Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Özet

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Özet

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library¹. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

Giriş

Son yıllarda geliştirilmiş olan, yüksek verimli tek hücreli deney tekniği yeni bir enzim işlevsel etkinlikler ^1'e göre büyük ölçekli genetik kütüphaneden taranabilir sağlar. tek hücre düzeyinde, transkripsiyon düzenleyici proteinler, bir hedef enzim etkinliğinin bir sonucu olarak üretilen küçük molekülleri algılayarak raportör gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılır. Buna bir yaklaşım, alt-tabaka bir raportör protein ² ekspresyonunu indükler formül (SIGEX) yöntemini tarama alt-tabaka ile indüklenen gen ekspresyonunu kullanarak, Ralstonia eutropha E2 bir fenol-bozucu operonun izole çıkıyor. Pseudomonas putida NhaR benzaldehid dehidrojenazı ³ seçmek için kullanılır, ve Corynebacterium glutamicum LysG çeşitli mutant kütüphaneler ⁴ yeni bir L-Lizin üreten soyun yüksek verimli tarama kullanılmıştır.

Daha önce, bir genetik enzim screening sistemi (GESS) bir genel uygulanabilir bir tarama platformu ⁵ olarak önerilmiştir. Bu sistem P., DmpR fenol-tanıma dimetilfenol regülatör kullanır putida. DmpR (E135K) ve DmpR bir mutant, S. nitrofenolu (PNP) saptanması için gess (PNP-GESS) 'de kullanılabilmektedir. Fenolik bileşikleri üreten hedef enzimlerin varlığında, GESS E. coli hücreleri bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) kullanılarak, tek hücrelerin hızlı izole edebilecek, bir floresan sinyali verir. Ancak metagenomic enzimin ekspresyonu geleneksel rekombinant enzimlerin daha zayıf görünmektedir; Bu nedenle, GESS uygun çalışma durumunda ⁵ ile birlikte ribozomal bağlanma yeri (RBS) ve terminatör dizileri ve kombinasyonunu araştırırken en fazla hassasiyet fenolik bileşikleri tespit etmek için tasarlanmıştır.

Gess temel avantajlarından biri bu tek yöntem teorik olarak ov taranmasını izin vermesidirBRENDA veritabanında enzimlerin er 200'den fazla farklı türleri (Tablo 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) sadece farklı substratlar kullanılarak. O selülaz lipaz gördü ve metil paration hidrolaz (MPH) p-nitrofenil butirat, p-nitrofenil-cellotrioside ve metil paration, sırasıyla, ^5, uygun substratlann PNP-gess kullanılarak tespit edilebilir. Son zamanlarda, bu PnP-gess kullanılarak tanımlanan yeni enzim biri bir alkalin fosfataz (AP), soğuğa uyarlanmış deniz metagenomes ^6'da bulunan ilk termal olarak AP olduğu kanıtlanmıştır.

Burada tarama işleminin detayları PnP-GESS bir metagenomic kütüphane ^5,6 arasında yeni aday enzimleri belirlenmesi hızlı enzimleri, lipaz, selülaz ve alkalin fosfataz, üç farklı türde aktivitelerini tespit -ve sunulmuştur. süreçler metagenome PnP-gess ile önişleme ve bir fl işletim dahilsitometri sıralayıcı ow. Elde edilen isabetleri fazla tanımlama için dizilenmiştir gerekir ise, bu protokol akış sitometrisi kullanılarak enzim aktivitesi onay işlemine prosedürünü kapsamaktadır.

