Die Tretmühle Ermüdungstest: Eine einfache, Hochdurchsatz-Assay von Fatigue-ähnliches Verhalten für die Maus

Zusammenfassung

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

Zusammenfassung

Müdigkeit ist ein prominentes Symptom für viele Krankheiten und Störungen und reduziert die Lebensqualität für viele Menschen. Das Fehlen klarer Pathogenese und ein Scheitern der laufenden Interventionen angemessen zu Ermüdung bei allen Patienten bleibt ein Bedarf an neuen Behandlungsmöglichkeiten zu behandeln. Trotz der therapeutischen Notwendigkeit und Bedeutung der präklinischen Forschung in viel versprechende neue Therapien zu helfen identifizieren, einige präklinische Tests von Müdigkeit zur Verfügung. Darüber hinaus ist die häufigste präklinischen Assay verwendet Müdigkeit ähnliches Verhalten, freiwillige Radfahr beurteilen zu können, nicht geeignet für den Einsatz mit einigen Stämmen von Mäusen, nicht empfindlich auf Drogen sein kann, die Müdigkeit zu verringern, und hat relativ geringen Durchsatz. Das aktuelle Protokoll beschreibt eine neue, nicht-freiwilligen präklinischen Test von Müdigkeit ähnliches Verhalten, dem Laufband Ermüdungstest, und liefert den Beweis für ihre Wirksamkeit Müdigkeit artiges Verhalten bei Mäusen mit einem Chemotherapeutikum behandelt bekannt zu verursachen Ermüdung bei Menschen und Müdigkeit bei der Aufdeckung -ähnlichen Verhalten in animals. Dieser Test kann eine vorteilhafte Alternative zu Radfahr sein, wie Ermüdungsartiges Verhalten und mögliche Eingriffe können in einer größeren Zahl von Mäusen über einen kürzeren Zeitraum bewertet werden, wodurch schnellere Entdeckung neuer therapeutischer Optionen ermöglicht.

Einleitung

Müdigkeit wirkt sich auf eine Vielzahl von Menschen, kann deutlich die Lebensqualität reduzieren, und häufig hat eine unklare oder unbekannter Pathogenese. Krebs-related fatigue (CRF), zum Beispiel, wird von der Mehrheit der Krebspatienten erfahren Behandlung unterziehen und kann lange bleiben auch nach der Krebsbehandlung und in Abwesenheit von nachweisbaren Krebs ¹ abgeschlossen ist. Darüber hinaus ist Müdigkeit auch ein prominentes Symptom in zahlreichen anderen Krankheiten und Störungen, einschließlich chronischem Müdigkeitssyndrom, Depressionen, Diabetes und Fibromyalgie. Glücklicherweise gibt es nicht-pharmakologische Interventionen , die einige Menschen zu helfen , erleben Müdigkeit fähig sind (zB Übung kann CRF reduzieren für einige Brustkrebspatientinnen ^2,3), aber viele Menschen fehlt immer noch eine wirksame Behandlung. Darüber hinaus wurden bestehende medikamentöse Behandlungen für CRF nicht gefunden worden , im Großen und Ganzen zu sein, wenn überhaupt, wirksam ^4-7.

Trotz der therapeutischen Notwendigkeit und der Mangel an Drug Behandlungsmöglichkeiten, präklinische Tests von Müdigkeit in der Entdeckung und Entwicklung von neuartigen Behandlungen Müdigkeit zu unterstützen fehlen, vor allem in Tiermodellen. Einer der wenigen präklinischen Tests von Müdigkeit für Studien an Nagetieren ist freiwillig Radfahr Aktivität (VWRA) ^9-15, in denen Mäuse und andere Nagetiere sind den freien Zugang zu einem Laufrad und ihre tägliche Laufaktivität gegeben wird aufgezeichnet. In vielen Studien ist VWRA das einzige Maß für ermüdungsähnliche Verhalten, mit Müdigkeit ähnliches Verhalten definiert (entweder VWRA oder dem aktuellen Protokoll) als eine Abnahme der gemessenen körperlichen Aktivität in der experimentellen Gruppe. Obwohl VWRA eine nützliche Längs Maß für Ermüdungsähnliches Verhalten bereitstellen kann, ist es eine relativ geringe Durchsatzassay ausgeführt variiert beträchtlich zwischen den Inzucht - Mausstämmen ^16, und es erfordert Fächer einzeln untergebracht werden, was Veränderungen im Verhalten und Testleistung verursachen kann ^17-19. Andere Tests, wie zum Beispiel Heimkäfig Verhaltensüberwachung undAnalyse kann auch eine kontinuierliche Datenerfassung liefern und einige Systeme erlauben kann für Themen in Paaren ²⁰ untergebracht werden. Diese Assays sind nützlich, kann aber weniger empfindlich als Mittel zur Erfassung Ermüdungsartiges Verhalten und wie Radfahr sind auch Low-Durchsatz.

