A esteira de fadiga de teste: Um ensaio simples, de alta taxa de transferência de Fadiga-like Comportamento para o Mouse

Resumo

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

Resumo

A fadiga é um sintoma proeminente em muitas doenças e distúrbios e reduz a qualidade de vida para muitas pessoas. A falta de clara patogénese e insuficiência das intervenções actuais para tratar a fadiga adequadamente em todos os pacientes deixa uma necessidade de novas opções de tratamento. Apesar da necessidade terapêutica e importância da investigação pré-clínica para ajudar a identificar novos tratamentos promissores, alguns ensaios pré-clínicos de fadiga estão disponíveis. Além disso, o ensaio pré-clínico mais comum utilizado para avaliar o comportamento fadiga semelhante, roda de corrida voluntária, não é adequado para utilização com algumas estirpes de ratinhos, pode não ser sensível a drogas que reduzem a fadiga, e tem relativamente baixa taxa de transferência. O protocolo atual descreve um romance, ensaio pré-clínico não-voluntária de comportamento à fadiga, como, o teste de fadiga esteira, e fornece provas da sua eficácia na detecção de comportamento à fadiga, como em ratos tratados com um medicamento de quimioterapia conhecido por causar fadiga em seres humanos e fadiga comportamento -como nos animals. Este ensaio pode ser uma alternativa benéfica para roda de corrida, como o comportamento de fadiga-like e potenciais intervenções pode ser avaliado em um maior número de ratos ao longo de um período de tempo mais curto, permitindo assim a descoberta mais rápida de novas opções terapêuticas.

Introdução

Fadiga afeta uma ampla gama de pessoas, pode reduzir significativamente a qualidade de vida, e muitas vezes tem uma patogênese obscura ou desconhecida. Fadiga relacionada com o cancro (CRF), por exemplo, é experimentada pela maioria dos pacientes com cancro em tratamento e pode persistir por muito tempo após o tratamento do cancro tenha sido completada e na ausência de cancro detectáveis ^​​1. Além disso, a fadiga é também um sintoma proeminente em inúmeras outras doenças e distúrbios, incluindo a síndrome de fadiga crónica, depressão, diabetes, e fibromialgia. Felizmente, existem intervenções não farmacológicas que são capazes de ajudar algumas pessoas que sofrem de fadiga (por exemplo, o exercício pode reduzir CRF para alguns pacientes com cancro da mama ^2,3), mas muitas pessoas ainda não têm tratamento eficaz. Além disso, tratamentos com drogas existentes para o CRF não foram encontrados para ser ampla, se de todo, eficaz ^4-7.

Apesar da necessidade terapêutica e ausência de Drug opções de tratamento, os ensaios pré-clínicos de fadiga para auxiliar na descoberta e no desenvolvimento de novos tratamentos fadiga faltam, especialmente em modelos animais. Um dos únicos ensaios pré-clínicos de fadiga para estudos com roedores é a atividade roda voluntária de corrida (VWRA) ^9-15, em que ratos ou outros roedores têm acesso gratuito a uma roda de corrida e sua atividade funcionamento diário é gravado. Em muitos estudos, VWRA é a única medida do comportamento de fadiga-like, com o comportamento de fadiga-like definido (em qualquer VWRA ou o protocolo atual) como uma diminuição da atividade física medida no grupo experimental. Embora VWRA pode fornecer uma medida longitudinal útil de fadiga-como comportamento, é um ensaio relativamente de baixo rendimento, a corrida varia consideravelmente entre linhagens de camundongos puras ^16, e requer assuntos a serem alojados individualmente, o que pode causar mudanças no desempenho comportamento e teste ^17-19. Outros ensaios, como a casa gaiola monitoramento comportamental eanálise, também pode fornecer a coleta de dados contínua e alguns sistemas podem permitir assuntos a serem alojados em pares ^20. Estes ensaios têm utilidade, mas pode ser menos sensível como um meio de detectar comportamento de fadiga-like e, como a roda de corrida, também são de baixo rendimento.

