Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

Riepilogo

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Abstract

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library¹. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

Introduzione

Una tecnica saggio cella singola high-throughput recentemente sviluppato permette nuovi enzimi per essere sottoposti a screening da una libreria genetica su larga scala in base alla loro attività funzionali ^1. A livello di singola cellula, proteine ​​regolatrici della trascrizione sono impiegati per attivare l'espressione del gene reporter rilevando piccole molecole che sono prodotte come risultato di un'attività enzima bersaglio. Un primo approccio coinvolto l'isolamento di un operone fenolo-degradanti da Ralstonia eutropha E2 utilizzando l'espressione genetica substrato indotta metodo di retinatura (SIGEX), in cui il substrato induce l'espressione di una proteina reporter ^2. Nhar di Pseudomonas putida è stato utilizzato per selezionare benzaldeide deidrogenasi ^3, e LysG dal Corynebacterium glutamicum è stato utilizzato per lo screening high-throughput di un nuovo ceppo di L-lisina-produzione da diverse librerie di mutanti ^4.

In precedenza, un enzima screeni geneticaSistema ng (GESS) è stata proposta come una piattaforma di screening generalmente applicabile ^5. Questo sistema utilizza il regolatore dimetilfenolo fenolo-riconoscimento, DMPR, di P. putida. DMPR (E135K), e un mutante di DMPR, possono anche essere impiegati in GESS (pNP-GESS) per la rilevazione di p -nitrophenol (pNP). In presenza di enzimi bersaglio producono composti fenolici, GESS in E. coli emette un segnale di fluorescenza, consentendo il rapido isolamento di singole cellule utilizzando un cell sorter fluorescenza attivate (FACS). Ma l'espressione di enzima metagenomico sembra essere più debole di quella degli enzimi ricombinanti convenzionali; Pertanto, GESS è stato progettato per rilevare composti fenolici con la massima sensibilità per indagare la combinazione di ribosomiale sito di legame (RBS) e sequenze di terminazione con ottimali condizioni di funzionamento ^5.

Uno dei vantaggi fondamentali del GESS è che questo metodo unico permette teoricamente la proiezione di over di 200 diversi tipi di enzimi nel database BRENDA (Tabella 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) semplicemente utilizzando substrati diversi. E 'stato dimostrato che cellulasi, lipasi, e metil parathion idrolasi (MPH) può essere rilevato tramite PNP-GESS con substrati appropriati di p -nitrophenyl butirrato, p -nitrophenyl-cellotrioside, e parathion metile, rispettivamente, ^5. Recentemente, è stato dimostrato che una fosfatasi alcalina (AP), che è uno dei nuovi enzimi identificate utilizzando pNP-GESS, è il primo AP termolabile trovato in metagenomi marini adattati freddo ^6.

Qui, i dettagli del processo di screening è presentato con PNP-GESS rilevare le attività di tre diversi tipi di lipasi enzymes-, cellulasi, e fosfatasi alcalina -e identificare rapidamente nuovi enzimi candidati da una libreria metagenomica ^5,6. I processi includono metagenoma pre-elaborazione con PNP-GESS e la gestione di un flOW citometria sorter. Mentre dovranno essere sequenziato per ulteriore identificazione i successi ottenuti, questo protocollo riguarda la procedura fino ai gradini di conferma dell'attività enzimatica citometria a flusso.

