멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

요약

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

초록

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library¹. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

서문

최근에 개발 된 높은 처리량 단일 세포 분석 기법은 신규 효소는 기능적 활동을 기반으로 ^한 대규모 유전자 라이브러리로부터 스크리닝 될 수있다. 단일 세포 수준에서 전사 조절 단백질을 표적 효소 활성의 결과로 생산되는 작은 분자를 감​​지하여 리포터 유전자의 발현을 유발하기 위해 사용된다. 초기의 방법은 상기 기판은 리포터 ^단백질이 발현을 유도하는 (SIGEX) 메소드를 스크리닝 기판 - 유도 유전자 발현을 사용 Ralstonia eutropha E2로부터 페놀 분해 오페론의 분리를 포함했다. 슈도모나스 푸티 다 (Pseudomonas putida)의 NhaR은 알데하이드 탈수소 효소 ^(3)을 선택하기 위해 사용하고, 코리 네 박테 리움 글루 타미 쿰에서 LysG은 다양한 돌연변이 라이브러리 ^(4)로부터 새로운 L- 라이신 생산 균주의 고 처리량 스크리닝에 이용 하였다.

이전에는 유전 적 효소 screeniNG 시스템 (GESS)는 일반적으로 적용 선별 ​​플랫폼 ^(5)로 제안되었다. 이 시스템의 P., DmpR을 페놀 인식 디메틸 레귤레이터를 사용 푸티 다. DmpR (E135K) 및 DmpR의 돌연변이는 또한 P의 니트로 페놀 (PNP)의 검출 GESS (PNP-GESS)에 사용될 수있다. 페놀 성 화합물의 제조 표적 효소의 존재에 GESS E. 대장균 세포는 형광 활성화 된 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 단일 세포의 신속한 분리를 가능하게하는 형광 신호를 방출한다. 그러나 군 유전체학 효소의 발현은 통상적 인 재조합 효소보다 약한 것으로 보인다; 따라서 GESS 최적의 운전 조건과 함께 ⁵ 리보솜 결합 부위 (RBS) 및 종료 서열의 조합을 조사하여 최대 감도와 페놀 성 화합물을 검출하도록 설계되었다.

GESS의 기본적인 장점 중 하나는이 하나의 방법은 이론적으로 오븐의 심사를 수 있다는 것입니다BRENDA 데이터베이스에있는 효소의 어 200 다양한 유형 (표 1에 http : // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) 단순히 다른 기판을 사용함으로써. 그것은 그 셀룰라 제, 리파제를 도시하고, 메틸 파라티온 가수 분해 효소 (MPH)의 P의 -nitrophenyl 부티레이트, P의 -nitrophenyl-cellotrioside, 메틸 파라티온, 각각 ⁵ 적절한 기질 PNP-GESS을 이용하여 검출 될 수있다. 최근에는 PNP-GESS를 사용하여 식별 소설 효소의 하나 인 알칼리성 포스파타제 (AP)가, 추위 적응 해양 metagenomes ^6에서 발견 된 첫 번째 thermolabile의 AP는 것을 입증했다.

여기서, 검사 공정의 상세 PNP-GESS는 ^5,6- 군 유전체학 라이브러리로부터 새로운 후보 효소를 빠르게 식별 enzymes- 리파아제, 셀룰라아제, 알칼리 포스파타제의 세 가지 유형의 활동을 검출 -and되게된다. 프로세스는 metagenome PNP-GESS로 전처리 및 FL을 운영 포함세포 계측법 분류기를 흐름. 얻은 히트 더 식별 순서가 될 필요가 있지만,이 프로토콜은 유동 세포 계측법 사용하여 효소 활성을 확인하는 단계까지의 절차를 설명합니다.