Em contraste com VWRA, testes rato esteira não dependem de actividade voluntária e pode ser concluído em um curto período de tempo, permitindo um maior rendimento. Em comparação com VWRA, estes testes empregam motivadores externos. Especificamente, há geralmente uma grade de metal eletrificada localizado na parte traseira da correia em movimento para fornecer os ratos com um choque elétrico deve deixam de funcionar. Além desta grade de choque, os ratos podem ser motivados a correr na esteira por meio de vários outros métodos, incluindo cutucando, cutucando, ou tocá-los com uma mão, escova, ou outra ferramenta e dirigir sopros curtos de ar para eles. Em vez de fadiga, testes rato esteira são muitas vezes utilizados para medir aeróbio e / ou anaerOBIC capacidade de exercício ^21-25. Ratos são motivados a executar até que eles são incapazes de ou não querem continuar a correr na esteira como um meio de escapar novos choques elétricos. Testes em seguida, termina quando os ratos cumprir o critério de exaustão. Nestes protocolos, para garantir que os ratos atingir verdadeira exaustão fisiológico, o critério para a exaustão é geralmente definido como passar cinco segundos contínuos que colocam na parte superior da grade de choque e não para continuar a execução em face de estímulos aversivos repetidas. Assim, o comportamento de fadiga-like podem ser mascarados em testes de esteira típicos devido à forte natureza aversiva da motivação externa e critério para terminar o teste. Curiosamente, e em contraste com muitos outros estudos utilizando esteiras de roedores, uma publicação recente descreve uma outra versão de um teste de fadiga tapete rolante, o qual foi utilizado como parte de um exame dos efeitos do stress social em ratos ^26. Embora o método utilizado por este grupo marcadamente diferente do Cuprotocolo rrent (ou seja, eles empregaram uma esteira single-lane e exigiu 10 segundos de choque elétrico como o critério para terminar seu teste), o estudo destaca a utilidade e interesse no desenvolvimento de um teste de fadiga rápida, simples de usar a esteira do rato.

A fadiga é provável que seja detectável por outros meios de roda de funcionamento e alterações no comportamento de rotina. CRF torna os pacientes se sentem esgotados por uma menor quantidade de fadiga muscular, como determinado pela análise eletromiográfica, do que as pessoas sem CRF ^27. Além disso, motivação reduzida tem sido observado e é medido por várias escalas de medição de fadiga humana ^28,29. Assim, um ensaio pré-clínico útil do comportamento de fadiga-like deve distinguir entre ratos saudáveis ​​e cansados ​​com base em uma medida que não seja a capacidade fisiológica e não deve diminuições obscuros em motivação. Para atingir esse fim, evitando limitações de VWRA e outros ensaios, os wa métodos atuaiss desenvolvido por adaptar o teste do rato esteira. Este método usa uma grade de choque como o único motivador externo para fazer camundongos correr na esteira. Ratos aprendem rapidamente que a rede proporciona um estímulo aversivo e prontamente afastar-se dela quando colocado na esteira e manter uma certa distância dele durante a corrida.

Quando os ratos fadiga, eles passam cada vez mais tempo na direção da parte de trás da esteira em vez de manter a velocidade em direção à extremidade dianteira. Assim, o critério para a conclusão do teste neste protocolo é passar cinco segundos contínuas na zona de fadiga designado (isto é, a parte traseira do tapete rolante, que varia de cerca de um comprimento do corpo da grade de choque para, e incluindo, a grade de choque). Isso leva vantagem da natureza aversiva da rede sem a necessidade de ratos para receber muitos ou quaisquer choques reais após o treinamento. Ao permitir que os ratinhos para completar o teste usando o critério de corrente em vez de exaustão (como definido acima),este método proporciona um meio de usar a esteira para medir o comportamento de fadiga semelhante ao invés de sua máxima capacidade fisiológica (ou quase máxima). Assim, este método pode proporcionar um ensaio simples e de alto rendimento de comportamento fadiga semelhantes em ratinhos e podem servir quer como uma medida independente ou complementar a outros ensaios de comportamento fadiga semelhante.

Protocolo

Este procedimento foi aprovado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais Animal Care e do Comitê Use.