Protokol

1. PnP-gess ile Metagenomic Kütüphane Hazırlama

1. E. bir metagenomic kütüphane inşa E. coli, bir Fosmid vektör ile üreticinin protokolüne ^5'e göre bir Fosmid kitaplığı üretimi kiti kullanılarak.
2. Kısım metagenomic kütüphanesi bir hücre kaynağıdır, -70 ° C'de, önceki depolama için kütüphane 100 ul.
   Not: Bu kütüphane stokunun 600 nm (OD ₆₀₀₎ arasında bir dalga uzunluğunda ölçülen bir numunenin optik yoğunluğu yaklaşık 100'dür.
3. Buz üzerinde hazır metagenomic kütüphane 100 ul çözülme ve 50 ml Luria-Bertani (LB) ve 2 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkalandı ve ardından 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren 500 ml'lik bir şişe içinde inoküle.
4. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile 50 ml konik bir tüp içinde hücreler hasat edilir.
5. Yine, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de 50 ml buz gibi soğuk damıtılmış su (DW) ve santrifüj hızlı pelletini.
6. Res% 10 (h / h) gliserol, 50 ul buz soğukluğunda DW pelet uspend. Elektroporasyon için, bu hücre kısım 50 ul kullanın.
7. Buz soğukluğundaki bir elektroporasyon küvetine ve elektroporasyona (1.8 kV / cm, 25 mF) karışım elektro uyumlu hücre 50 ul pGESS (E135K) ⁵ DNA (100ng) karışımı yerleştirin.
8. Hızla katabolik baskı (SOC) orta süper optimum suyu 1 ml ekleyin ve hafifçe hücreleri tekrar süspansiyon.
9. bir pipet kullanılarak 14 ml yuvarlak tabanlı bir tüpe hücreleri aktarın ve 1 saat 37 ° C'de inkübe edin.
10. 12.5 ug / ml kloramfenikol ve 50 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB 20 x 20 cm kare plaka elde edilen hücreler 500 ul yayıldı. 12 saat boyunca 30 ° C'de inkübe plakası.
11. Bir hücre kazıyıcı kullanarak koloniler kazıyın ve buz gibi soğuk hücre depolama ortamı kullanarak bir 50 ml konik tüp içine hücreleri toplamak.
12. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin. 10 ml buz gibi soğuk hücre depolama ortamı pelletiniBir OD 100 ₆₀₀ ulaşmak için.
13. Kısım -70 ° C'de depolama için hücreler 20 ul.

2. Metagenomic Kitaplığı'ndan Yanlış Pozitif Çıkarma

1. buz üzerinde metagenomic DNA fosmid ve pGESS (E135K) içeren (Kademe 1.13 den) stok metagenomic kütüphane hücreleri çözülme.
2. 14 ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüp içinde 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren 2 ml LB içinde hücre 10 ul inoküle. 4 saat 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
3. Bu arada, FACS makine açmak ve varsayılan FACS yazılımını açın. aşağıdaki ayarları kullanın: meme ucu çapı, 70 um; İleri Yayılım Alanı (FSC-A) duyarlılık, 300 V-logaritmik büyütme; Yan Dağılım Alanı (SSC-A) duyarlılık, 350 V-logaritmik büyütme; Floresein izotiosiyanat Konum (FITC-A) hassasiyeti, 450 V logaritmik amplifikasyonu; eşik parametresi, FSC değeri 5.
   Not: Normal ayarlar verilmiştirMalzemelerin Tablo belirtilen FACS cihaz için. Diğer FACS cihazlar için ayarları yapın.
4. 1 ml PBS ihtiva eden bir 5-ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe örnek 5 ul ekleyerek Aşama 2.2 metagenomic kütüphanesi hücreleri seyreltilir.
5. FACS enstrüman yükleme noktası üzerine seyreltilmiş kütüphane örnek yerleştirin ve FACS yazılım kazanılması Dashboard'daki Yükle düğmesini tıklayın.
6. tıklayıp gösterge paneli üzerinde Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 1,500 olaylar - 1000 olay hızını ayarlayın.
7. Günlük araç çubuğunda Dot Plot butonuna tıklayarak bir küresel çalışma sayfasında SSC-A dağılım arsa ölçekli vs günlüğü oluşturmak FSC-A ölçekli. araç çubuğundaki Poligon Kapısı düğmesini kullanarak tekli olayları (bakteriyel nüfus) kapsayacak şekilde dağılım kapısı R1 ayarlayın.
8. Günlük Histogram butonuna basarak çalışma sayfasındaki FITC-A ölçekli vs hücre sayımı ile bir histogram çizilir. Daha sonra, Cytome FITC gerilimini ayarlamakÇan-şekilli dağıtım pik FITC-A 10 daha az ² olacak şekilde Müfettiş Kontrol penceresinden ter Ayarlar sekmesi.
9. Vs bir günlük ölçekli FSC-A oluşturun. Günlük FITC Küresel bir çalışma sayfasındaki Dot Plot butonuna tıklayarak arsa. kapı çan zirve etrafında dağılımının merkezine (toplam% 10 hücrelerinden +% 5 ve% -5 hücreleri arasında yer alır, böylece araç çubuğunda Poligon Kapısı düğmesini kullanarak arsa üzerinde bir sıralama kapısı R2 Set şeklinde eğri).
10. 1.2 mi LB FACS aletin çıkışında 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren ve R1 ve R2, kapılar hem tatmin sıralamak 10 ⁶ hücre ihtiva eden bir toplama tüpü yerleştirin.
11. toplama tüpü, kap, ve yavaşça vorteks çıkarın.

