Бегущая испытания на усталость: Простой, высокая пропускная способность Количественный анализ Усталость типа поведения для мыши

Резюме

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

Аннотация

Усталость является явным симптомом многих заболеваний и расстройств и снижает качество жизни для многих людей. Отсутствие четкого и патогенез недостаточности текущих мер для адекватного лечения усталости у всех пациентов оставляет потребность в новых вариантах лечения. Несмотря на терапевтическом необходимость и важность доклинических исследований в содействии выявлению перспективных новых методов лечения, несколько доклинических анализов усталости доступны. Кроме того, наиболее распространенным доклинические анализ используется для оценки усталости, как поведение, добровольное колесо, идущее, не подходит для использования с некоторыми штаммами мышей, не могут быть чувствительными к лекарственным препаратам, которые уменьшают усталость, и имеет относительно низкую пропускную способность. Текущий протокол описывает новый путь, недобровольную доклинические количественный анализ усталости как поведение, тест на усталость беговой дорожке, и свидетельствует о его эффективности в выявлении усталостную поведение как у мышей, получавших препарат химиотерапии известно, вызывает усталость в организме человека и усталость -как поведение в анимылевая сторона Этот анализ может быть полезной альтернативой колеса бега, так как усталость, как поведение и потенциальные вмешательства могут быть оценены в большем количестве мышей в течение более короткого периода времени, что позволяет быстрее открытие новых терапевтических возможностей.

Введение

Усталость влияет на широкий круг людей, может заметно снизить качество жизни, и часто имеет неясную или неизвестный патогенез. Усталость , связанных с раком (CRF), например, испытывают большинство больных раком , проходящих лечение и может сохраняться еще длительное время после лечения рака была завершена , и в отсутствие выявляемой рака ^1. Кроме того, усталость также является явным симптомом во многих других заболеваний и расстройств, в том числе синдром хронической усталости, депрессии, диабета и фибромиалгии. К счастью, существуют немедикаментозные вмешательства, которые способны помочь некоторым людям , испытывающим усталость (например, физические упражнения могут уменьшить ХПН для некоторых больных раком молочной железы ^2,3), но многие люди до сих пор нет эффективного лечения. Кроме того, существующие методы лечения лекарственным средством для CRF не было установлено, что в целом, если вообще, эффективными ^4-7.

Несмотря на терапевтической потребности и отсутствие Druг варианты лечения, доклинические анализы усталости, чтобы помочь в открытии и разработке новых лечения усталости не хватает, особенно в моделях на животных. Один из немногих доклинических анализов усталости для исследований на грызунах работает под управлением деятельность добровольного колеса (VWRA) ^9-15, в которых мыши или другие грызуны дают свободный доступ к ходовое колесо и их ежедневный пробег активность регистрируется. Во многих исследованиях VWRA является единственной мерой усталости, как поведение, с усталостной поведение как определено (в любом VWRA или текущего протокола) в уменьшении измеряемой физической активности в экспериментальной группе. Хотя VWRA может служить полезным продольное измерение усталостной типа поведения, она является относительно низкая пропускная способность анализа, работает значительно варьируется между инбредных линий ¹⁶ мыши, и он требует предметы должны быть индивидуально размещены, которые могут привести к изменениям в поведении и тестирования производительности ^17-19. Другие анализы, такие как домашняя клетка поведенческого мониторинга ианализ, может также обеспечить непрерывный сбор данных и в некоторых системах может позволить субъектам быть размещены в парах ^20. Эти анализы имеют применение, но могут быть менее чувствительны, как средство обнаружения усталости, как поведение и, как колесо, идущее, также низкой пропускной способностью.

