Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System

Резюме

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Аннотация

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library¹. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

Введение

Недавно был разработан с высокой пропускной способностью методикой определения одноклеточного позволяет новые ферменты , которые будут экранированы от крупномасштабной генетической библиотеки на основе их функциональной активности ^1. На одном уровне клетки, белки, регулирующие транскрипцию используются, чтобы вызвать экспрессию гена-репортера путем обнаружения малых молекул, которые образуются в результате активности целевого фермента. Одним из первых подход предусматривал выделение фенола деградирующих оперона из Ralstonia eutropha Е2 с использованием субстрата индуцированной генетической экспрессии скрининг метод (SIGEX), в котором подложка индуцирует экспрессию белка - репортера ^2. NhaR из Pseudomonas putida был использован для выбора бензальдегида дегидрогеназы ³ и LysG из Corynebacterium glutamicum был использован для высокопроизводительного скрининга нового L-лизин штамма из различных мутантных библиотек ^4.

Ранее генетический фермент screeniСистема нг (GESS) была предложена в качестве общего применения скрининга платформы ^5. Эта система использует регулятор ДИМЕТИЛФЕНОЛА фенол-распознающих, DmpR, Р. putida. DmpR (E135K), и мутант DmpR, также могут быть использованы в GESS (PnP-GESS) для обнаружения р -nitrophenol (PnP). В присутствии ферментов - мишеней , продуцирующих фенольные соединения, ГЕСС в E. палочка клетки испускает флуоресцентный сигнал, что позволяет быстрое выделение отдельных клеток с помощью флуоресцентного активированного сортировщика клеток (FACS). Но экспрессия метагеномной фермента, как представляется, слабее, чем у обычных рекомбинантных ферментов; Таким образом, GESS был разработан для обнаружения фенольных соединений с максимальной чувствительностью, исследуя сочетание сайта связывания рибосом (RBS) и терминатор последовательностей наряду с оптимального рабочего состояния ^5.

Одним из основных преимуществ GESS является то, что это единственный метод теоретически позволяет скрининг OVэр чем 200 различных типов ферментов , в базе данных Бренда (таблица 1, HTTP: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) путем простого использования различных субстратов. Было показано , что целлюлазы, липазы и метилпаратиону гидролазы (MPH) можно обнаружить с помощью ПНП-Гесс с соответствующими субстратами р нитрофенил бутирата, р - нитрофенил-cellotrioside и метилпаратиона, соответственно ^5. Недавно было доказано , что щелочной фосфатазы (АР), которая является одним из новых ферментов , идентифицированных с использованием ПНП-Гесс, является первым термолабильных А.П. найден в холодоадаптированных морских метагеномов ^6.

Здесь, подробная информация о процессе скрининга представлен с PnP-GESS обнаружения деятельности трех различных типов enzymes- липазы, целлюлазы и щелочной фосфатазы -И быстрого выявления новых кандидатов ферментов из метагеномной библиотеки ^5,6. Процессы включают метагенома предварительную обработку с ПНП-GESS и эксплуатации флвл цитометрии сортировщика. В то время как полученные удары должны быть секвенированы для дальнейшей идентификации, этот протокол охватывает процедуру до шаги ферментативного подтверждения активности с использованием проточной цитометрии.

протокол

1. Подготовка библиотеки метагеномной с ПНП-GESS

1. Построить метагеномной библиотеку в E. палочка с fosmid вектором с использованием набора fosmid производства библиотеки в соответствии с протоколом производителя ^5.
2. Аликвоты по 100 мкл библиотеки для хранения при -70 ° C, что является источником метагеномных библиотеки клеток.
   Примечание: Оптическая плотность образца , измеренной при длине волны 600 нм (OD ₆₀₀₎ этого фонда библиотеки составляет около 100.
3. Разморозить 100 мкл основного метагеномной библиотеки на льду и инокуляции в 500 мл колбу, содержащую 50 мл Лурия-Бертани (LB) и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола, за которой следует 37 ° C инкубации в течение 2 ч.
4. Сбора клеток в 50 мл коническую пробирку центрифугированием при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
5. Ресуспендируют осадок быстро в 50 мл охлажденного льдом дистиллированной воды (DW) и центрифуге при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С снова.
6. Resuspend осадок в 50 мкл охлажденного льдом DW с добавлением 10% (об / об) глицерина. Используйте 50 мкл этой клеточной аликвоты для электропорации.
7. Поместите смесь электрокомпетентных клеток 50 мкл и pGESS (E135K) ⁵ ДНК (100 нг) в охлажденный льдом кювету для электропорации и электропорации (1,8 кВ / см, 25 мкФ) смеси.
8. Быстро добавить 1 мл супер оптимальной бульон с катаболитной репрессии (SOC) среды и ресуспендирования клеток мягко.
9. Передача клеток в 14 мл с круглым дном трубки с помощью пипетки и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
10. Спред 500 мкл выделенных клеток на LB 20 х 20 см квадратной пластины, содержащей 12,5 мкг / мл хлорамфеникола и 50 мкг / мл ампициллина. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 12 часов.
11. Скрип колонии с помощью мобильного скребок и собирают клетки в 50 мл коническую трубку с помощью ледяной носитель клеток.
12. Центрифуга при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют осадок в 10 мл охлажденного льдом носителей клетокдостичь OD ₆₀₀ из 100.
13. Аликвоты по 20 мкл клеток для хранения при -70 ° C.