3. Metagenomic Enzim Eleme

1. ₆₀₀ 0,5 ulaşana OD kadar 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de (Kademe 2.11) kriteri hücreleri inkübe edin.
2. 1 ul hücre içi fosmid kopya sayısını yükseltmek için indüksiyon kopyalama çözümüdür ekleyin. 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de ek bir 3 saat inkübe hücreleri.
3. Nihai konsantrasyonda 14 ml'lik bir yuvarlak tabanlı tüp içine 0.5 kültürlenmiş hücrelerin üzerine ilave edildi ve uygun bir alt tabaka (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosidi ya da fenil fosfat) ekleyin, sıralama için hücrelerin hazırlanması için 100 uM.
   1. Kontrol grubu için, 14 ml'lik yuvarlak dipli bir tüp içine Aşama 3.2 kültürlenmiş hücreler 0.5 ml ekleyin. Adım 3.3 substrat hacmi olarak aynı hacimde PBS ekleyin.
4. 3 saat 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de iki örnek inkübe edin.
5. Bu arada, Adım 2.3 ile aynı konfigürasyona sahip FACS makineyi hazırlamak.
6. sırasıyla 1 ml PBS ihtiva eden iki adet 5 ml'lik yuvarlak tabanlı tüpe (sıralama) hücreleri ve kontrol hücreleri 5 ul ekle.
7. Kontrol hücreleri t üzerine içeren tüp yerleştirinO FACS limanını yükleme ve FACS yazılım kazanılması Dashboard'daki Yükle düğmesini tıklayın. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 3000 olayları - 1000 olay Hızı ayarlayın.
8. Günlük yazılımının küresel çalışma sayfasındaki Dot Plot butonuna tıklayarak ve tekli olayları kapsayacak şekilde (bakteriyel nüfus) dağılım kapısı R1 ayarlamak üzerinde Poligon Kapısı düğmesini kullanarak SSC-A dağılım arsa ölçekli vs oluşturma günlük FSC-A ölçekli araç çubuğu.
9. Günlük araç çubuğunda Poligon Kapısı düğmesini kullanarak arsa üzerinde bir sıralama kapısı R2 çalışma sayfasında Nokta Arsa düğmesini tıklayarak ve set tarafından FITC bir dağılım arsa ölçekli vs oluşturma günlük FSC-A ölçekli böylece daha az% 0.1 negatif hücrelerin R2 kapısı içinde tespit edilir.
10. sıralama örnek tüpü ile kontrol örneği tüpü değiştirin ve 1000 olay hızını ayarlamak - gösterge paneli üzerinde Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 3,000 olaylar.
11. 0.5 içeren bir toplama tüpü yerleştirinml FACS enstrüman çıkışında LB hem R1 ve R2 kapıları tatmin sıralamak 10 ⁴ hücreleri.
    Not: sıralama kriteri R2 kapısı FITC-A'nın üst% 0.1 ile% 5 arasında değişebilir. Bu protokolde, üst% 1 hücreleri pozitif olarak toplanmıştır.
12. toplama tüpü, kap, ve yavaşça vorteks çıkarın.
13. LB, 50 ug / ml ampisilin, 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren agar plakaları, iki (90 mm'lik Petri kaplara) üzerine 0.5 mL toplanan numuneleri yayıldı ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
14. Gerekirse, adımları 3,1-3,14 yineleyerek FITC bir zenginleşme için sıralama ek mermi gerçekleştirin.