프로토콜

1. PNP-GESS와 군 유전체학 라이브러리를 준비

1. E.에서 군 유전체학 라이브러리를 구축 대장균은 fosmid 벡터를 제조자의 프로토콜에 따른 ⁵ fosmid 라이브러리 제조 키트를 사용.
2. 분취 군 유전체학 라이브러리 세포의 원천의 -70 ° C에서 저장 라이브러리 100 ㎕.
   주 :이 라이브러리 스톡을 600 nm의 (OD _600)의 파장에서 측정 한 시료의 흡광도는 약 100이다.
3. 얼음 재고 군 유전체학 라이브러리 100 μl를 해동하고 50 ㎖ 루리아 - 베르 타니 (LB)과 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 500 ㎖의 플라스크에 접종.
4. 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 수확.
5. 다시 4 ° C에서 20 분 동안 1,000 XG에 50 ml의 얼음처럼 차가운 증류수 (DW) 및 원심 분리기에 신속하게 펠렛을 재현 탁.
6. 해상도10 % (v / v) 글리세롤 50 μl의 빙냉 DW에서 펠릿 uspend. 전기에 대해이 셀 나누어지는 50 μl를 사용합니다.
7. 얼음처럼 차가운 전기 큐벳과 electroporate (1.8 kV의 / cm, 25 μF) 혼합물에 electrocompetent 세포를 50 μL 및 pGESS (E135K) ⁵ DNA (는 100 ng)의 혼합물을 놓습니다.
8. 신속 catabolite 억압 (SOC) 매체와 슈퍼 최적의 국물 1 ml에 추가하고 부드럽게 세포를 재현 탁.
9. 피펫을 사용하여 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 세포를 전송하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
10. 12.5 ㎍ / ml 클로르 암 페니 콜 및 50 μg의 / ㎖의 앰피 실린을 함유하는 LB 20 × 20cm 사각 접시에 회수 된 세포 500 μl를 확산. 12 시간 동안 30 ° C에서 접시를 품어.
11. 셀 스크레이퍼를 사용하여 콜로니를 긁어 빙냉 셀 저장 매체를 이용하여 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 세포를 수집한다.
12. 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 10 mL의 빙냉 셀 저장 매체 내에 펠렛을 재현 탁OD 100의 _600에 도달합니다.
13. 분취 액을 -70 ℃에서 저장 셀 20 μL.

2. 군 유전체학 라이브러리에서 오판을 제거

1. 얼음에 군 유전체학 DNA의 fosmid 및 pGESS (E135K)를 포함한다 (단계 1.13)에서 주식 군 유전체학 라이브러리 세포를 해동.
2. 14 mL의 둥근 바닥 튜브를 50㎍ / ㎖의 앰피 실린과 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 2 ml의 LB 내의 셀의 10 μl를 접종한다. 4 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 인큐베이션.
3. 한편, FACS 기계를 켜고 기본 FACS 소프트웨어를 엽니 다. 다음 설정을 사용하여 노즐 팁 직경 70 μm의; 순방향 분산 영역 (FSC-A)의 감도, 300 V 대수 증폭; 사이드 분산 영역 (SSC-A) 감도 350 V 대수 증폭; 형광 염료 영역 (FITC-A) 감도 450 V 대수 증폭; 임계 값 매개 변수, FSC-A 값 5.
   참고 : 일반 설정이 제공됩니다재료의 표에 언급 FACS 장치. 다른 FACS 장치에 대한 설정을 조정합니다.
4. 1 ㎖의 PBS를 함유하는 5 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 시료 5 μl를 첨가하여 단​​계 2.2에서 군 유전체학 라이브러리 세포를 희석.
5. FACS 악기의로드 포트에 희석 된 라이브러리 샘플을 놓고 FACS 소프트웨어의 취득 대시 보드에로드 버튼을 클릭합니다.
6. 클릭하고 대시 보드의 유량 버튼을 제어하여 / 초 1500 이벤트 - 1,000 이벤트 속도를 조정합니다.
7. 로그 도구 모음에서 도트 플롯 버튼을 클릭하여 글로벌 워크 시트에 SSC-A 산점도를 확장 대 로그를 만들기 FSC-A를 조정. 도구 모음에서 다각형 게이트 버튼을 사용하여 단일 이벤트 (세균 집단)를 포함하는 분산 형 게이트 R1을 조정합니다.
8. 로그 히스토그램 버튼을 클릭하여 워크 시트에 FITC-A를 확장 대 세포 수와 히스토그램 플롯. 그리고, Cytome에서 FITC 전압을 조정종 모양의 분포의 피크가 FITC-A의 ^{10이되도록} 검사기 컨트롤 창에 터 설정 탭을 클릭합니다.
9. 대 로그 스케일 FSC-A를 만듭니다. 로그 FITC-A 글로벌 워크 시트의 도트 플롯 버튼을 클릭하여 플롯. 게이트가 bell-의 피크 주위에 분포의 중심 (총 10 %의 세포에서 + 5 % -5 % 세포 사이에 위치되도록 도구 모음에서 다각형 게이트 버튼을 사용하여 플롯에 정렬 게이트 R2를 설정 모양의 곡선).
10. 1.2 ml의 LB는 FACS 악기의 출구에 50 μg의 / ㎖ 암피실린 및 12.5 μg의 / ㎖ 클로람페니콜을 포함하고 R1과 R2 게이트 모두를 만족 밖으로 정렬 10 ⁶ 세포를 포함한 컬렉션 튜브를 놓습니다.
11. 포집 관, 모자​​, 부드럽게 소용돌이를 제거합니다.