Im Gegensatz zu VWRA, Maus Tretmühle Tests stützen sich nicht auf freiwillige Aktivität und kann in kurzer Zeit abgeschlossen werden, für einen höheren Durchsatz ermöglicht. Im Vergleich zu VWRA verwenden diese Tests externe Motivatoren. Insbesondere gibt es normalerweise eine elektrifizierte Metallgitter an der Rückseite des sich bewegenden Bandes angeordnet Mäuse mit einem elektrischen Schock zu liefern sollten sie laufen einzustellen. Zusätzlich zu diesem Schock Gitter, Mäuse können auf dem Laufband über mehrere andere Methoden ausgeführt werden motiviert, einschließlich Stoßen, stossen, oder sie mit einer Hand, einer Bürste oder einem anderen Werkzeug zu berühren und kurze Luftstöße auf sie zu lenken. Statt Müdigkeit, sind Tests Maus Tretmühle häufig verwendet, um zu messen aeroben und / oder anaerobic Trainingskapazität ^21-25. Die Mäuse sind motiviert, zu laufen, bis sie nicht in der Lage oder nicht willens sind, auf dem Laufband als Mittel, um weiterzulaufen weiterer Elektroschocks zu entkommen. Testing dann endet, wenn Mäuse, die das Kriterium für die Erschöpfung erfüllen. In diesen Protokollen, um sicherzustellen, dass Mäuse wahre physiologische Erschöpfung zu erreichen, ist das Kriterium für die Erschöpfung oft als er fünf Sekunden lang mit an der Spitze des Stoßnetz und in Ermangelung definiert angesichts der wiederholten aversiven Reize weiterlaufen. Somit kann Ermüdungsähnliches Verhalten in typischen Laufband Tests maskierenden aufgrund der starken aversive Natur der externen Motivation und Kriterium für den Test zu beenden. Interessanterweise und im Gegensatz zu vielen anderen Studien mit Nagetieren Tretmühlen, eine aktuelle Publikation beschreibt eine andere Version einer Tretmühle Ermüdungstest, die im Rahmen einer Untersuchung der Auswirkungen von sozialem Stress bei Mäusen ²⁶ verwendet wurde. Obwohl die von dieser Gruppe verwendete Methode unterschied sich deutlich von der current Protokoll (dh sie verwendet , um eine einspurige Laufband und benötigt 10 Sekunden eines elektrischen Schlags als Kriterium ihre Prüfung für die Beendigung), ihre Studie unterstreicht die Nützlichkeit und das Interesse an einer schnellen, einfachen Ermüdungstest der Entwicklung der Maus Laufband.

Müdigkeit ist wahrscheinlich durch nachweisbar zu sein, andere als Radfahr und Veränderungen in der Routineverhalten. CRF macht Patienten mit einer geringeren Menge an Muskelermüdung erschöpft fühlen, wie durch Elektromyographie - Analyse bestimmt, als Menschen ohne CRF ^27. Zusätzlich reduziert die Motivation in bemerkt worden , und wird von mehreren Skalen zur Messung menschlicher Ermüdungs ^​​28,29 gemessen. Somit sollte ein nützliches preclinical Assay Ermüdungsähnliches Verhalten zwischen gesunden und ermüdeten Mäuse auf der Grundlage einer andere Maßnahme als physiologische Fähigkeit unterscheiden, und sollte nicht verdunkeln Abnahmen der Motivation. Um dieses Ziel zu erreichen, während Einschränkungen von VWRA und anderen Tests zu vermeiden, die aktuellen Verfahren was durch die Anpassung der Maus Tretmühletest entwickelt. Dieses Verfahren verwendet einen Schockgitter als einzige externe motivator Mäuse auf dem Laufband zu machen. Mäuse lernen schnell, dass das Gitter einen aversiven Reiz bietet und wird von ihm sofort wegziehen, wenn sie auf dem Laufband gelegt und in einiger Entfernung von ihm halten beim Laufen.

