הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

Summary

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Abstract

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library¹. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

Introduction

טכניקת assay שפותחה לאחרונה תפוקה גבוהה תא בודד מאפשרת אנזימי רומן שיוקרו מספריה גנטית בקנה מידה גדולה מבוססת על הפעילות התפקודית שלהם ^1. ברמת התא הבודדה, חלבונים בויסות שעתוק מועסקים כדי לעורר ביטוי גני כתב על ידי חישת מולקולות קטנות מיוצרות כתוצאה של פעילות אנזים היעד. הגישה מוקדם אחד המעורבים את הבידוד של אופרון משפיל-פנול מ Ralstonia eutropha E2 באמצעות הביטוי הגנטי-induced המצע ההקרנה (SIGEX) שיטה, שבה המצע גורם הביטוי של עיתונאי חלבון ^2. NhaR של Pseudomonas putida שמש כדי לבחור dehydrogenase benzaldehyde ^3, ו LysG מ glutamicum Corynebacterium נוצל להקרנת התפוקה הגבוהה של L- ליזין-ייצור זן חדש מספרי מוטציה מגוונות ^4.

בעבר, screeni אנזים גנטימערכת ng (GESS) הוצעה כפלטפורמת הקרנה החלימה בדרך כלל ^5. מערכת זו משתמשת רגולטור dimethylphenol הכרה-פנול, DmpR, של פ putida. DmpR (E135K), ו מוטציה של DmpR, יכול להיות מועסק גם GESS (PNP-GESS) לצורך זיהוי של p -nitrophenol (PNP). בנוכחות אנזימי יעד ייצור תרכובות פנוליות, GESS ב E. קולי תאים פולטים אותות קרינה, מה שמאפשר את הבידוד המהיר של תאים בודדים באמצעות סדרן תא מופעל פלואורסצנטי (FACS). אבל הביטוי של אנזים metagenomic שנראה חלש יותר מזו של אנזימים רקומביננטי קונבנציונליים; ולכן, תוכננה GESS לזהות תרכובות פנוליות ברגישות המקסימלית על ידי חוקר את השילוב של אתר ריבוזומלי מחייב (RBS) ורצפים terminator יחד עם תפעול אופטימלי בתנאים ^5.

אחד היתרונות הבסיסיים של GESS היא שיטה אחת זה תיאורטי מאפשרת הקרנת ovאה מ -200 סוגים שונים של אנזימים באתר ברנדה (טבלה 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) על ידי העסקת מצעים שונים פשוט. זה היה הראו כי cellulase, lipase, ו hydrolase parathion מתיל (MPH) ניתן לאתר באמצעות PNP-GESS עם מצעים מתאימים של בוטיראט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl-cellotrioside, ו parathion מתיל, בהתאמה ^5. לאחרונה, הוכח כי phosphatase אלקליין (AP), אשר הוא אחד האנזימים רומן שזוהו באמצעות PNP-GESS, הוא AP thermolabile הראשון נמצא metagenomes ימיים קר המותאמות ^6.

הנה, הפרטים של תהליך המיון מוצג עם PNP-GESS גילוי הפעילויות של שלושה סוגים שונים של lipase enzymes-, cellulase, ו phosphatase אלקליין -ואז במהירות בזיהוי אנזימים מועמדים חדשים מספריה metagenomic ^5,6. התהליכים כוללים עיבוד מקדים metagenome עם PNP-GESS ותפעול flow סדרן cytometry. בעוד הלהיטים המתקבלים יהיו צורך הרצף של זיהוי נוסף, פרוטוקול זה מכסה את ההליך עד מדרגות אישור פעילות אנזים באמצעות cytometry זרימה.

Protocol

1. הכנת הספרייה metagenomic עם PNP-GESS

1. לבנות ספריה metagenomic ב E. coli עם וקטור fosmid באמצעות ערכת ייצור הספרייה fosmid פי פרוטוקול של היצרן ^5.
2. Aliquot 100 μl של הספרייה לאחסון ב -70 ° C, אשר מהווה מקור של תאי ספרייה metagenomic.
   הערה: הצפיפות האופטית של מדגם נמדד באורך גל של 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ של מניית ספרייה זה עומדת על כ -100.
3. להפשיר 100 μl של הספרייה metagenomic המניות על הקרח ולחסן בבקבוק 500 מ"ל המכיל 50 מ"ל לוריא- Bertani (LB) ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ואחריו 37 הדגירה מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
4. קציר התאים צינור חרוטי 50 מ"ל על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
5. Resuspend גלולה במהירות 50 מ"ל מים מזוקקים קרים כקרח (DW) ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C שוב.
6. מילuspend גלולה ב 50 DW μl קר כקרח עם 10% (v / v) גליצרול. השתמש 50 μl של aliquot תא זה עבור electroporation.
7. מניחים את התערובת של תאים electrocompetent 50 μl ו pGESS (E135K) DNA ⁵ (100ng) בתוך קובט electroporation קרים כקרח electroporate (1.8 ק ו / ס"מ, 25 μF) את התערובת.
8. להוסיף במהירות 1 מ"ל סופר מרק אופטימלי עם דיכוי catabolite (SOC) בינוני ו resuspend התאים בעדינות.
9. העברת התאים לתוך 14 מ"ל צינור מסביב לתחתית בעזרת פיפטה לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
10. מורחים 500 μl של תאים התאושש על צלחת מרובעת LB 20 x 20 ס"מ המכיל chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל. דגירת צלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
11. גרדו את מושבות באמצעות מגרד תא ולאסוף תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל באמצעות אמצעי אחסון תא קר כקרח.
12. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 °. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל אמצעי אחסון תא קר כקרחלהגיע OD של ₆₀₀ 100.
13. Aliquot 20 μl של תאים לאחסון ב -70 ° C.