Protocollo

1. Preparazione della biblioteca metagenomica con PNP-GESS

1. Costruire una libreria metagenomica in E. coli con un vettore fosmid utilizzando un kit fosmid produzione biblioteca secondo il protocollo ⁵ del produttore.
2. Aliquotare 100 microlitri della libreria per conservazione a -70 ° C, che è una fonte di cellule libreria metagenomiche.
   Nota: La densità ottica di un campione misurato ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD ₆₀₀₎ di questa libreria stock è di circa 100.
3. Scongelare 100 ml di dotazione della biblioteca metagenomica sul ghiaccio e inoculare in un pallone da 500 ml contenente 50 ml di Luria-Bertani (LB) e 12,5 mcg / ml cloramfenicolo seguito da 37 ° C di incubazione per 2 ore.
4. Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml per centrifugazione a 1.000 xg per 20 min a 4 ° C.
5. Risospendere il pellet rapidamente in 50 ml di acqua ghiacciata distillata (DW) e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C di nuovo.
6. resuspend il pellet in 50 microlitri DW ghiacciata con 10% (v / v) di glicerolo. Utilizzare 50 ml di questa aliquota cella per elettroporazione.
7. Mettere il composto di cellule electrocompetent 50 pl e pGESS (E135K) ⁵ DNA (100 ng) in una cuvetta elettroporazione ghiacciata e l'elettroporazione (1,8 kV / cm, 25 uF) la miscela.
8. Aggiungere rapidamente 1 ml di brodo eccellente ottimale con cataboliti repressione (SOC) di media e risospendere le cellule delicatamente.
9. Trasferire le cellule nel tubo 14 ml a fondo rotondo con una pipetta e incubare a 37 ° C per 1 ora.
10. Distribuire 500 ml di cellule recuperate su un LB di 20 x 20 cm Piatto quadrato contenente 12,5 mg / ml cloramfenicolo e 50 mg / ml di ampicillina. Incubare la piastra a 30 ° C per 12 ore.
11. Raschiare le colonie utilizzando un raschietto cellulare e raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml utilizzando supporti di memorizzazione cella ghiacciata.
12. Centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 10 ml di supporti di memorizzazione delle cellule gelideper raggiungere un OD ₆₀₀ di 100.
13. Aliquotare 20 ml di cellule per lo stoccaggio a -70 ° C.

2. Rimozione falsi positivi dalla libreria metagenomiche

1. Scongelare lo stock cellule biblioteca metagenomiche (dal punto 1.13) contenenti metagenomica fosmid DNA e pGESS (E135K) su ghiaccio.
2. Seminare 10 ml di cellule in 2 ml LB contenenti 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo in una provetta a fondo rotondo da 14 ml. Incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 4 ore.
3. Nel frattempo, accendere la macchina FACS e aprire il software di default FACS. Utilizzare le seguenti impostazioni: diametro della punta dell'ugello, 70 micron; Forward Scatter Area (FSC-A) sensibilità, 300 V-logaritmica di amplificazione; Side Scatter Area (SSC-A) sensibilità, 350 V-logaritmica di amplificazione; Fluoresceina isotiocianato Area (FITC-A) sensibilità, 450 V-logaritmica di amplificazione; parametro di soglia, FSC Un valore 5.
   Nota: Le impostazioni tipiche sono dateper il dispositivo FACS menzionata nella tabella dei materiali. Regolare le impostazioni per altri dispositivi FACS.
4. Diluire le cellule biblioteca metagenomiche dal punto 2.2 con l'aggiunta di 5 ml di campione in una provetta a fondo tondo da 5 ml contenente 1 ml di PBS.
5. Mettere il campione biblioteca diluito sul porto di carico dello strumento FACS e fare clic sul pulsante Carica sul Acquisizione Dashboard del software FACS.
6. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 1.500 eventi / sec facendo clic e il controllo dei pulsanti di flusso Prezzo sul cruscotto.
7. Creare log in scala FSC-A vs log in scala SSC-A grafico a dispersione di un foglio globale facendo clic sul pulsante Plot Dot nella barra degli strumenti. Regolare il cancello dispersione R1 fino a comprendere gli eventi di singoletto (popolazione batterica) utilizzando il pulsante Poligono Porta nella barra degli strumenti.
8. Tracciare un istogramma con conta delle cellule contro log in scala FITC-A sul foglio di lavoro facendo clic sul pulsante Istogramma. Poi, regolare la tensione di CIC dal Cytomescheda Impostazioni ter sulla finestra di ispezione controllo tale che il picco della distribuzione a campana è inferiore a 10 ² di FITC-A.
9. Creare un registro in scala FSC-A vs. il registro FITC-Una trama cliccando sul tasto Plot Dot sul foglio di lavoro globale. Impostare un ordinamento cancello R2 del terreno con il pulsante Poligono Porta sulla barra degli strumenti in modo che il cancello si trova tra le cellule + 5% e -5% dal centro della distribuzione (cellule totali 10% intorno al picco della campana curva a forma).
10. Posizionare un tubo di raccolta contenente 1,2 ml LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo all'uscita dello strumento FACS e sort out 10 ⁶ cellule soddisfano sia la R1 e R2 cancelli.
11. Rimuovere il tubo di raccolta, berretto, e delicatamente vortice.