1. Preparação

1. Para permitir a rápida identificação de cada rato antes do teste, tatuagem as caudas de todos os ratos para serem treinados e testados com marcas de identificação.
   NOTA: Este passo é opcional. marcador permanente ou outros métodos de identificação pode ser utilizado como uma alternativa à tatuagem.
2. Antes da formação e ratinhos de teste, certifique-se de que a esteira é sobre uma superfície plana e definido para o tapete rolante ângulo desejado de inclinação (ângulo recomendado de inclinação: 10 °, para ser mantido consistente ao longo de treinamento e teste) e definir a frequência de choque elétrico e intensidade de forma adequada (recomendado: 2 Hz, 1,22 mA).
   NOTA: O choque elétrico usado deve produzir não mais do que uma sensação de formigamento leve quando tocado por um dedo sem luva e deve ser entregue em um fash pulsátilion (com cada choque com duração de 200 ms).
3. Coloque uma folha de papel de açougueiro ou um pano absorvente debaixo do tapete rolante para recolher boli fecal e urina durante o treinamento e testes.
4. Colocar uma folha de papel ou de uma almofada absorvente sobre a terceira esteira do alojamento (isto é, a tampa de plástico transparente que cobre as faixas do tapete rolante) mais afastada da grade de choque.
   NOTA: Este passo é opcional, mas vai criar um espaço mais escura e podem fornecer o incentivo adicional para evitar a parte inferior do tapete rolante.
5. Se pretende utilizar uma escova de aço para fornecer motivação adicional durante o treinamento, garantir que um está prontamente disponível antes de iniciar as sessões de treinamento.
6. Certifique-se de que qualquer fármaco ou método para induzir e / ou aliviar a fadiga está disponível e pode ser preparado ou realizada durante o Passo 2,14.

2. Ratos treinamento para usar a escada rolante

NOTA: O treinamento é necessário para garantir que os ratosestão familiarizados com a esteira e tarefa e pode executar adequadamente quando testado. Se a maioria dos ratos sendo treinados estão recebendo choques frequentes ou de outra forma um mau desempenho durante uma sessão de treinamento, sessões de formação adicionais devem ser realizados. No primeiro dia, a maioria dos ratos será chocado várias vezes. No segundo dia do treinamento, os ratos deve ser raramente fazer contato com a grade. Se um rato exibe desempenho consistente formação pobre, que devem ser retirados do estudo. Para ratinhos C57BL / 6NCr femininos, esta é uma ocorrência rara (menos do que 1% ter sido removido a partir de estudos, devido a pobre desempenho de formação), mas deve notar-se que outras estirpes podem funcionar de modo diferente durante o treino.

1. Com o tapete rolante (e velocidade definido para 0 m / min), levante individualmente os ratos pelas cauda dos ratos e coloque em pistas separadas de uma escada rolante mouse. Prontamente ativar a grade correspondente após a colocação de cada rato na esteira. Certifique-se de que os ratos são colocados directamente ón o cinto de esteira.
   NOTA: A quantidade de tempo e distância cada rato é realizada pela cauda deve ser minimizado, colocando a gaiola perto da esteira antes de transferir os ratos para a esteira e / ou permitindo ratos para ficar em uma plataforma sólida (por exemplo, uma tampa de gaiola de arame ) até que eles estão perto da esteira e o experimentador está pronto para colocá-los na esteira.
2. Permitir que os ratos de explorar livremente a esteira para 1-3 min ou até que cada rato tem explorado sua pista e / ou receberam pelo menos um choque da rede.
3. Ligue o tapete rolante e, lentamente, aumentar a velocidade até que começa a mover (aproximadamente 1,5 a 3,0 m / min). Monitorar todos os ratos para garantir que eles comece a caminhar. Se um rato não comece a andar ou caminha em direção a grade choque, estar preparado para intervir tocando o mouse com uma escova de arame ou cócegas cauda.
4. Lentamente, aumente a velocidade da esteira de 8 m / min. Iniciar um temporizador e continuar comportamento de monitoramento.
5. Aumentar a velocidade da esteira de9 m / min a 5 min, 10 m / min a 7 min, e parar a esteira em 10 min.
6. Permitir que os ratos para explorar rapidamente a escada rolante, em seguida, remover e voltar cada um para sua gaiola.
7. Limpar a esteira e grade com álcool e substituir o papel ou pano absorvente por baixo da escada rolante.
8. Para treinar ratos, repita os passos 2.1 a 2.7.
   NOTA: Permitir álcool secar antes de colocar novos ratos na esteira.
9. No segundo dia de treinamento, repita o Passo 2.1. Ligue o tapete rolante e aumentar a velocidade de 10 m / min. Iniciar um temporizador.
   NOTA: a velocidade do tapete rolante pode ser aumentada mais rapidamente do que no primeiro dia de treino.
10. Aumentar a velocidade da esteira a 11 m / min a 5 min, 12 m / min a 10 min, e parar a esteira em 15 min.
11. Retirar ratos e devolvê-los às suas gaiolas.
12. Limpar a esteira e grade com álcool e substituir o papel ou pano absorvente por baixo da escada rolante. Para treinar ratos, repita os passos 2.9 através de 2.12.
13. Realizar dias adicionais (3 dias) de formação da mesma maneira como o segundo dia.
    Nota: Esta etapa é opcional, mas é altamente recomendável se a maioria ou todos os ratos (do mesmo sexo e tensão) sendo treinados dificuldade de exibição com a tarefa. Ratos podem geralmente um bom desempenho na Etapa 3, quando eles foram treinados durante 3 dias (ou seja, com um dia adicional de formação), embora dias adicionais ou menos de treinamento podem ser apropriadas dependendo de seu desempenho durante o segundo dia de treino e da duração passo 2,14.
14. Permitir que pelo menos um dia inteiro para passar em que os ratos não têm exposição a esteira antes de prosseguir para a Etapa 3.
    NOTA: Qualquer fármaco (s) utilizados para induzir e / ou aliviar a fadiga deve ser administrada durante esta etapa.
    NOTA: Este período de tempo pode variar em comprimento e utilizada para induzir a intervenções de fadiga e / ou de teste para reduzir ou eliminar a fadiga. Se testar ratos mais de 7 dias após a conclusão da formação, um estudo-piloto é recomendado paraverificar se os ratinhos utilizados irá executar durante o teste.

