Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

Resumen

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Resumen

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library¹. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

Introducción

Un alto rendimiento de técnica de ensayo de una sola célula recientemente desarrollado permite nuevas enzimas que se proyectarán partir de una biblioteca genética a gran escala en base a sus actividades funcionales ^1. En el nivel de células individuales, se emplean las proteínas que regulan la transcripción para activar la expresión de genes reportero mediante la detección de moléculas pequeñas que se producen como resultado de una actividad de la enzima objetivo. Un enfoque temprano implicado el aislamiento de un operón de fenol-degradante de Ralstonia eutropha E2 utilizando la expresión genética sustrato inducida método (SIGEX), en el que el sustrato induce la expresión de una proteína indicadora ² de cribado. Nhar de Pseudomonas putida se utilizó para seleccionar benzaldehído deshidrogenasa ^3, y LysG de Corynebacterium glutamicum se utilizó para el cribado de alto rendimiento de una nueva cepa L-lisina productoras de diversas bibliotecas mutantes ^4.

Anteriormente, una enzima genética screeniSe propuso sistema ng (GESS) como una plataforma de cribado de aplicación general ^5. Este sistema utiliza el regulador dimetilfenol fenol-reconocer, DMPR, de P. putida. DMPR (E135K), y un mutante de DMPR, también se pueden emplear en GESS (PNP-GESS) para la detección de nitrofenol p (PNP). En presencia de enzimas objetivo la producción de compuestos fenólicos, GESS en E. células de E. coli emite una señal de fluorescencia, lo que permite el aislamiento rápido de células individuales utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). Sin embargo, la expresión de la enzima metagenomic parece ser más débil que la de las enzimas recombinantes convencionales; Por lo tanto, GESS fue diseñado para detectar compuestos fenólicos con la máxima sensibilidad mediante la investigación de la combinación de sitio de unión ribosomal (RBS) y las secuencias de terminación junto con condiciones de funcionamiento óptimas ^5.

Una de las ventajas fundamentales de GESS es que este único método permite, teóricamente, la proyección de over de 200 tipos diferentes de enzimas en la base de datos BRENDA (Tabla 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) simplemente empleando diferentes sustratos. Se demostró que la celulasa, lipasa, y hidrolasa metil paratión (MPH) se puede detectar usando PNP-GESS con sustratos apropiados de p-nitrofenil butirato, p-nitrofenil-cellotrioside, y metil paratión, respectivamente ^5. Recientemente, se demostró que una fosfatasa alcalina (AP), que es una de las nuevas enzimas identificadas usando PNP-GESS, es la primera AP termolábil que se encuentra en metagenomes marinos adaptados al frío ^6.

Aquí, los detalles del proceso de selección se presenta con PNP-GESS detectar las actividades de tres diferentes tipos de lipasa enzymes-, celulasa, y fosfatasa alcalina -y la identificación de nuevas enzimas candidatos a partir de una biblioteca metagenómica ^5,6 rápidamente. Los procesos incluyen metagenoma procesamiento previo con PNP-GESS y operar un flclasificador de flujo citometría. Mientras que los éxitos obtenidos tendrán que ser secuenciado para su posterior identificación, este protocolo cubre el procedimiento hasta los pasos de confirmación de la actividad enzimática mediante citometría de flujo.