3. metagenomiche Enzyme Screening

1. Incubare le cellule ordinati (dal punto 2.11) a 37 ° C con agitazione a 200 giri al minuto fino a quando la OD ₆₀₀ raggiunge 0,5.
2. Aggiungere 1 ml Copy Solution induzione per amplificare il numero di copie fosmid intracellulare. Incubare le cellule per un ulteriore 3 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm.
3. Per preparare cellule selezionare, aggiungere 0,5 ml di cellule coltivate e un substrato (p -nitrophenyl acetato, p -nitrophenyl-β-D-cellobioside, oppure fenile fosfato) in una provetta da 14 ml a fondo rotondo a una concentrazione finale di 100 pM.
   1. Per un campione di controllo, aggiungere 0,5 ml di cellule coltivate da Passaggio 3.2 in una provetta a fondo rotondo da 14 ml. Aggiungere lo stesso volume di PBS come il volume del substrato nel passo 3.3.
4. Incubare le due campioni a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 3 ore.
5. Nel frattempo, preparare la macchina FACS con le stesse configurazioni come punto 2.3.
6. Aggiungere 5 ml di cellule (per l'ordinamento) e cellule di controllo a due provette da 5 ml a fondo rotondo contenente 1 ml di PBS, rispettivamente.
7. Collocare la provetta contenente cellule di controllo Onto tegli caricamento porto delle FACS e fare clic sul pulsante Carica su Acquisizione Dashboard del software FACS. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec controllando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto.
8. Creare log in scala FSC-A vs log in scala SSC-A grafico a dispersione cliccando sul tasto Plot Dot sul foglio di lavoro globale del software e regolare il cancello dispersione R1 fino a comprendere gli eventi singoletto (popolazione batterica) utilizzando il pulsante Poligono porta sul barra degli strumenti.
9. Creare log in scala FSC-A vs log in scala coniugati con un grafico a dispersione, cliccando sul pulsante Plot Dot sul foglio di lavoro e impostare un ordinamento porta R2 sulla trama utilizzando il pulsante Poligono Porta sulla barra degli strumenti in modo che meno dello 0,1% di cellule negative vengono rilevati all'interno del cancello R2.
10. Sostituire il tubo campione di controllo con il tubo del campione di smistamento, e regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec controllando i pulsanti di flusso Prezzo sul cruscotto.
11. Posizionare un tubo di raccolta contenente 0,5ml LB all'uscita dello strumento FACS e sort out 10 ⁴ cellule soddisfano entrambe le porte R1 e R2.
    Nota: Il criterio di ordinamento può variare da cima 0,1% al 5% di FITC-A nel cancello R2. In questo protocollo, top cellule 1% sono state raccolte come positivi.
12. Rimuovere il tubo di raccolta, berretto, e delicatamente vortice.
13. Distribuire i 0,5 ml campioni raccolti su due piastre di agar (90 mm piatti Petri) contenenti LB, 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte.
14. Se necessario, eseguire ulteriori cicli di smistamento per FITC-A arricchimento ripetendo i passaggi 3.1-3.14.