2. הסרת תוצאות חיוביות שגויות מספריית metagenomic

1. להפשיר את תאי ספריית metagenomic מניות (משלב 1.13) המכילים fosmid DNA metagenomic ו pGESS (E135K) על קרח.
2. לחסן 10 μl של התאים 2 מ"ל LB המכיל אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​בתוך שפופרת 14 מ"ל מסביב לתחתית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך 4 שעות.
3. בינתיים, מפעיל את מחשב FACS ולפתוח את תוכנת FACS מחדל. השתמש בהגדרות הבאות: קוטר נחיר, 70 מיקרומטר; פינת פיזור קדימה (FSC-A) רגישות, 300 הגברת V-לוגריתמים; פינת פיזור בצד (SSC-A) רגישות, 350 הגברת V-לוגריתמים; והעמסת isothiocyanate שטח (FITC-A) רגישות, 450 הגברת V-לוגריתמים; פרמטר הסף, FSC-ערך 5.
   הערה: גדרות טיפוסיות מובאותעבור מכשיר FACS כפי שמופיע בטבלה של חומרים. התאם את ההגדרות עבור התקני FACS אחרים.
4. לדלל את תאי ספריית metagenomic משלב 2.2 ידי הוספת 5 μl של המדגם לצינור 5 מיליליטר עגול תחתון המכיל 1 מיליליטר PBS.
5. מניח את מדגם הספרייה מדולל על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load על לוח מחווני רכישת תוכנת FACS.
6. התאם את קצב אירוע 1,000 - 1,500 אירועים / sec ידי לחיצה ושליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים.
7. צור יומן מדורג FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור בגיליון גלובלי על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בסרגל הכלים. התאם את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים.
8. מגרש היסטוגרמה עם ספירת תאים לעומת יומן מדורג FITC-A בגיליון העבודה על ידי לחיצה על כפתור היסטוגרמה. לאחר מכן, להתאים את מתח FITC מן Cytomeכרטיסיית גדרות ter על החלון מפקח הבקרה כזה כי שיאו של ב"התפלגות הפעמון הוא פחות מ -10 ^2-A FITC.
9. צור-A FSC מדורג יומן vs. ביומן FITC-העלילה על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגליון העבודה הגלובלי. הגדרת R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים כך שהשער ממוקם בין + 5% ו -5% תאים ממרכז החלוקה (תאי 10% בסך הכילו סביב הפסגה של הפעמון עקום בצורה).
10. מניחים צינור אוסף המכיל 1.2 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ו אמפיצילין chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל במוצא המכשיר FACS ולמיין את 10 ⁶ תאים העונים הן R1 ו- R2 שערים.
11. הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות.

3. הקרנת אנזים metagenomic

1. דגירה תאים ממוינים (משלב 2.11) בשעה 37 ° C עם רועד ב 200 סל"ד עד ₆₀₀ OD מגיע 0.5.
2. הוסף 1 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל"ד.
3. כדי להכין תאים למיון, להוסיף 0.5 מ"ל של תאים בתרבית ו מצע המתאים (אצטט -nitrophenyl p, p -nitrophenyl-β-D-cellobioside, או פוספט פניל) לתוך צינור 14 מ"ל מסביב לתחתית בריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
   1. למדגם שליטה, להוסיף 0.5 מ"ל של תאים בתרבית משלב 3.2 לתוך צינור 14 מ"ל מסביב לתחתית. מוסיפים את נפח זהה של PBS כמו נפח המצע בשלב 3.3.
4. דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך 3 שעות.
5. בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3.
6. הוסף 5 μl של תאים (למיון) ותאי הבקרה שני צינורות 5 מ"ל מסביב לתחתית המכילה 1 מ"ל PBS, בהתאמה.
7. מניחים את הצינור המכיל תאים שליטה על tהוא טוען היציאה של FACS ולחץ על הכפתור Load בלוח המחוונים רכישת התוכנה FACS. כוונון קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec ידי שליטת כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים.
8. יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה הגלובלי של התוכנה ולהתאים את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע על סרגל כלים.
9. יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג FITC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה ולקבוע R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן מצולע השער בסרגל הכלים כך פחות מ -0.1% של תאים שליליים מזוהים בתוך שער R2.
10. החזר את הצינור מלא המדגם עם צינור מדגם המיון, להתאים את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec על ידי שליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים.
11. מניחים צינור איסוף המכיל 0.5מיליליטר LB במוצא מכשיר FACS ולמיין את 10 ⁴ תאי עונים הם שערי R1 ו- R2.
    הערה: קריטריון המיון יכול לנוע בין 0.1% עליונים עד 5% של-A FITC בשער R2. בפרוטוקול זה, תאי 1% עליונים נאספו תוצאות חיוביות.
12. הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות.
13. מורחים את דגימות 0.5 מ"ל שנאספו על שתי צלחות אגר (90 מ"מ צלחות פטרי) המכיל LB, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין, 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​chloramphenicol דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
14. במידת הצורך, לבצע סיבובים נוספים של מיון FITC-A העשרה על ידי חזרה על שלבים 3.1-3.14.