2. Удаление ложных срабатываний из библиотеки метагеномной

1. Растаяйте запаса метагеномных библиотеки клеток (из стадии 1.13), содержащих метагеномной fosmid ДНК и pGESS (E135K) на льду.
2. Инокулируйте 10 мкл клеток в 2 мл LB, содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола в 14-мл с круглым дном трубки. Инкубируют при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 4 часов.
3. В то же время, включите машину FACS и откройте программное обеспечение FACS по умолчанию. Используйте следующие параметры: диаметр кончика насадки, 70 мкм; Форвард Scatter Area (FSC-A) чувствительность, 300 V-логарифмическое усиление; Боковой Scatter Площадь (SSC-A) чувствительность, 350 V-логарифмическое усиление; Флуоресцеинизотиоцианатом Площадь (FITC-A) чувствительность, 450 V-логарифмическое усиление; пороговый параметр, FSC-значение 5.
   Примечание: Типовые настройки приведеныдля FACS устройства , указанного в таблице материалов. Настройка параметров для других устройств FACS.
4. Развести метагеномных библиотеки клеток из шага 2.2 добавлением 5 мкл образца к 5-мл с круглым дном пробирку, содержащую 1 мл PBS.
5. Поместите разбавленный образец библиотеки на порт погрузки прибора FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS.
6. Установите частоту событий на 1000 - 1500 событий / сек, нажав и управления кнопки Flow Rate на приборной панели.
7. Создать журнал масштабируется FSC-A против журнала масштабируется SSC-график рассеяния на глобальном листе, нажав на кнопку Dot участок в панели инструментов. Отрегулируйте Разброс R1 затвора, чтобы охватить Синглетное события (бактериальная популяция) с помощью кнопки Полигон Gate в панели инструментов.
8. Участок гистограмма с количеством клеток по сравнению с журнала масштабируется FITC-A на листе, нажав на кнопку Гистограмма. Затем отрегулируйте напряжение FITC от CytomeВкладка Параметры тер на окне инспектора управления таким образом, что пик распределения в форме колокола составляет менее 10 ² ФИТЦ-A.
9. Создание журнала масштабируется FSC-A против. журнал FITC-Участок, нажав на кнопку Dot участка на мировом листе. Установить сортировочный R2 затвора на участке с помощью кнопки Полигон Gate на панели инструментов, так что ворота расположены между + 5% и -5% клеток от центра распределения (всего 10% клеток вокруг пика BELL- образной кривой).
10. Поместите пробирку , содержащую 1,2 мл LB , содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола на выходе из прибора FACS и отсортировывать 10 ⁶ клеток , удовлетворяющие оба R1 и R2 ворота.
11. Снимите трубку сбора, колпачок и осторожно завихрения.

3. метагеномной Фермент Скрининг

1. Инкубируйте отсортированных клеток (со стадии 2.11) при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту до OD ₆₀₀ достигает 0,5.
2. Добавить 1 мкл раствора скопировать индукции для усиления внутриклеточного fosmid числа копий. Инкубируйте клетки еще в течение 3 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
3. Для подготовки клеток для сортировки, добавьте 0,5 мл культивируемых клеток и соответствующего субстрата (п - нитрофенил ацетат, р - нитрофенил-β-D-целлобиозида, или фенил , фосфат) в 14-мл с круглым дном трубки в конечной концентрации 100 мкМ.
   1. Для получения контрольной пробы, добавляют 0,5 мл культивируемых клеток из шага 3.2 в 14-мл с круглым дном трубки. Добавьте тот же объем PBS в объеме субстрата в стадии 3.3.
4. Выдержите двух образцов при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 3 часов.
5. В то же время, подготовить машину FACS с теми же конфигурациями, как на стадии 2.3.
6. Добавьте 5 мкл клеток (для сортировки) и контрольных клеток на две 5 мл круглодонную пробирки, содержащие 1 мл PBS, соответственно.
7. Поместите пробирку, содержащую контрольные клетки на Тон порт погрузки из FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS. Регулировка частоты событий 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопки управления Flow Rate на приборной панели.
8. Создание журнала масштабируется FSC-A против журнала масштабируется SSC-точечный график, нажав на кнопку Dot участка на мировом листе программного обеспечения и регулировки разброса R1 затвора , чтобы охватить Синглетное события (бактериальное население) с помощью кнопки Полигон Gate на панель инструментов.
9. Создание журнала масштабируется FSC-A vs. журнал масштабируется FITC-точечный график, нажав на кнопку Dot участка на листе и установить сортировочный R2 затвора на участке с помощью кнопки Полигон Gate на панели инструментов , так что менее 0,1% от негативные клетки обнаруживаются в ворота R2.
10. Заменить контрольный образец трубки с сортировочной пробирки с образцом, и регулировать скорость событий 1000 - 3000 событий / сек, управляя кнопками Flow Rate на приборной панели.
11. Поместите пробирку, содержащую 0,5мл LB на выходе из прибора FACS и разобравшись 10 ⁴ клеток , удовлетворяющие обе ворота R1 и R2.
    Примечание: критерий сортировки может находиться в диапазоне от верхнего от 0,1% до 5% от FITC-А в воротах R2. В этом протоколе, топ 1% клеток были собраны в качестве позитивов.
12. Снимите трубку сбора, колпачок и осторожно завихрения.
13. Намажьте емкостью 0,5 мл собранных образцов на двух чашках с агаром (90 мм чашках Петри), содержащих LB, 50 мкг / мл ампициллина, 12,5 мкг / мл хлорамфеникола, и инкубируйте при 37 ° С в течение ночи.
14. При необходимости выполнить дополнительные раунды сортировки для FITC-A обогащения, повторив шаги 3.1-3.14.