Wenn Mäuse Müdigkeit, verbringen sie zunehmend mehr Zeit in Richtung der Rückseite des Laufband statt Geschwindigkeit zu dem vorderen Ende aufrecht zu erhalten. Daher ist das Kriterium für die Beendigung des Tests in diesem Protokoll zu verbringen fünf Sekunden lang in der vorgesehenen Ermüdungszone (dh der Rückseite des Laufband, im Bereich von etwa einer Körperlänge von dem Schock Gitter zu und einschließlich dem Schock Gitter). Dies nutzt die aversiven Natur des Gitters ohne Mäuse erfordern viele oder keine tatsächliche Schocks nach dem Training zu erhalten. Indem Mäuse Tests unter Verwendung des aktuellen Kriterium abzuschließen anstatt Erschöpfung (wie oben definiert),Dieses Verfahren stellt ein Mittel, um das Laufband mit ermüdungs ​​Verhalten eher als seine maximale (oder nahezu maximalen) physiologische Fähigkeit zu messen. Somit kann dieses Verfahren stellen eine einfache, Hochdurchsatz-Assay von Ermüdungsartiges Verhalten bei Mäusen und kann entweder als eigenständige oder ergänzende Maßnahme zu anderen Assays Ermüdungsähnliches Verhalten dienen.

Protokoll

Dieses Verfahren wurde durch das National Institute of Diabetes und Magen-Darm-und Nierenerkrankungen Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung

1. Damit für die schnelle Identifizierung von jeder Maus vor der Prüfung, Tätowierung die Schwänze aller Mäuse, die mit Kennzeichnungen trainiert und getestet werden.
   Hinweis: Dieser Schritt ist optional. Permanent Marker oder andere Verfahren zur Identifizierung kann als Alternative zum Tätowieren verwendet werden.
2. Vor der Ausbildung und Prüfung Mäuse, stellen Sie sicher, dass das Gerät nur auf eine ebene Fläche ist und auf den gewünschten Neigungswinkel zu dem Laufband gesetzt: und stellen Sie den Stromschlag-Frequenz (empfohlener Neigungswinkel 10 °, zur gesamten Ausbildung und Prüfung konsistent gehalten werden) und Intensität in geeigneter Weise (empfohlen: 2 Hz, 1,22 mA).
   HINWEIS: Der Stromschlag verwendet wird, sollte nicht mehr als ein mildes Kribbeln erzeugen, wenn sie durch einen ungloved Finger berührt und sollte in einem pulsatilen fash geliefert werdenIon (mit jedem Schlag dauerhafte 200 ms).
3. Legen Sie ein sauberes Blatt Metzgerei Papier oder ein absorbierendes Kissen unter dem Laufband fäkale Boli und Urin während des Trainings und Tests zu sammeln.
4. Legen Sie ein Blatt Papier oder ein absorbierendes Kissen über das dritte von der Tretmühle Gehäuse (dh der klaren Kunststoffdeckel, der die Tretmühle Fahrspuren deckt) am weitesten von dem Schock Gitter.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, wird aber ein dunkler Raum zu schaffen und zusätzliche Ermutigung kann der untere Teil des Laufbandes zu vermeiden.
5. Wenn die Planung einer Drahtbürste zu verwenden, um zusätzliche Motivation beim Training zur Verfügung zu stellen, stellen Sie sicher, dass man leicht verfügbar ist vor dem Training beginnen.
6. Stellen Sie sicher, dass jedes Arzneimittel oder Verfahren zur Induktion und / oder Linderung von Müdigkeit zur Verfügung und kann bei Schritt 2.14 vorbereitet oder durchgeführt werden.

2. Training Mäuse, denen das Laufband zu verwenden

HINWEIS: Die Ausbildung ist notwendig, dass Mäuse, um sicherzustellen,sind mit dem Laufband und Aufgabe vertraut und können in geeigneter Weise durchführen, wenn getestet. Wenn die Mehrheit der Mäuse trainiert häufig Schocks erhalten oder anderweitig schlechte Ergebnisse bei jeder Trainingseinheit sollten zusätzliche Schulungen durchgeführt werden. Am ersten Tag werden die meisten Mäuse mehrere Male schockiert sein. Am zweiten Tag der Ausbildung sollten die Mäuse werden selten mit dem Netz in Kontakt. Wenn eine Maus durchweg schlechte Trainingsleistung zeigt, sollte es aus der Studie entfernt werden. Für weibliche C57BL / 6NCr Mäuse, dann ist dies ein seltenes Ereignis (weniger als 1% haben von Studien aufgrund der schlechten Trainingsleistung entfernt worden ist), aber es sollte, dass andere Stämme können während des Trainings durchführen anders vermerkt werden.