В отличие от VWRA, мышь беговой тесты не полагаться на добровольной деятельности и может быть завершена в течение короткого промежутка времени, что позволяет более высокой пропускной способности. По сравнению с VWRA, эти тесты используют внешние мотиваторы. В частности, там, как правило, электрифицированная металлическая сетка расположена на задней части движущейся ленты, чтобы обеспечить мышей с электрическим током, если они перестают работать. В дополнение к этой ударной сетке, мыши могут быть мотивированы, чтобы работать на беговой дорожке с помощью нескольких других методов, в том числе подталкивания, тыкая, или прикасаясь к ним руки, кисти или другого инструмента и направляя короткие затяжек воздуха на них. Вместо усталости, тесты мыши беговой дорожки часто используются для измерения аэробных и / или anaerтолерантность к физической нагрузке OBIC ^21-25. Мыши мотивированы, чтобы работать, пока они не в состоянии или не желает продолжать работать на беговой дорожке в качестве средства избежать дальнейших поражения электрическим током. Тестирование затем заканчивается, когда мыши соответствуют критерию истощения. В этих протоколах, чтобы гарантировать, что мыши достигают истинного физиологическое утомление, критерий исчерпания часто определяется как тратить пять секунд без возложения на верхней части ударной сетки и не в состоянии продолжать работать в условиях повторных аверсивных стимулов. Таким образом, усталость, как поведение может быть замаскировано в типичных тестах беговой дорожке из-за сильного аверсивного характера внешней мотивации и критерия для завершения теста. Интересно, что и в отличие от многих других исследований с использованием грызунов третбаны, недавняя публикация описывает другой вариант теста беговой дорожки на усталость, которая была использована в рамках изучения последствий социального стресса у мышей ^26. Хотя метод, используемый этой группе заметно отличались от у.е.Протокол ко в ой (то есть, они использовали однополосной беговую дорожку и требуется 10 сек электрическим током в качестве критерия для прекращения их тест), их исследование подчеркивает полезность и заинтересованность в развитии быстрый, простой тест усталость с помощью беговой дорожке мыши.

Усталость, вероятно, будет обнаружить с помощью других, чем колесо, идущее средств и изменения в рутинных поведения. CRF делает пациенты чувствуют себя исчерпываются меньшим количеством мышечной усталости, как определено электромиографической анализа, чем люди без ХПН ^27. Кроме того, снижение мотивации было отмечено в и измеряется несколькими шкалами измерения усталости человека ^28,29. Таким образом, полезный доклинические анализ усталостной поведение как следует проводить различие между здоровыми и уставших мышей на основе измерения, кроме физиологической способности и не должны заслонять снижение мотивации. Для достижения этой цели, избегая при этом ограничения VWRA и другие анализы, текущие ва методы разработана путем адаптации тест мыши на беговой дорожке. Этот метод использует ударную сетку в качестве единственного внешнего мотиватор, чтобы заставить мышей работать на беговой дорожке. Мыши быстро узнают, что сетка обеспечивает отталкивающее стимул и незамедлительно удаляться от него при размещении на беговой дорожке и поддерживать на некотором расстоянии от него во время бега.

Когда мышей усталость, они проводят больше времени, постепенно по направлению к задней части беговой дорожки вместо поддержания скорости в направлении переднего конца. Таким образом, критерием для завершения испытаний , предусмотренных в настоящем протоколе тратит пять непрерывных секунд в обозначенной зоне усталости (то есть, задняя часть беговой дорожки, в пределах от приблизительно одной длины тела от ударной сетки к, и в том числе, ударной сетке). Это имеет преимущество отвращающей природы сетки, не требуя мышей получить много или каких-либо фактических потрясений после тренировки. Допуская мыши, чтобы завершить тестирование с использованием текущего критерия, а не истощением (как определено выше),этот метод обеспечивает средство использования беговой дорожки для измерения усталости, как поведение, а не его максимального (или почти максимальной) физиологической способности. Таким образом, этот метод может обеспечить простой, высокой пропускной способностью анализа усталостной типа поведения у мышей и может служить либо в качестве самостоятельного или дополнительной меры к другим анализам усталостного типа поведения.

протокол

Эта процедура была одобрена Национальным институтом диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний по уходу и использованию животных комитета.