3. 군 유전체학 효소 검사

1. _(600)이 0.5에 도달 OD 때까지 200 rpm으로 진탕 37 ° C에서 (단계 2.11)에서 정렬 된 세포를 품어.
2. 1 μL가 세포 내 fosmid 사본 번호를 증폭 유도 솔루션을 복사 추가합니다. 250 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 추가 3 시간 동안 세포를 인큐베이션.
3. 최종 농도 14 mL의 둥근 바닥 튜브에 0.5 배양 세포 ㎖의 적절한 기판 (p의 -nitrophenyl 아세테이트, P의 -nitrophenyl-β-D-cellobioside 또는 페닐 포스페이트)를 추가, 정렬 셀을 제조 100 μM의.
   1. 제어 샘플의 경우, 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 단계 3.2에서 배양 된 세포 0.5 ㎖에 추가 할 수 있습니다. 단계 3.3에 기재 볼륨으로 PBS 동량을 추가한다.
4. 3 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 두 샘플을 인큐베이션.
5. 한편, 단계 2.3과 동일한 구성으로 FACS 기계를 준비​​합니다.
6. 각각 1 ml의 PBS를 포함하는 두 개의 5 ml의 둥근 바닥 튜브에 (정렬) 세포 및 제어 세포의 5 μl를 추가합니다.
7. 대조군 세포 t 상에 포함 된 튜브를 배치그는 FACS의 포트를로드하고 FACS 소프트웨어의 취득 대시 보드에로드 버튼을 클릭합니다. 대시 보드에 유량 버튼을 제어하여 / 초 3000 이벤트 - 1,000 이벤트 비율을 조정합니다.
8. 로그 소프트웨어의 글로벌 워크 시트에 도트 플롯 버튼을 클릭하고 단일 이벤트를 포함하는 (세균 집단)를 캐터 게이트 R1을 조정에 다각형 게이트 단추를 사용하여 SSC-A 산점도를 확장 대 만들기 로그 FSC-A를 조정 도구 모음.
9. 로그 도구 모음에서 다각형 게이트 버튼을 사용하여 플롯에 정렬 게이트 R2를 워크 시트에 도트 플롯 버튼을 클릭하고 설정하여 FITC-A 산점도를 확장 대 만들기 로그 FSC-A를 확장되도록의 0.1 % 음성 세포는 R2 게이트 내에서 검출된다.
10. 정렬 샘플 튜브와 제어 샘플 튜브를 교체하고 1000 이벤트 속도를 조정 - 대시 보드의 유량 버튼을 제어하여 / 초 3000 이벤트.
11. 0.5을 포함하는 포집 관을 배치mL 씩을 FACS기구의 출구와 LB 모두 R1 및 R2 게이트 만족 정렬 밖으로 ¹⁰⁴ 세포.
    참고 : 정렬 기준은 R2 게이트에 FITC-A의에서 최고 0.1 %로 5 % 범위 일 수있다. 이 프로토콜에서, 상위 1 %의 세포가 양성으로 수집 하였다.
12. 포집 관, 모자​​, 부드럽게 소용돌이를 제거합니다.
13. LB, 50 μg의 / ㎖ 암피실린, 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 포함하는 두 한천 플레이트 (90mm 배양 접시)에 0.5 ml의에게 수집 된 샘플을 확산하고 밤새 37 ° C에서 접시를 품어.
14. 필요한 경우, 단계 3.1-3.14를 반복하여 FITC-A 농축에 대한 정렬의 추가 라운드를 수행합니다.