1. Mit dem Laufband ab (und die Geschwindigkeit auf 0 m / min), einzeln heben die Mäuse von den Schwanz und Platz Mäuse in einzelne Spuren einer Maus Tretmühle. drehen Unverzüglich auf dem entsprechenden Gitter nach jeder Maus auf dem Laufband platzieren. Stellen Sie sicher, dass Mäuse, platziert direkt on das Laufband.
   HINWEIS: Die Höhe der Zeit und Entfernung jeder Maus am Schwanz gehalten wird , sollte vor , indem Sie den Käfig in der Nähe der Tretmühle minimiert werden Mäuse auf dem Laufband zu übertragen und / oder ermöglicht Mäuse auf eine solide Plattform zu stehen (zB einen Drahtkäfig Deckel ), bis sie in der Nähe der Tretmühle sind und der Experimentator ist bereit, sie in der Tretmühle zu platzieren.
2. Lassen Mäuse frei das Laufband für 1-3 min erkunden oder bis jede Maus seiner Fahrspur und / oder empfangen zumindest einen Schock aus dem Netz erforscht hat.
3. Schalten Sie das Laufband und langsam die Geschwindigkeit zu erhöhen, bis sie (etwa 1,5 bis 3,0 m / min) zu bewegen beginnt. Überwachen Sie alle Mäuse, um sicherzustellen, dass sie zu Fuß beginnen. Wenn eine Maus beginnt nicht zu Fuß oder geht auf den Schock Gitter, bereit sein, durch Antippen der Maus mit einer Drahtbürste oder Schwanz Kitzel zu intervenieren.
4. Erhöhen Sie langsam die Laufbandgeschwindigkeit bis 8 m / min. Starten Sie einen Timer und Überwachung Verhalten fortzusetzen.
5. Erhöhen Laufband Geschwindigkeit9 m / min bei 5 min, 10 m / min bei 7 min, und das Laufband bei 10 min zu stoppen.
6. Lassen Sie die Mäuse kurz die Tretmühle erkunden, dann entfernen und zurück jeweils in seinen Käfig.
7. Reinigen Sie das Laufband und Gitter mit Alkohol und ersetzen das Papier oder absorbierende Kissen unter dem Laufband.
8. Zum Zug zusätzliche Mäuse, wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.7.
   HINWEIS: Lassen Sie Alkohol auf dem Laufband zu stellen neue Mäuse vor, um zu trocknen.
9. Am zweiten Tag der Ausbildung, wiederholen Sie Schritt 2.1. Schalten Sie auf dem Laufband und erhöhen die Geschwindigkeit auf 10 m / min. Starten Sie einen Timer.
   HINWEIS: Laufbandgeschwindigkeit kann schneller erhöht werden als die am ersten Tag des Trainings.
10. Erhöhen Laufbandgeschwindigkeit bis 11 m / min bei 5 min, 12 m / min bei 10 min, und stoppen Sie das Laufband bei 15 min.
11. Entfernen Sie Mäuse und bringt sie in ihre Käfige.
12. Reinigen Sie das Laufband und Gitter mit Alkohol und ersetzen das Papier oder absorbierende Kissen unter dem Laufband. Zum Zug zusätzliche Mäuse, wiederholen Sie die Schritte 2.9 bis 2.12.
13. Führen zusätzliche Tage (3 Tage) der Ausbildung in der gleichen Weise wie bei der zweiten Tag.
    Hinweis: Dieser Schritt ist optional, wird aber dringend empfohlen, wenn die meisten oder alle Mäuse (des gleichen Geschlechts und Stamm) mit der Aufgabe Anzeige Schwierigkeit ausgebildet. Mäuse können in der Regel gut in Schritt 3 , wenn sie 3 Tage lang geschult wurden (dh mit einem zusätzlichen Tag der Ausbildung), obwohl zusätzliche oder weniger Tage Training geeignet sein können in Abhängigkeit von ihrer Leistung während der zweiten Trainingstag und die Dauer der Schritt 2.14.
14. Lassen Sie mindestens einen ganzen Tag, in dem die Mäuse auf dem Laufband keine Exposition, bevor Sie fortfahren müssen, passieren zu Schritt 3.
    HINWEIS: Jedes Medikament (e) verwendet zu induzieren und / oder zu lindern Ermüdung während dieses Schrittes verabreicht werden sollte.
    ANMERKUNG: Diese Zeitdauer kann in der Länge und verwendet, variiert werden, Müdigkeit und / oder Test Eingriffe zu induzieren Ermüdung zu verringern oder zu beseitigen. Wenn die Prüfung Mäuse mehr als 7 Tage nach Abschluss der Ausbildung wird eine Pilotstudie empfohlen,sicherzustellen, dass die verwendeten Mäuse während des Tests durchführen wird.