4. Hit Selezione e Enzyme Activity Conferma

1. Citometria a flusso
   1. Dalla piastra di incubazione a Passo 3.14, selezionare una colonia mostrando alcuna fluorescenza utilizzando un selettore colonia sotto l'osservazione di 488 nm lunghezza d'onda di un illuminatore a LED.
   2. Inoculare la colonia selezionata in un 14-ml round fondo provetta contenente 2 ml LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo a 37 ° C con agitazione a 200 rpm fino alla sua OD ₆₀₀ raggiunge 0,5.
   3. Aggiungere 2 ml Copy Solution induzione per amplificare il numero di copie fosmid intracellulare. Incubare le cellule per un ulteriore 3 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm.
   4. Preparare un tubo 14 ml a fondo rotondo e aggiungere 1 ml di cellule in coltura (Fase 4.1.3). Aggiungere un substrato (acetato p -nitrophenyl, p -nitrophenyl- β -D-cellobioside, oppure fenile fosfato) ad una concentrazione finale di 100 mM.
      1. Per un controllo, aggiungere i 1 ml cellule coltivate dal punto 4.1.3 in un tubo 14 ml a fondo rotondo e aggiungere lo stesso volume di PBS come il volume del substrato nel passaggio 4.1.4.
   5. Incubare le due campioni a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 3 ore.
   6. Nel frattempo, preparare la macchina FACS con le stesse configurazioni come Passo 2.3.
   7. Aggiungere 5 ml di cellule di controllo e supporto trattato di provette da 5 ml a fondo rotondo contenente 1 ml di PBS, rispettivamente.
   8. Mettere le cellule di controllo tubo contenente il porto di carico del dispositivo FACS e fare clic sul pulsante Carica su Acquisizione Dashboard del software FACS. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec utilizzando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto.
   9. Fare clic sul pulsante di acquisizione per misurare FITC-A.
   10. Sostituire il tubo campione di controllo con il tubo del campione substrato trattato. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec utilizzando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto.
   11. Fare clic sul pulsante di acquisizione per misurare FITC-A.
   12. Confrontare la fluorescenza dei due gruppi di cellule tracciando un istogramma del numero di cellule vs. log scalata FITC-A.
2. Altri test per confermare l'attività enzimatica
   1. Per ulteriore identificazione dei candidati enzimi selezionati, estrarre il DNA fosmid usando l'estrazione pro di serieprocedure dei kit di estrazione commerciali e analizzare la sequenza nucleotidica, o testare l'attività enzimatica in vitro ^6,7.

Risultati

I tre substrati fenolici sono stati esaminati per identificare gli enzimi metagenomiche nuovi da una libreria metagenoma di sedimenti piane oceaniche delle maree a Taean, Corea del Sud, seguendo il protocollo proposto. Per la costruzione della libreria, medi 30 - 40 kb sequenze metagenoma sono stati inseriti fosmidi, che si basano sul E. coli F fattore replicone e presentato come una singola copia in una cella. Si noti che fosmidi sono stati ampiamente utilizzati per la costruzi...

Discussione

Aumentare l'efficienza della produzione di biocatalizzatori è una chiave per il successo di bio-chimico a base industria ⁹ e metagenoma è considerato uno dei migliori fonte enzima naturale. In questo senso, è essenziale lo screening di nuovi enzimi dalla metagenome dove la maggioranza delle risorse genetiche non sono state esplorate ^10. Diversi metodi di screening sono stati sviluppati che rilevano direttamente i prodotti enzimatici utilizzando attivatori trascrizionali ^{11, 12} ma ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid library production kit
CopyControl Induction Solution	Epicentre	CCIS125	Fosmid copy induction solution
EPI300	Epicentre	EC300110	Electrocompetent cell
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid vector
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Electroporation cuvette and electroporate system
FACSAria III	Becton Dickinson		Flow Cytometry (FACS machine)
AZ100M	Nikon		Microscope
UltraSlim	Maestrogen		LED illuminator
50-mL conical tube	BD Falcon
14-mL round-bottom tube	BD Falcon
5-mL round-bottom tube	BD Falcon
p-nitrophenyl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrate
p-nitrophenyl β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrate
p-nitrophenyl butylate	Sigma-Aldrich	N9876	Substrate
Luria- Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L
Super Optimal broth (SOB)	BD Difco	244310	Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L
Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)			SOB, 0.4 % glucose
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)	BD Difco	244020	Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L
Cell storage media			2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose
pGESS(E135K)			A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details.
Chloramphenicol	Sigma	C0378
Ampicillin	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Flow Cytometry Software Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4