים או אינם רוצים להמשיך ריצה על הליכון כאמצעי בריחה חשיפה לזרם חשמלי נוסף. בדיקה ואז מסתיימת כאשר עכברים מקיימים את המבחן עבור תשישות. ב הפרוטוקולים הללו, על מנת להבטיח כי עכברים להגיע תשישות פיזיולוגית אמיתית, קריטריון התשישות מוגדר בדרך כלל כמו לבלות חמש שניות רצופות הנחת על גבי רשת ההלם ונכשל להמשיך לרוץ אל מול גירויים מרתיעים חזרו. לפיכך, התנהגות עייפות דמוית עשויה להיות רעולה פנים במבחני הליכון טיפוסיים בשל האופי המרתיע החזק של המוטיבציה החיצונית ו קריטריון לסיום הבדיקה. מעניין, ובניגוד מחקרים רבים אחרים באמצעות הליכונים מכרסמים, שפורסם לאחרונה מתאר גרסה אחרת של בדיקת עייפות הליכון, אשר שמשה כחלק בחינה של שפעות לחץ חברתי בעכברים ^26. למרות השיטה של ​​קבוצה זו שונה במידה ניכרת מן המ"קפרוטוקול rrent (כלומר, הם מועסקים הליכון נתיב יחיד ונזקקו 10 שניות של הלם חשמלי כקריטריון לסיום הבדיקה שלהם), במחקרם מדגיש את השירות והתעניינות מפתחת בדיקת עייפות מהירה, פשוטה באמצעות הליכון העכבר.

עייפות היא עשויה להתגלות על ידי אמצעי אחר מלבד ריצת הגה שינויים בהתנהגויות שיגרתיות. CRF עושה למטופלים להרגיש מותשים על ידי כמות פחותה של עייפות שרירים, כפי שנקבעו על ידי ניתוח electromyographic, בהשוואה לאנשים שלא CRF ^27. בנוסף, מוטיבציה מופחתת שצוינה ונמדדת על ידי כמה סולמות מדידת הליאות ^28,29. לפיכך, assay פרה-שימושי של התנהגות עייפות דמוית צריך להבחין בין עכברים בריאים עייפו על בסיס מדד למעט יכולת פיזיולוגית ולא צריכות ירידות מעורפלות במוטיבציה. כדי להשיג מטרה זו, תוך הימנעות מגבלות של VWRA מבחנים אחרים, ווה השיטה הנוכחישעות שפותחו על ידי התאמת בדיקת הליכון עכבר. שיטה זו משתמשת רשת הלם כמו המניע החיצוני הבלעדי לייצר עכברים לרוץ על ההליכון. עכברים ללמוד במהירות כי הרשת מספקת גירוי מרתיע תעבור מייד ממנו כאשר הניחו על ההליכון ולשמור מרחק ממנו בעת ההפעלה.

כאשר עכברים עייפים, הם מבלים יותר ויותר זמן לכיוון חלק האחורי של ההליכון במקום שמירה על מהירות לקראת הסוף הקדמי. לכן, הקריטריון להשלמת בדיקה בפרוטוקול זה הוא מבלה חמש שניות רציפות באזור העייפות המיועד (כלומר, חלק האחורי של ההליכון, נע בין כ אורך גוף אחד מן רשת ההלם, וכולל, לרשת ההלם). זה מנצל את טבע המרתיעה של הרשת ללא צורך עכברים לקבל הרבה או כל זעזועים בפועל לאחר אימון. בכך שהוא מאפשר עכברים כדי להשלים בדיקות השימוש בקריטריון הנוכחי ולא תשישות (כמוגדר לעיל),שיטה זו מספקת אמצעי באמצעות הליכון למדוד התנהגות עייפות דמוית ולא שלה מקסימלי (או כמעט מקסימאלי) היכולת הפיזיולוגית. לכן, שיטה זו יכולה לספק assay פשוטה, תפוקה גבוהה של התנהגות עייפה דמוית בעכברים יכולה לשמש גם כאמצעי עצמאי או משלים מבחני אחרים של התנהגות עייפות דמוית.

Protocol

הליך זה אושר על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול כליות טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