4. Hit Seçme ve Enzim Aktivitesi Onay

1. Flow sitometri analizi
   1. Adım 3.14 inkübe plakadan, bir LED aydınlatıcı 488 nm dalga boyundaki gözetiminde bir koloni seçiciyi kullanarak hiçbir floresan gösteren bir koloni seçin.
   2. 14 mi ro seçilen koloni inoküleund altlı 2 mi LB ₆₀₀ 0.5 ulaşana onun OD kadar 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren içeren tüp.
   3. 2 ul hücre içi fosmid kopya sayısını yükseltmek için indüksiyon kopyalama çözümüdür ekleyin. 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de ek bir 3 saat inkübe hücreleri.
   4. 14 ml'lik yuvarlak dipli bir tüp hazırlanır ve kültürlenmiş hücrelerde (Aşama 4.1.3) 1 ml ekleyin. 100 uM'lik bir son konsantrasyonda uygun bir alt tabaka (p-nitrofenil asetat, s -nitrophenyl- β-D-selobiosidi ya da fenil fosfat) ekleyin.
      1. Bir kontrol için, bir 14 ml yuvarlak tabanlı tüp içine Adım 4.1.3 den 1 ml kültür hücreleri ekleyin ve Adım 4.1.4 substrat hacmi olarak aynı hacimde PBS ekleyin.
   5. 3 saat 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de iki örnek inkübe edin.
   6. Bu arada, Adım 2.3 ile aynı konfigürasyona sahip FACS makinesi hazırlamak.
   7. sırasıyla 1 ml PBS ihtiva eden 5 mL'lik yuvarlak dipli bir tüplere kontrolü ve alt-tabaka ile muamele edilmiş hücreler içinde 5 ul ekle.
   8. FACS cihazın yükleme noktası üzerinde tüp içeren kontrol hücrelerini koyun ve FACS yazılım kazanılması Dashboard'daki Yükle düğmesini tıklayın. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kullanarak 3000 olayları / sn - 1000 olay hızını ayarlayın.
   9. FITC-A ölçmek için Edinme butonuna tıklayın.
   10. Alt tabaka tedavi numune tüpü ile kontrol numunesi tüpünü değiştirin. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kullanarak 3000 olayları / sn - 1000 olay hızını ayarlayın.
   11. FITC-A ölçmek için Edinme butonuna tıklayın.
   12. Günlük FITC-A ölçekli vs hücre sayımı bir histogram çizerek hücrelerin iki grup floresan karşılaştırın.
2. Diğer deneyler, enzim etkinliğini doğrulamak için
   1. Seçilen enzim adayların daha tanımlaması için, standart ekstraksiyon pro kullanarak fosmid DNA ayıklamakTicari ekstraksiyon kitleri prosedürleri ve nükleotid sekansı analiz veya in vitro enzim aktivitesi ^6,7 test edin.

Sonuçlar

Üç fenolik yüzeyler önerilen protokol takip ederek Taean'ın, Güney Kore okyanus gelgit düz çökellerin bir metagenome kütüphanesinden yeni metagenomic enzimleri belirlemek için incelenmiştir. Kütüphane yapımı için ortalama 30-40 kb metagenome dizileri E. dayanmaktadır fosmids içine yerleştirildi E. coli K faktörü replikon ve bir hücrenin tek bir kopya olarak sunulmuştur. Fosmids yaygın nedeniyle sabit bir yayılma ⁸ karmaşık gen...

Tartışmalar

Biyokatalizörler üretim verimliliğinin arttırılması en doğal enzim kaynaklarından biri olarak kabul edilir sanayi ⁹ ve metagenome bazlı biyo-kimyasal başarısı için bir anahtardır. Bu anlamda, bu genetik kaynakları çoğunluğu ¹⁰ keşfedilmemiş olan metagenome elde edilen yeni enzimler tarama için gereklidir. Çeşitli tarama yöntemleri doğrudan kopyalama etkinleştiricileri ^{11, 12} kullanılarak enzim ürünlerinin tespit geliştirilmiştir, fakat bu teknikler, belirli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid library production kit
CopyControl Induction Solution	Epicentre	CCIS125	Fosmid copy induction solution
EPI300	Epicentre	EC300110	Electrocompetent cell
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid vector
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Electroporation cuvette and electroporate system
FACSAria III	Becton Dickinson		Flow Cytometry (FACS machine)
AZ100M	Nikon		Microscope
UltraSlim	Maestrogen		LED illuminator
50-mL conical tube	BD Falcon
14-mL round-bottom tube	BD Falcon
5-mL round-bottom tube	BD Falcon
p-nitrophenyl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
p-nitrophenyl β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p-nitrophenyl butylate	Sigma-Aldrich	N9876	Substrate
Luria- Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L
Super Optimal broth (SOB)	BD Difco	244310	Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L
Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)			SOB, 0.4 % glucose
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)	BD Difco	244020	Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L
Cell storage media			2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose
pGESS(E135K)			A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details.
Chloramphenicol	Sigma	C0378
Ampicillin	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Flow Cytometry Software Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4