Protocolo

1. Preparación de la biblioteca metagenómica con PNP-GESS

1. Construir una biblioteca metagenómica en E. coli con un vector fosmid utilizando un kit de producción biblioteca fosmid de acuerdo con el protocolo del fabricante ^5.
2. Alícuota de 100 l de la biblioteca para almacenamiento a -70 ° C, que es una fuente de células de la biblioteca metagenomic.
   Nota: La densidad óptica de una muestra medida a una longitud de onda de 600 nm (OD ₆₀₀₎ de esta biblioteca de valores es aproximadamente 100.
3. Descongelar 100 l de la biblioteca de la metagenomic en hielo y inocular en un matraz de 500 ml que contiene 50 ml de Luria-Bertani (LB) y 12,5 g de cloranfenicol / ml, seguido de 37 ° C de la incubación durante 2 hr.
4. Recoger las células en un tubo cónico de 50 ml mediante centrifugación a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C.
5. Resuspender el precipitado rápidamente en 50 ml de agua helada-fría destilada (DW) y se centrifuga a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C de nuevo.
6. Resuspend el precipitado en 50 l DW enfriado en hielo con 10% (v / v) de glicerol. Utilice 50 l de esta alícuota de células para la electroporación.
7. Colocar la mezcla de células electrocompetentes 50 l y pGESS (E135K) ⁵ de ADN (100 ng) en una cubeta de electroporación enfriada con hielo y electroporar (1,8 kV / cm, 25 mF) la mezcla.
8. Rápidamente añadir 1 ml de caldo súper óptima con la represión de catabolitos (SOC) a medio y volver a suspender las células suavemente.
9. Transferencia de las células en el tubo de 14 ml de fondo redondo con una pipeta y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
10. Extender 500 l de las células recuperadas en un LB 20 x 20 cm placa cuadrada que contiene 12,5 mg / ml de cloranfenicol y 50 mg / ml de ampicilina. Incubar la placa a 30 ° C durante 12 horas.
11. Raspar las colonias utilizando un rascador de células y recoger las células en un tubo cónico de 50 ml usando medios de almacenamiento de células enfriado con hielo.
12. Centrifugar a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en 10 ml de medio de almacenamiento de células heladaspara llegar a un OD ₆₀₀ de 100.
13. Alícuota de 20 l de las células para su almacenamiento a -70 ° C.

2. Eliminación de falsos positivos de la biblioteca metagenómica

1. Descongelar las células de valores metagenomic biblioteca (del paso 1.13) que contienen ADN fosmid metagenómica y pGESS (E135K) en hielo.
2. Inocular 10 l de las células en 2 ml de LB que contienen 50 mg / ml de ampicilina y 12,5 mg / ml de cloranfenicol en un tubo de fondo redondo de 14 ml. Incubar a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 4 hr.
3. Mientras tanto, encender la máquina de FACS y se abra el software FACS predeterminado. Utilice los siguientes parámetros: diámetro de la punta de la boquilla, 70 micras; Área dispersión hacia adelante (FSC-A) la sensibilidad, la amplificación de 300 V-logarítmica; Área de dispersión lateral (SSC-A) la sensibilidad, la amplificación de 350 V-logarítmica; Isotiocianato de fluoresceína en la zona (A-FITC) de sensibilidad, 450 de amplificación V-logarítmica; parámetro de umbral, FSC-Un valor 5.
   Nota: se dan configuraciones típicaspara el dispositivo FACS mencionado en la Tabla de Materiales. Ajustar la configuración de otros dispositivos de FACS.
4. Diluir las células de la biblioteca de metagenomic Paso 2.2 mediante la adición de 5 l de la muestra a un tubo de fondo redondo de 5 ml que contiene 1 ml de PBS.
5. Coloque la muestra biblioteca diluida sobre el puerto de carga del instrumento FACS y hacer clic en el botón Cargar en el tablero de instrumentos de adquisición del software FACS.
6. Ajustar la tasa de eventos a 1.000 - 1.500 eventos / seg haciendo clic en los botones y el control de Velocidad de flujo en el salpicadero.
7. Crear registro escalado FSC-A vs log escala SSC-Un gráfico de dispersión en una hoja de trabajo mundial haciendo clic en el botón gráfico de puntos en la barra de herramientas. Ajuste la puerta de dispersión R1 para abarcar los acontecimientos singlete (población bacteriana) utilizando el botón de la puerta del polígono en la barra de herramientas.
8. Trazar un histograma con el recuento de células frente a log escala FITC-A en la hoja de cálculo haciendo clic en el botón Histograma. A continuación, ajuste la tensión del FITC Cytomepestaña Configuración ter en la ventana Control de Inspector de tal manera que el pico de la distribución en forma de campana es inferior al 10 ² de FITC-A.
9. Crear un registro de escalado FSC-A vs. el registro de FITC-Un gráfico haciendo clic en el botón gráfico de puntos en la hoja de trabajo global. Establecer una clasificación puerta R2 en el terreno mediante el botón de puerta de polígono en la barra de herramienta de manera que la puerta se encuentra entre + 5% y -5% de las células del centro de la distribución (en total 10% de células alrededor del pico de la campana curva en forma).
10. Colocar un tubo de recogida que contiene 1,2 ml de LB que contiene 50 mg / ml de ampicilina y 12,5 mg / ml de cloranfenicol en la salida del instrumento FACS y ordenar 10 ⁶ células que satisfacen tanto la R1 y R2 puertas.
11. Retire el tubo de recogida, gorra, y suavemente vórtice.