1. הכנה

1. כדי לאפשר זיהוי מהיר של כל עכבר לפני הבדיקה, לקעקע את הזנבות של כל העכברים לעבור הכשרה ונבדקו עם סימנים מזהים.
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי. סמן קבוע או שיטות אחרות של זיהוי יכול לשמש כחלופת קעקוע.
2. לפני אימון ועכברים בדיקה, להבטיח כי ההליכון היא על משטח שטוח ומוגדרת ההליכון לזווית הרצויה של היצר (זווית המומלצת של היצר: 10 °, כדי להישמר עקבי לאורך הדרכה ובחינות) ולקבוע את תדירות התחשמלות ועוצמת כראוי (מומלץ: 2 הרץ, 1.22 מילי-אמפר).
   הערה: ההתחשמלות המשמשת צריכה לייצר לכל היותר תחושת עקצוץ קלה כאשר נגעו באצבע ungloved וצריך להיות מועבר fash pulsatileיון (עם כל זעזוע שנמשך 200 msec).
3. הנח גיליון נייר נקי קצבים או כרית ספיגה תחת ההליכון לאסוף boli צואה ושתן במהלך הדרכה ובחינות.
4. מניחים דף נייר או כרית ספיגה מעל שליש דיור הליכון (כלומר, מכסה פלסטיק שקוף המכסה את נתיבי הליכון) הקליעה מן הרשת הלם.
   הערה: שלב זה הוא אופציונאלי, אך ייצור חלל כהה עשוי לספק עידוד נוסף כדי למנוע את החלק התחתון של ההליכון.
5. במידה ואתם מתכננים להשתמש במברשת תיל כדי לספק מוטיבציה נוספת במהלך אימון, להבטיח כי אחד זמין לפני תחילת אימונים.
6. ודא כי כל תרופה או שיטת גרימה ו / או הקלת עייפות זמינה ויכולה להיות מוכנה או שבוצעה במהלך שלב 2.14.

2. עכברי הדרכה השתמשו הליכון

הערה: אימון הוא הכרחי על מנת להבטיח כי עכבריםמכירים את ההליכון משימה והוא יכול לבצע כראוי כאשר נבדק. אם רוב עכברי הכשרה מקבלים זעזועים תכופים או אחרת תפקוד לקוי במהלך כל אימון, הדרכות נוספות צריכות להתבצע. ביום הראשון, רוב העכברים יהיו בהלם כמה פעמים. ביום של אימון השני, עכברים צריכים להיות נדיר ליצור קשר עם הרשת. אם עכבר מציג ביצועים מאימון דלים עקבי, יש להסירו מן המחקר. לקבלת עכברות C57BL / 6NCr, זהו מאורע נדיר (פחות מ -1% הוסרו ממחקרים בשל ביצועי אימון עניים), אך יש לציין כי זנים אחרים עשויים לפעול באופן שונה במהלך אימון.

1. עם הליכון הנחה (ומהירות מוגדרת 0 מ '/ דקה), בנפרד להרים את העכברים על ידי עכברי הזנב ומקום לתוך נתיבים נפרדים של הליכון עכבר. מיד להפעיל את הרשת המקבילה לאחר הצבת כל עכבר על ההליכון. ודא כי עכברים ממוקמים ישירות on חגורת הליכון.
   הערה: משך הזמן ומרחק כל עכבר המוחזק בזנבו צריכה להיות ממוזער על ידי צבת את הכלוב ליד ההליכון לפני העברת עכברים הליכון ו / או מתן אפשרות עכברים לעמוד על פלטפורמה מוצקה (למשל, מכסים כלוב רשת ) עד שהם ליד ההליכון ואת הנסיין הוא מוכן לתת להם מקום ההליכון.
2. אפשר עכברים לחקור את ההליכון בחופשיות במשך 1-3 דקות או עד כל עכבר חקר מנתיבה ו / או קבל לפחות הלם אחד מן הרשת.
3. הפעל את ההליכון ולאט לאט להגביר את המהירות עד שהוא מתחיל לנוע (כ -1.5 כדי 3.0 מ '/ דק'). ניטור כל העכברים על מנת להבטיח כי הם מתחילים הליכה. אם עכבר לא להתחיל הליכה או הולך לכיוון רשת ההלם, להיות מוכן להתערב על ידי קשה על העכבר במברשת מתכת או דגדוגי זנב.
4. לאט לאט להגביר את מהירות ההליכון עד 8 מ '/ דקה. התחל טיימר ולהמשיך התנהגות ניטור.
5. להגדיל את מהירות הליכון9 מ '/ דק' ב 5 דקות, 10 מ '/ דק' ב 7 דקות, ולהפסיק הליכון 10 דקות.
6. אפשר העכברים כדי לחקור את ההליכון בקצרה, ולאחר מכן להסיר ולהחזיר כל לכלוב שלה.
7. נקו את ההליכון ורשת עם אלכוהול ולהחליף את הנייר או כרית ספיגה מתחת הליכון.
8. כדי להכשיר עכברים נוספים, חזור על שלבים 2.1 דרך 2.7.
   הערה: אפשר לאלכוהול להתייבש לפני הצבת עכברים חדשים על ההליכון.
9. ביום האימון השני, לחזור על שלב 2.1. הפעל את ההליכון ולהגדיל את המהירות ל 10 מ '/ דקה. התחל טיימר.
   הערה: מהירות הליכון ניתן להגדיל במהירות רבה יותר מאשר ביום הראשון של אימונים.
10. גדל הליכון מהיר עד 11 מ '/ דק' ב 5 דקות, 12 מ '/ דק' ב 10 דק ', ולהפסיק הליכון 15 דקות.
11. הסר עכברים ולהחזיר אותם בכלובים שלהם.
12. נקו את ההליכון ורשת עם אלכוהול ולהחליף את הנייר או כרית ספיגה מתחת הליכון. כדי להכשיר עכברים נוספים, חזור על שלבים 2.9 דרך 2.12.
13. בצע ימים נוספים (3 ימים) של הכשרה באותו אופן כמו ביום השני.
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי, אבל מומלץ מאוד אם רוב או כל העכברים (מאותו מין ומתח) שאומן קושי התצוגה עם המשימה. עכברים יכולים לבצע גם שלב 3 בדרך כלל כשהם הוכשרו במשך 3 ימים (כלומר, עם יום אחד נוסף של אימונים), אם כי ימים נוספים או פחות של אימון עשויים להיות מתאימים בהתאם לביצועים שלהם במהלך יום האימון השני ומשך שלב 2.14.
14. אפשר לפחות יום שלם אחד לעבור בו העכברים אין חשיפה ההליכון לפני שתמשיך לשלב 3.
    הערה: כל תרופה (ים) המשמשת כדי לעודד ו / או להקל על עייפות צריכה להינתן במהלך שלב זה.
    הערה: פרק זמן זה יכול להיות מגוון באורך המשמש כדי לעודד התערבות עייפה ו / או בדיקה כדי לצמצם או למנוע עייפות. אם בודקים עכברים יותר מ -7 ימים לאחר סיום הכשרה, מחקר פיילוט מומלץלוודא כי העכברים המשמשים יבצעו במהלך בדיקה.