4. Hit בחירת אישור פעילות האנזים

1. Cytometry זרימת הניתוח
   1. מהצלחת וטופחה על שלב 3.14, בחר מושבה מראה שום קרינה באמצעות בורר מושבה תחת התצפית של גל 488 ננומטר של נורת ה- LED.
   2. לחסן את המושבה שנבחר 14 מ"ל roאונד תחתית שפופרת המכילה 2 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין ו -12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד עד OD שלה ₆₀₀ מגיע 0.5.
   3. הוסף 2 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל"ד.
   4. להכין צינור מסביב לתחתית 14 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של תאים בתרבית (שלב 4.1.3). הוסף מצע מתאים (תצטט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl- β -D-cellobioside, או פוספט פניל) בריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
      1. עבור פקד, להוסיף תאים בתרבית 1 מ"ל משלב 4.1.3 לתוך 14 מ"ל צינור מסביב לתחתית ולהוסיף אותו נפח של PBS כמו נפח המצע בשלב 4.1.4.
   5. דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך 3 שעות.
   6. בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3.
   7. הוסף 5 μl של תאים שטופלו מלאה המצע עד 5 מ"ל צינורות מסביב לתחתית המכילה 1 מ"ל PBS, בהתאמה.
   8. מניח את התאים מלאים המכיל צינור על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load בלוח מחווני רכישת תוכנת FACS. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים.
   9. לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC.
   10. החזר את הצינור מדגם שליטה עם הצינור מדגם מטופלים המצע. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים.
   11. לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC.
   12. השווה את הקרינה של שתי הקבוצות של תאים על ידי התוויית היסטוגרמה של ספירת תאים לעומת ביומן מדורג-A FITC.
2. מבחני אחרים כדי לאשר פעילות האנזים
   1. עבור זיהוי נוסף של המועמדים אנזים שנבחרו, לחלץ DNA fosmid באמצעות פרו מיצוי סטנדרטיפרוצדורות מן ערכות ההפקה המסחרית ולנתח את רצף נוקליאוטידים, או לבדוק את פעילות האנזים במבחנה ^6,7.

תוצאות

השלושה המצעים פנוליות נבחנו לזהות אנזימי metagenomic רומן מספריה metagenome של משקעים שטוחים גאות אוקיינוס ​​Taean, דרום קוריאה על ידי ביצוע הפרוטוקול המוצע. לבניית הספרייה, ממוצע 30 - 40 רצפי metagenome kb הוכנסו fosmids, אשר מבוססים על E. coli F replicon גורם והציג כעותק יחי...

Discussion

הגדלת יעילות של biocatalysts ייצור היא מפתח להצלחה-כימי ביו מבוסס תעשיית ⁹ ו metagenome נחשב לאחד מקור האנזים הטבעי הטוב ביותר. במובן זה, זה הכרחי כדי הקרנת אנזימים רומן מן metagenome שבו רוב המשאבים הגנטיים לא נחקר ^10. כמה שיטות הקרנה פותחו ישירות לזהות מוצרי אנזים באמצעות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid library production kit
CopyControl Induction Solution	Epicentre	CCIS125	Fosmid copy induction solution
EPI300	Epicentre	EC300110	Electrocompetent cell
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid vector
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Electroporation cuvette and electroporate system
FACSAria III	Becton Dickinson		Flow Cytometry (FACS machine)
AZ100M	Nikon		Microscope
UltraSlim	Maestrogen		LED illuminator
50-mL conical tube	BD Falcon
14-mL round-bottom tube	BD Falcon
5-mL round-bottom tube	BD Falcon
p-nitrophenyl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
p-nitrophenyl β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p-nitrophenyl butylate	Sigma-Aldrich	N9876	Substrate
Luria- Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L
Super Optimal broth (SOB)	BD Difco	244310	Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L
Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)			SOB, 0.4 % glucose
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)	BD Difco	244020	Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L
Cell storage media			2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose
pGESS(E135K)			A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details.
Chloramphenicol	Sigma	C0378
Ampicillin	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Flow Cytometry Software Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4