3. Presentación de la Enzima Metagenomic

1. Se incuban las células clasificadas (del paso 2,11) a 37 ° C con agitación a 200 rpm hasta que la DO ₆₀₀ alcanza 0,5.
2. Añadir 1 l copiar solución de inducción para amplificar el número de copias fosmid intracelular. Se incuban las células durante 3 h más a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
3. Para preparar las células para clasificar, añadir 0,5 ml de las células cultivadas y un sustrato apropiado (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-celobiósido, o fosfato de fenilo) en un tubo de 14 ml de fondo redondo a una concentración final de 100 mM.
   1. Para una muestra de control, añadir 0,5 ml de las células cultivadas a partir del Paso 3.2 en un tubo de fondo redondo de 14 ml. Añadir el mismo volumen de PBS como el volumen de substrato en la fase 3.3.
4. Se incuban las dos muestras a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 3 hr.
5. Mientras tanto, preparar la máquina FACS con las mismas configuraciones que el paso 2.3.
6. Añadir 5 l de las células (para la clasificación) y células de control a dos tubos de 5 ml de fondo redondo que contienen 1 ml de PBS, respectivamente.
7. Se coloca el tubo que contiene las células de control en tque la carga de puerto de la FACS y hacer clic en el botón Cargar en el tablero de instrumentos de adquisición del software FACS. Ajustar la tasa de eventos a 1.000 - 3.000 eventos / seg mediante el control de Caudal de botones en el tablero de instrumentos.
8. Crear registro de escala FSC-A vs log escala SSC-Un gráfico de dispersión haciendo clic en el botón gráfico de puntos en la hoja de cálculo global del software y ajustar la puerta de dispersión R1 para abarcar los acontecimientos singlete (población bacteriana) con el botón de la puerta en el Polígono barra de herramientas.
9. Crear registro de escala FSC-A vs log escala FITC Un gráfico de dispersión haciendo clic en el botón gráfico de puntos en la hoja de trabajo y establecer una clasificación de puerta de R2 en el gráfico utilizando el botón Polígono Puerta de la barra de herramienta de manera que menos del 0,1% de células negativas se detectan dentro de la puerta R2.
10. Vuelva a colocar el tubo de la muestra de control con el tubo de muestra de la clasificación, y ajustar la tasa de eventos a 1.000 - 3.000 eventos / seg mediante el control de los botones de Velocidad de flujo en el salpicadero.
11. Colocar un tubo de extracción que contiene 0,5ml de LB en la salida del instrumento FACS y ordenar a cabo 10 ⁴ células que satisfacen tanto las puertas R1 y R2.
    Nota: El criterio de clasificación puede variar desde la parte superior 0,1% a 5% de FITC-A en la puerta R2. En este protocolo, se recogieron las células superiores al 1% como positivos.
12. Retire el tubo de recogida, gorra, y suavemente vórtice.
13. Extender las muestras de 0,5 ml recogidos en dos placas de agar (90 mm placas de Petri que contienen LB), 50 mg / ml de ampicilina, 12,5 mg / ml de cloranfenicol y se incuba la placa a 37 ° C durante la noche.
14. Si es necesario, realizar rondas adicionales de clasificación para FITC-A enriquecimiento repitiendo los pasos 3.1-3.14.