1. Подготовка

1. Для обеспечения быстрой идентификации каждой мыши перед тестом, татуировка хвосты всех мышей быть обучены и протестированы с опознавательных знаков.
   Примечание: Этот шаг является необязательным. Перманентный маркер или другие способы идентификации могут быть использованы в качестве альтернативы татуировке.
2. До начала обучения и тестирования мышей, убедитесь, что беговая дорожка находится на ровной поверхности и установите на беговой дорожке до нужного угла наклона (рекомендуемый угол наклона: 10 °, чтобы быть постоянной в течение всего обучения и тестирования) и установить электрический шок частоту и интенсивность соответственно (рекомендуется: 2 Гц, 1,22 мА).
   Примечание: поражение электрическим током используется не должен производить не более мягкого покалывания, когда Прикосновение пальцем и без перчатки должны быть доставлены в пульсирующей Fashиона (с каждым шоком длительностью 200 мс).
3. Поместите чистый лист бумаги мясника или впитывающую прокладку под беговую дорожку для сбора фекальных и мочи Боли во время обучения и тестирования.
4. Поместите лист бумаги или абсорбирующую прокладку над трети корпуса беговой дорожке (то есть, прозрачной пластиковой крышкой , которая покрывает беговой дорожки) на противоположной стороне от ударной сетки.
   Примечание: Этот шаг не является обязательным, но и создаст более темное пространство и может обеспечить дополнительную поддержку, чтобы избежать нижнюю часть беговой дорожки.
5. Если планируете использовать проволочную щетку, чтобы обеспечить дополнительную мотивацию во время тренировок, убедитесь, что один легко доступен до начала учебных занятий.
6. Убедитесь, что любое лекарственное средство или способ индуцирования и / или облегчения усталость доступен и могут быть получены или выполнены в шаге 2.14.

2. Подготовка Мыши для использования беговой дорожки

Примечание: Обучение необходимо обеспечить, что у мышейзнакомы с беговой дорожки и задачи и может выполнять надлежащим образом при тестировании. Если большинство мышей обучаются получают частые удары или иным образом работает плохо во время любой тренировки, дополнительные учебные занятия должны быть выполнены. В первый день, большинство мышей будет в шоке несколько раз. На второй день обучения, мыши должны быть редко контактировал с сеткой. Если мышь показывает стабильно низкую эффективность обучения, она должна быть удалена из исследования. Для самок мышей линии C57BL / 6NCr, это случается редко (менее 1%, были удалены из исследований из-за плохой работы обучение), но следует отметить, что другие штаммы могут выполняться по-разному во время тренировки.

1. С беговой дорожки выключения (и скорости, установленной до 0 м / мин), индивидуально поднимите мышей за хвост и место мышей на отдельные переулкам беговой дорожке мыши. Оперативно включить соответствующую сетку после размещения каждой мыши на беговой дорожке. Убедитесь в том, что мыши, которые размещаются непосредственно оп беговой дорожке ремень.
   Примечание: Количество времени и расстояния каждой мыши удерживается за хвост должен быть сведен к минимуму путем размещения клетку рядом с беговой дорожки до передачи мышей на беговой дорожке и / или позволять мышей стоять на твердой платформе (например, проводную клетку крышку ), пока они не находятся рядом с беговой дорожки и экспериментатор готов разместить их в беговой дорожке.
2. Разрешить мышей свободно исследовать беговой дорожке в течение 1-3 мин или пока каждая мышь исследовала свою полосу и / или получили по меньшей мере, один удар от сетки.
3. Включите беговую дорожку и постепенно увеличивать скорость, пока она не начнет двигаться (приблизительно от 1,5 до 3,0 м / мин). Контроль всех мышей, чтобы гарантировать, что они начинают ходить. Если мышь не начинает ходить или идет к ударной сетке, быть готовы вмешаться, нажав на мышь с проволочной щеткой или хвостовой щекотки.
4. Медленно увеличить скорость на беговой дорожке до 8 м / мин. Запустить таймер и продолжить поведение мониторинга.
5. Увеличение скорости на беговой дорожке до9 м / мин при 5 мин, 10 м / мин в течение 7 мин, и остановки беговой дорожки в 10 мин.
6. Дайте мышей кратко исследовать беговой дорожке, а затем удалить и вернуться каждый в своей клетке.
7. Очистите беговой дорожки и сетки с алкоголем и заменить бумагу или впитывающую прокладку под беговой дорожке.
8. Для подготовки дополнительного мышей, повторите шаги 2.1 через 2.7.
   Примечание: Разрешить алкоголь высохнуть перед размещением новых мышей на беговой дорожке.
9. На второй день тренинга, повторите шаг 2.1. Включите беговую дорожку и увеличить скорость до 10 м / мин. Запустить таймер.
   Примечание: скорость беговой дорожки может быть увеличена более быстрыми темпами, чем в первый день обучения.
10. Увеличение скорости на беговой дорожке до 11 м / мин при 5 мин, 12 м / мин через 10 мин, и остановки беговой дорожки на 15 мин.
11. Удалить мышей и вернуть их в их клетках.
12. Очистите беговой дорожки и сетки с алкоголем и заменить бумагу или впитывающую прокладку под беговой дорожке. Для подготовки дополнительного мышей, повторите шаги 2.9 через 2.12.
13. Выполнение дополнительных дней (3 дня) обучения в том же порядке, что и во второй день.
    Примечание: Этот шаг не является обязательным, но настоятельно рекомендуется, если большинство или все мыши (одного и того же пола и напряжения) проходят подготовку дисплея трудности с этой задачей. Мыши , в общем случае может хорошо работать на шаге 3 , когда они прошли обучение в течение 3 -х дней (то есть, один дополнительный день обучения), несмотря на то дополнительное или меньшее число дней обучения может быть целесообразным в зависимости от их работы во время второго тренировочного дня и продолжительность Шаг 2.14.
14. Позвольте по крайней мере один полный день, чтобы пройти, в котором мыши не имеют воздействия на беговой дорожке, прежде чем перейти к шагу 3.
    Примечание: Любой лекарственный препарат (ы), используемый для индукции и / или уменьшить усталость следует вводить в течение этого шага.
    Примечание: Этот период времени может изменяться в длину и используется, чтобы вызвать усталость и / или тестовые мероприятия для уменьшения или устранения усталости. Если тестирование мышам более чем через 7 дней после завершения обучения, экспериментальное исследование рекомендуетсяубедитесь, что мыши, используемые будут выполнять во время тестирования.