3. Tretmühle Ermüdungstest

HINWEIS: Bei diesem Test Müdigkeit ähnliches Verhalten wie die Ausgaben 5 aufeinander folgenden Sekunden in der "Ermüdungszone" definiert ist. Die Ermüdungszone wird als die Region, die den Teil des Laufbandes innerhalb von etwa 1 Körperlänge des Stoß grid sowie das Gitter selbst definiert. Vor der Prüfung sicherzustellen, dass der Punkt, der diese Zone abgrenzen zu den Experimentator klar ist, wie durch eine Markierung an der Oberseite oder Seite der Tretmühle Fahrspuren angelegt wird.

1. Stellen Sie die Laufbandgeschwindigkeit bis 12 m / min. Das Laufband nicht starten. Stellen Sie sicher, dass die Schockgitter ausgeschaltet sind.
2. Individuell platzieren Mäuse in getrennte Fahrspuren der Tretmühle. Schalten Sie den entsprechenden Gitter unmittelbar nach jeder Maus auf dem Laufband platzieren.
3. Gleichzeitig das Laufband zu starten und eine Stoppuhr.
   HINWEIS: Verwenden Sie nicht eingreifen, während außer Testen Mäuse zu entfernendass erfüllen das Kriterium für die Entfernung (siehe Schritt 3.5).
4. Erhöhen Laufbandgeschwindigkeit angezeigt , wie in Tabelle 1. Sorgfältig beobachten alle Mäuse während des gesamten Tests.
   HINWEIS: Das Laufband aufgelistet Geschwindigkeiten wurden in Tabelle 1 basierend auf Beobachtungen von erwachsenen weiblichen C57BL / 6NCr Mäuse ausgewählt. Höhere Laufband Geschwindigkeiten für größere (zB Auszucht CD-1 - Mäuse) oder athletischer Mäuse geeignet sein.
5. Wenn eine Maus für 5 kontinuierliche sec in der Ermüdungszone bleibt, umgehend die Maus aus dem Laufband zu entfernen und die Dauer aufzeichnen und distanzieren es lief.
6. Wenn keine Mäuse auf dem Laufband bleiben, das Laufband zu stoppen. Reinigen Sie das Laufband und Gitter mit Alkohol und ersetzen das Papier oder absorbierende Kissen unter dem Laufband.
7. Um zu testen, zusätzliche Mäuse, wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.6.
   Hinweis: Dieser Schritt ist optional.

Ergebnisse

Dieses Protokoll ermöglicht ermüdungsähnliche Verhalten bei Mäusen gemessen werden mit einem Laufband. Die Daten in diesem Abschnitt wurde von Trainings- und Test 3 separate Gruppen von Mäusen erhalten das aktuelle Protokoll (ohne Abbildung 1A und 1C) verwendet wird . Ermüdung, 5-Fluorouracil (5-FU), einem zytotoxischen Chemotherapeutikum bekannt zu verursachen Ermüdung beim Menschen ³⁰ und Ermüdungsartiges Verhalten bei Mäusen ^1...

Diskussion

Das aktuelle Protokoll beschreibt, wie eine Maus Tretmühle zu verwenden Müdigkeit ähnliches Verhalten zu messen. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber VWRA, einem gemeinsamen preclinical Assay Ermüdungsähnliches Verhalten. VWRA erfordert, dass Mäuse, die mit dem Testgerät zu interagieren, zu wählen. Als Ergebnis interagieren einige Inzucht erzeugten Stämme von Mäusen selten mit dem Rad ¹⁶ und laufen so wenig , daß es schwierig oder unmöglich sein kann , eine Ermüdungsinduzierte Abnahme...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Exer 3/6 Animal Treadmill	Columbus Instruments	1050-RM Exer-3/6
Stopwatch	Daigger	EF24490M
Wire brush	Fisher Scientific	03-572-5
Compressed air	Dust-Off	FALDSXLPW
Absorbent pads	Daigger	EF2175CX
Butcher paper	Newell Paper Company	4620510
Alcohol (70%)	Fisher Scientific	BP82011