4. Hit Confirmación de selección y la actividad enzimática

1. Citometría de flujo análisis
   1. De la placa se incubó a Paso 3.14, seleccione una colonia que no muestran fluorescencia utilizando un selector de colonia bajo la observación de 488 nm de longitud de onda de un iluminador LED.
   2. Inocular la colonia seleccionada en un niño de 14 ml round de fondo tubo que contiene 2 ml de LB que contiene 50 mg / ml de ampicilina y 12,5 mg / ml de cloranfenicol a 37 ° C con agitación a 200 rpm hasta que su OD ₆₀₀ alcanza 0,5.
   3. Añadir 2 l copiar solución de inducción para amplificar el número de copias fosmid intracelular. Se incuban las células durante 3 h más a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
   4. Preparar un tubo de fondo redondo de 14 ml y añadir 1 ml de las células cultivadas (paso 4.1.3). Añadir un sustrato apropiado (acetato de p-nitrofenil, p -nitrophenyl- β-D-celobiósido, o fosfato de fenil) a una concentración final de 100 mM.
      1. Para un control, añadir 1 ml de células cultivadas a partir del paso 4.1.3 en un tubo de 14 ml de fondo redondo y añadir el mismo volumen de PBS como el volumen de sustrato en el paso 4.1.4.
   5. Se incuban las dos muestras a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 3 hr.
   6. Mientras tanto, preparar la máquina FACS con las mismas configuraciones que el paso 2.3.
   7. Añadir 5 l de las células de control y sustrato tratado a tubos de 5 ml de fondo redondo que contienen 1 ml de PBS, respectivamente.
   8. Se coloca el tubo que contiene las células de control en el puerto de carga del dispositivo FACS y hacer clic en el botón Cargar en el tablero de instrumentos de adquisición del software FACS. Ajustar la tasa de eventos a 1.000 - 3.000 eventos / seg Velocidad de flujo utilizando los botones en el salpicadero.
   9. Haga clic en el botón Adquisición de medir FITC-A.
   10. Sustituir el tubo de muestra de control con el tubo de muestra tratada sustrato. Ajustar la tasa de eventos a 1.000 - 3.000 eventos / seg Velocidad de flujo utilizando los botones en el salpicadero.
   11. Haga clic en el botón Adquisición de medir FITC-A.
   12. Comparación de la fluorescencia de los dos grupos de células por el trazado de un histograma de recuento de células frente al log escala FITC-A.
2. Otros ensayos para confirmar la actividad de la enzima
   1. Para mayor identificación de los candidatos seleccionados de enzimas, extraer el ADN usando fosmid Pro estándar de extracciónprocedimientos de los kits de extracción comerciales y analizar la secuencia de nucleótidos, o probar la actividad enzimática in vitro de ^6,7.

Resultados

Se examinaron los tres sustratos fenólicos para identificar nuevas enzimas metagenomic de una biblioteca de metagenome de sedimentos planas de alta mar de las mareas en Taean, Corea del Sur, siguiendo el protocolo propuesto. Para la construcción de la biblioteca, promedio 30 - 40 kb secuencias metagenome se insertaron en fosmids, que se basan en la E. coli F factor de replicón y se presenta como una sola copia en una celda. Tenga en cuenta que fosmids han sido ampliamente uti...

Discusión

El aumento de la eficiencia de producción de biocatalizadores es una clave para el éxito de la bio-químico basado en la industria de metagenome ⁹ y está considerada como una de las mejores fuentes de enzimas naturales. En este sentido, es esencial para el cribado de nuevas enzimas metagenoma donde la mayoría de los recursos genéticos no se han explorado ^10. Varios métodos de detección se han desarrollado que detectan directamente los productos de enzimas utilizando activadores de la transcr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid library production kit
CopyControl Induction Solution	Epicentre	CCIS125	Fosmid copy induction solution
EPI300	Epicentre	EC300110	Electrocompetent cell
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid vector
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Electroporation cuvette and electroporate system
FACSAria III	Becton Dickinson		Flow Cytometry (FACS machine)
AZ100M	Nikon		Microscope
UltraSlim	Maestrogen		LED illuminator
50-mL conical tube	BD Falcon
14-mL round-bottom tube	BD Falcon
5-mL round-bottom tube	BD Falcon
p-nitrophenyl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
p-nitrophenyl β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p-nitrophenyl butylate	Sigma-Aldrich	N9876	Substrate
Luria- Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L
Super Optimal broth (SOB)	BD Difco	244310	Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L
Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)			SOB, 0.4 % glucose
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)	BD Difco	244020	Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L
Cell storage media			2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose
pGESS(E135K)			A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details.
Chloramphenicol	Sigma	C0378
Ampicillin	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Flow Cytometry Software Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4