3. Усталость тредмил-теста

Примечание: В этом тесте усталостной как поведение определяется как тратить 5 секунд подряд в "усталостной зоне". Зона усталость определяется как область, охватывающую часть беговой дорожки ремня в пределах приблизительно 1 длины тела ударной сетки, а также сетки, само собой. Перед тестированием убедитесь, что точка очерчивая эту зону ясно экспериментатору, например, путем нанесения метки на верхней или боковой части беговой дорожки полос.

1. Установите скорость на беговой дорожке до 12 м / мин. Не начинайте беговую дорожку. Убедитесь в том, что шок сети выключены.
2. Индивидуально место мышей в отдельных полосах беговой дорожки. Включите соответствующей сетке сразу после размещения каждой мыши на беговой дорожке.
3. Одновременно начать беговую дорожку и секундомер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не вмешиваются во время тестирования за исключением того, чтобы удалить мышейкоторые соответствуют критерию удаления (см Шаг 3.5).
4. Увеличение скорости на беговой дорожке , как указано в таблице 1. Тщательно соблюдать все мышей на протяжении всего испытания.
   Примечание: Беговая дорожка Скорости , указанные в таблице 1 , были отобраны на основе наблюдений из взрослых самок мышей C57BL / 6NCr. Более высокие скорости беговой дорожке может быть целесообразным для увеличения (например, беспородных CD-1 мышей) или более спортивных мышей.
5. Если мышь остается в зоне усталости в течение 5 сек непрерывной, быстро удалить мышь из беговой дорожки и записывать длительность и расстояние он побежал.
6. При отсутствии мыши не остаются на беговой дорожке, остановите беговую дорожку. Очистите беговой дорожки и сетки с алкоголем и заменить бумагу или впитывающую прокладку под беговой дорожке.
7. Для проверки дополнительных мышей, повторите шаги 3.1 через 3.6.
   Примечание: Этот шаг является необязательным.

Результаты

Этот протокол позволяет усталостной как поведение измеряется у мышей с помощью беговой дорожки. Данные , представленные в этом разделе была получена путем обучения и тестирования 3 отдельных групп мышей с использованием текущего протокола ( за исключением Рисуно...

Обсуждение

Текущий протокол описывает, как использовать беговую дорожку мыши для измерения усталости, как поведение. Этот метод имеет ряд преимуществ перед VWRA, общей доклинической анализа усталостной типа поведения. VWRA требует, что мыши, выбрать, чтобы взаимодействовать с испытательным устройст...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Exer 3/6 Animal Treadmill	Columbus Instruments	1050-RM Exer-3/6
Stopwatch	Daigger	EF24490M
Wire brush	Fisher Scientific	03-572-5
Compressed air	Dust-Off	FALDSXLPW
Absorbent pads	Daigger	EF2175CX
Butcher paper	Newell Paper Company	4620510
Alcohol (70%)	Fisher Scientific	BP82011