4. Хит Выбор и активность энзимов Подтверждение

1. Анализ проточной цитометрией
   1. Из инкубированных пластины на шаге 3.14, выберите колонию, не оказывающем флуоресценции с использованием сборщика колонии под наблюдением 488 нм длины волны светодиодной подсветки.
   2. Привить выбранную колонию в 14 мл роунд дном пробирку , содержащую 2 мл LB , содержащей 50 мкг / мл ампициллина и 12,5 мкг / мл хлорамфеникола , при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту , пока его OD ₆₀₀ достигает 0,5.
   3. Добавьте 2 мкл раствора скопировать индукции для усиления внутриклеточного fosmid числа копий. Инкубируйте клетки еще в течение 3 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
   4. Приготовьте 14 мл с круглым дном трубки и добавляют 1 мл культивируемых клеток (шаг 4.1.3). Добавьте соответствующий субстрат (р - нитрофенил ацетат, р -nitrophenyl- & beta ; -D-целлобиозида или фенил , фосфата) в конечной концентрации 100 мкМ.
      1. Для контроля, добавьте по 1 мл культивируемых клеток с шага 4.1.3 в 14 мл с круглым дном, добавить необходимые тот же объем PBS в объеме субстрата в стадии 4.1.4.
   5. Выдержите двух образцов при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 3 часов.
   6. В то же время, подготовить машину FACS с теми же конфигурациями, как на стадии 2.3,
   7. Добавьте 5 мкл контрольного и субстрата клеток, обработанных по 5 мл круглым дном пробирки, содержащие 1 мл PBS, соответственно.
   8. Поместите пробирку, содержащую контрольные клетки на погрузочной порту устройства FACS и нажмите на кнопку Загрузить на панели управления Приобретение программного обеспечения FACS. Установите частоту событий на 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопок Flow Rate на приборной панели.
   9. Нажмите на кнопку Acquisition для измерения FITC-A.
   10. Заменить пробирку управления с подложкой обработанной пробы трубки. Установите частоту событий на 1000 - 3000 событий / сек с помощью кнопок Flow Rate на приборной панели.
   11. Нажмите на кнопку Acquisition для измерения FITC-A.
   12. Сравните флуоресценции двух групп клеток путем построения гистограммы числа клеток по сравнению с лог масштабируется FITC-A.
2. Другие анализы, чтобы подтвердить активность фермента
   1. Для дальнейшей идентификации отобранных кандидатов ферментов, экстракт fosmid ДНК с использованием стандартной про экстракциицедуры из коммерческих наборов экстракции и анализа нуклеотидной последовательности, или проверить активность фермента ^6,7 в пробирке.

Результаты

Три фенольные субстраты были рассмотрены с целью идентификации новых метагеномных ферменты из метагенома в библиотеке океанских приливов и отливов плоских осадков в Тэанской, Южная Корея, следуя предлагаемого протокола. Для строительства библиотеки, в среднем 30 - ме...

Обсуждение

Повышение эффективности производства биокатализаторов является ключевым для успеха био-химической промышленности , основанной ⁹ и метагенома считается одним из лучших естественных источника фермента. В этом смысле важно скрининга новых ферментов из метагенома , где большинств...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid library production kit
CopyControl Induction Solution	Epicentre	CCIS125	Fosmid copy induction solution
EPI300	Epicentre	EC300110	Electrocompetent cell
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid vector
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Electroporation cuvette and electroporate system
FACSAria III	Becton Dickinson		Flow Cytometry (FACS machine)
AZ100M	Nikon		Microscope
UltraSlim	Maestrogen		LED illuminator
50-mL conical tube	BD Falcon
14-mL round-bottom tube	BD Falcon
5-mL round-bottom tube	BD Falcon
p-nitrophenyl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
p-nitrophenyl β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p-nitrophenyl butylate	Sigma-Aldrich	N9876	Substrate
Luria- Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L
Super Optimal broth (SOB)	BD Difco	244310	Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L
Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)			SOB, 0.4 % glucose
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)	BD Difco	244020	Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L
Cell storage media			2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose
pGESS(E135K)			A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details.
Chloramphenicol	Sigma	C0378
Ampicillin	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Flow Cytometry Software Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4