4. 히트 선택 및 효소 활동 확인

1. 분석 유동 세포 계측법
   1. 단계 3.14에서 배양 접시에서하는 LED 조명의 488 nm 파장의 관찰 아래 식민지 선택기를 사용하여 형광을 보여주는 식민지를 선택합니다.
   2. 14 ml의 소유주에 선택한 식민지 접종싶게 바닥이 ml의 LB _(600)가 0.5에 도달 할 때까지의 OD 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 50 μg의 / ㎖의 암피실린 및 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 함유하는 튜브.
   3. 2 μL가 세포 내 fosmid 사본 번호를 증폭 유도 솔루션을 복사 추가합니다. 250 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 추가 3 시간 동안 세포를 인큐베이션.
   4. 14 ㎖의 둥근 바닥 튜브를 준비하고 배양 된 세포 (단계 4.1.3) 1 ㎖를 추가합니다. 100 μM의 최종 농도로 적당한 기판 (p의 -nitrophenyl 아세테이트, P -nitrophenyl- β-D- cellobioside 또는 페닐 포스페이트)를 추가한다.
      1. 제어를 들어, 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 단계 4.1.3에서 1 ml의를 배양 된 세포를 추가하고 단계 4.1.4에서 기판 볼륨으로 PBS의 동일한 볼륨을 추가합니다.
   5. 3 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 두 샘플을 인큐베이션.
   6. 한편, 단계 2.3과 동일한 구성으로 FACS 기계를 준비.
   7. 각각 1 ml의 PBS를 포함하는 5 ㎖의 둥근 바닥 튜브 제어 및 기판 처리 된 세포의 5 μl를 추가합니다.
   8. FACS 장치의로드 포트에 튜브를 포함하는 제어 세포를 놓고 FACS 소프트웨어의 취득 대시 보드에로드 버튼을 클릭합니다. 대시 보드에 유량 버튼을 사용하여 3000 이벤트 / 초 - 1000 이벤트 속도를 조정합니다.
   9. FITC-A를 측정하기 위해 취득 버튼을 클릭합니다.
   10. 기판 처리 샘플 튜브와 제어 샘플 튜브를 교체합니다. 대시 보드에 유량 버튼을 사용하여 3000 이벤트 / 초 - 1000 이벤트 속도를 조정합니다.
   11. FITC-A를 측정하기 위해 취득 버튼을 클릭합니다.
   12. 로그 FITC-A 스케일링 대 세포 수의 히스토그램을 플로팅함으로써 세포의 두 그룹의 형광을 비교한다.
2. 다른 분석은 효소 활성을 확인
   1. 선택한 효소 후보의 추가 식별을 위해, 표준 추출 프로를 사용하여 fosmid DNA를 추출상용 추출 키트에서 cedures하고 염기 서열을 분석하거나, 시험 관내 효소 ^활성을 테스트 ^-6,7-.

결과

세 페놀 기판은 제안 된 프로토콜에 따라 태안, 한국의 바다 - 갯벌 퇴적물의 metagenome 라이브러리에서 새로운 군 유전체학 효소를 식별하기 위해 조사 하였다. 라이브러리 건설, 평균 30~40킬로바이트의 metagenome 시퀀스는 E. 기반으로 fosmids에 삽입했다 대장균 F 인자 플리와 셀의 단일 사본으로 제시했다. fosmids 널리 인해 안정적인 전파 ⁸ 복잡한 게놈 라...

토론

생체 촉매의 생산 효율을 증가시키는 것은 가장 좋은 천연 효소 소스로 간주됩니다 산업 ⁹ metagenome 기반 바이오 화학의 성공을위한 열쇠입니다. 이러한 의미에서, 그것은 유전자 원의 대부분이 ¹⁰ 탐험되지 않은 metagenome에서 새로운 효소를 선별하는 것이 필수적입니다. 몇몇 선별 방법은 직접 전사 활성화 제 ^{11, 12를} 사용하여 효소 제품을 검출하는 개발되어 있지만, 이들 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid library production kit
CopyControl Induction Solution	Epicentre	CCIS125	Fosmid copy induction solution
EPI300	Epicentre	EC300110	Electrocompetent cell
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid vector
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Electroporation cuvette and electroporate system
FACSAria III	Becton Dickinson		Flow Cytometry (FACS machine)
AZ100M	Nikon		Microscope
UltraSlim	Maestrogen		LED illuminator
50-mL conical tube	BD Falcon
14-mL round-bottom tube	BD Falcon
5-mL round-bottom tube	BD Falcon
p-nitrophenyl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
p-nitrophenyl β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p-nitrophenyl butylate	Sigma-Aldrich	N9876	Substrate
Luria- Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L
Super Optimal broth (SOB)	BD Difco	244310	Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L
Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)			SOB, 0.4 % glucose
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)	BD Difco	244020	Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L
Cell storage media			2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose
pGESS(E135K)			A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details.
Chloramphenicol	Sigma	C0378
Ampicillin	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Flow Cytometry Software Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4