3. הליכון עייפים מבחן

הערה: בבדיקה זו, עייפות דמוית התנהגות מוגדרת לבלות 5 שניות רצופות "האזור עייפות". אזור העייפות מוגדר באזור המקיף את החלק של החגורה הליכון בתוך כ 1 אורך גוף של רשת ההלם וכן את הרשת, עוצמה. לפני בדיקה, להבטיח שנקודת המגדירה אזור זה ברור הנסיין, כגון על-ידי החלת סימן לחלק העליון או בצד של נתיבים הליכון.

1. הגדרת מהירות ההליכון עד 12 מ '/ דקה. אל תתחיל ההליכון. ודא בהלם כי רשתות כבויות.
2. בנפרד למקם עכברים לתוך נתיבים נפרדים של ההליכון. להפעיל את הרשת התואמת מייד לאחר צבת כל עכבר על ההליכון.
3. במקביל להתחיל הליכון סטופר.
   הערה: אין להתערב במהלך הבדיקה למעט להסיר עכבריםשעומד בקריטריון להסרה (ראה שלב 3.5).
4. להגדיל את מהירות ההליכון כמצוין בטבלה 1. אנא קראו בעיון את כל העכברים לאורך כל הבדיקה.
   הערה: הליכון מהירויות המפורטים בטבלה 1 נבחרו על בסיס תצפיות מעכברים C57BL / 6NCr הנקבה הבוגרת. מירויות הליכון גבוהות יותר עשויות להיות מתאימות יותר (למשל, עכברי CD-1 outbred) או יותר עכברי אתלטים.
5. אם עכבר נשאר באזור העייף במשך 5 שניות רצופות, ומייד להסיר את העכבר הליכון ולהקליט את המשך ולהרחיק אותו הרץ.
6. כאשר אין עכברים להישאר על ההליכון, לעצור את ההליכון. נקו את ההליכון ורשת עם אלכוהול ולהחליף את הנייר או כרית ספיגה מתחת הליכון.
7. כדי לבדוק עכברים נוספים, חזור על שלבים 3.1 דרך 3.6.
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי.

תוצאות

פרוטוקול זה מאפשר התנהגות כמו-עייפה להימדד עכברים באמצעות הליכון. הנתונים המוצגים בסעיף זה הושג על ידי הדרכה ובחינות 3 קבוצות נפרדות של עכברים באמצעות הפרוטוקול הנוכחי (לא כולל איור 1A ו 1C). כדי לגרום עייפות, 5-fluorouracil (5-FU), תרופה כימות...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש הליכון עכבר כדי למדוד התנהגות עייפות דמוית. לשיטה זו מספר יתרונות על פני VWRA, assay פרה-קליני נורמות התנהגות מקובלות עייפות דמוית. VWRA דורש שעכברים לבחור אינטראקציה עם מנגנון הבדיקה. כתוצאה מכך, כמה זנים טהורים של עכברים לעתים נדירות אינ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Exer 3/6 Animal Treadmill	Columbus Instruments	1050-RM Exer-3/6
Stopwatch	Daigger	EF24490M
Wire brush	Fisher Scientific	03-572-5
Compressed air	Dust-Off	FALDSXLPW
Absorbent pads	Daigger	EF2175CX
Butcher paper	Newell Paper Company	4620510
Alcohol (70%)	Fisher Scientific	BP82011