3. esteira teste de fadiga

NOTA: Neste teste, o comportamento de fadiga-like é definido como passar 5 segundos consecutivos na "zona de fadiga". A zona de fadiga é definido como a região que engloba a parte do cinto de esteira dentro de aproximadamente um comprimento do corpo da grade de choque, bem como a grelha, em si. Antes do teste, garantir que o ponto de delinear esta zona é claro para o experimentador, tais como através da aplicação de uma marca para a parte superior ou lateral de pistas de esteira.

1. Defina a velocidade da esteira a 12 m / min. Não inicie o tapete rolante. Certifique-se de que o choque grades estão desligados.
2. Individualmente colocar ratos em faixas separadas da esteira. Ativar a grade correspondente imediatamente após a colocação de cada rato na esteira.
3. Simultaneamente começar a esteira e um cronômetro.
   NOTA: Não intervir durante os testes, exceto para remover os ratosque cumprem o critério para a remoção (veja o passo 3.5).
4. Aumentar a velocidade da esteira, como indicado na Tabela 1. Observar atentamente todos os ratos durante todo o teste.
   NOTA: A esteira velocidades listadas na Tabela 1 foram selecionados com base em observações de fêmeas adultas camundongos C57BL / 6NCr. Velocidades mais altas, o tapete rolante pode ser apropriado para a maior (por exemplo, não consanguíneos ratinhos CD-1) ou mais ratinhos atléticos.
5. Se um rato permanece na zona de fadiga por 5 s contínua, retire imediatamente o rato da esteira e gravar a duração e distância funcionou.
6. Quando há ratos permanecem na esteira, parar a esteira. Limpar a esteira e grade com álcool e substituir o papel ou pano absorvente por baixo da escada rolante.
7. Para testar ratos, repita os passos 3.1 a 3.6.
   NOTA: Este passo é opcional.

Resultados

Este protocolo permite comportamento à fadiga do tipo a ser medido em ratos usando uma escada rolante. Os dados apresentados nesta seção foi obtida por treinamento e teste 3 grupos separados de ratos usando o protocolo atual (excluindo Figura 1A e 1C). Para provocar fadiga, 5-fluorouracilo (5-FU), um fármaco quimioterapia citotóxica conhecido por causar fadiga nos seres humanos ³⁰ e o comportamento fadiga semelhante em ratinhos ^10,13...

Discussão

O protocolo atual descreve como usar uma escada rolante mouse para medir o comportamento de fadiga-like. Este método possui várias vantagens sobre VWRA, um ensaio pré-clínico comum de comportamento fadiga semelhante. VWRA requer que os ratos escolher para interagir com o aparelho de ensaio. Como resultado, algumas estirpes de ratinhos consanguíneos raramente interagem com a roda ¹⁶ e executado tão pouco que pode ser difícil ou impossível de identificar uma diminuição induzida por fadiga em actividad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Exer 3/6 Animal Treadmill	Columbus Instruments	1050-RM Exer-3/6
Stopwatch	Daigger	EF24490M
Wire brush	Fisher Scientific	03-572-5
Compressed air	Dust-Off	FALDSXLPW
Absorbent pads	Daigger	EF2175CX
Butcher paper	Newell Paper Company	4620510
Alcohol (70%)	Fisher Scientific	BP82011