אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

Summary

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Abstract

בידודו של וירוסים ענקים הוא עניין רב בעידן החדש הזה של וירולוגיה, במיוחד מאז וירוסים הענקים אלה קשורים הפרוטיסטים. וירוסים ענקים עשויים להיות פתוגניים פוטנציאליים עבור מינים רבים של הפרוטיסטים. הם שייכים הסדר המתואר לאחרונה Megavirales. השושלת החדשה Faustovirus כי כבר מבודד דגימות שפכים הוא קרוב רחוק של נגיף קדחת החזירים אפריקה יונקים הפתוגן. וירוס זה הוא גם ספציפי לאותו המחשב שלה amoebal, vermiformis Vermamoeba, לפרוטיסטים נפוצים במערכות מי בריאות. זה חיוני כדי להמשיך לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להגדיל אוסף גנוטיפ שלה וללמוד הפאן הגנום שלו. פתחנו אסטרטגיות חדשות עבור הבידוד של זנים נוספים על ידי שיפור שימוש שילובי אנטיביוטיקה נגד פטריות על מנת למנוע זיהומי חיידקים ופטריות של שיתוף תרבות האמבה ו לטובת כפל הווירוס. גם אנחנו יישמנו starvatio חדשn בינוני לשמור V. vermiformis בתנאים אופטימליים עבור וירוסים שיתוף תרבות. לבסוף, השתמשנו cytometry זרימה במקום תצפית מיקרוסקופית, וזה זמן רב, כדי לזהות את השפעת cytopathogenic. השגנו שני בידודים ממדגמים ביוב, להוכיח את היעילות של שיטה זו, ובכך להרחיב את אוסף Faustoviruses, כדי להבין טוב יותר את סביבתם, סגולי המארח תוכן גנטי.

Introduction

גילוי וירוסים ענקים, במיוחד אלה השייכים לסדר Megavirales, שינה לחלוטין את עולם הווירוסים מבחינת גודל חלקיקים ואת המורכבות הגנום. הווירוסים היו בעבר חשבו להיות ישויות קטנות, ואת Mimivirus הופיע לשבור את כל הכללים. ¹ נתוני metagenomic מצביעים על ההמצאות בכל המקום של וירוסים ענקים לא רק בסביבה, ^2-5 אלא גם בבני אדם. ⁶ לכן, יש עדיין צורך לחפש וירוסים אלה בקנה מידה גדול. המגוון של וירוסים הענקים אלה הוערך באמצעות דגימה לא רק במגוון סביבות מימיות ומשקעים הקשורים בם ברחבי העולם, ^7-11 אלא גם על ידי הקרנת מגוון של דגימות אנושיות ^12,13 ו דגימות סביבתיות. ^7,9 mimivirus polyphaga Acanthamoeba היה מבודד על-ידי שיתוף התרבות באמצעות הפרוטיסטים phagocytic, spp Acanthamoeba בעיקר. ^14-16 אוסף שלם של וירוסים ענקים היה אז גםשבודד מארח לפרוטיסטים שצוין זה, מה שהפך את הקהילה המדעית להגביל הליך מחקר בידודה עבור spp Acanthamoeba. ברור הסתמכות זו על זן לארח אחת הביאה חלק גדול של וירוסים מתעלמים ממנה. עובדת הווירוס הענק, CroV, היה מבודד עם roenbergensis קפיטריה פרוטוזואה הימי הניע מאוד, ^17,18 ממחיש את הצורך להשתמש במגוון רחב יותר של פרוטוזואה על מנת לגלות שושלות חדשות או משפחות של וירוסים ענקים. Reteno et al. הצליח לבחור פרוטוזואה אחר כמארחי תא אשר מעולם לא נעשה בה שימוש בעבר, ומבודד את שושלת אספר הקשורות החדשה של וירוסים ענקים (את Faustovirus בשם החדש). ¹⁹

בניסיון לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להרחיב את חברי שושלת ויראלי זה, שינינו נהלי הבידוד שלנו והשתמשנו בם כדי להקרין דגימות סביבתיות מסוגלות קצירת Faustoviruses החדש. לאחר מכן, אנותאר את הפרוטוקול כולו לאפיין את הבידודים החדשים. החוקרים העריכו vermiformis Vermamoeba, את לפרוטיסטים חסרת חיים השכיח ביותר בקרב בסביבות האדם, ^20-22 שכבר משמש את בידודה של אבטיפוס Faustovirus הראשון E12. ¹⁹ זה לפרוטיסטים כרגע עדיין לארח ספציפי עבור Faustovirus. ידענו שאף אחד הווירוסים הענקים הידועים היה פתוגניים עבור אמבה זה, כי אף ניסיונות לגדל וירוסים ענקים אחרים במעבדה שלנו הראתה תמוגה אמבה או צמיחת ויראלי. מסיבה זו, אנו מאמינים כי V. vermiformis היא התמיכה הסלולרית הטובה ביותר והייחודית ביותר הידועים לבודד Faustoviruses חדש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

אוסף דוגמאות 1.

1. אסוף 70 דגימות מסביבות ואזורים שונים. במקרה זה, השתמש בנוסחה הבאה: 5 דגימות המים המלוכלכים מהכפר סנט פייר דה Meyzoargues (צרפת), 15 דגימות מהאגם Parc Borely במרסיי (צרפת); 15 דגימות מי ים עם משקעים מן המפרצונים הסלעיים ב Samena במרסיי (צרפת), 25 דגימות מי נהר מהרי האלפים (צרפת), ולבסוף, 10 דגימות ביוב לה סיוטה (צרפת).
2. דגימות וורטקס עבור המגון לפני יחסנו, למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ללא כל טיפול.

נוהל בידוד 2.

1. מארח הכנת נהלי תרבות עיוורת חיסון לדוגמא
   1. השתמש V. vermiformis (זן CDC19) כתמיכת תא עבור שיתוף התרבות.
   2. שמירה על אמבות על 28 מעלות צלזיוס, בבקבוק תרבות 75 ס"מ ² תאים עם 30 מ"ל של מדיום פרוטאז-peptone-תמצית שמרים-גלוקוז (PYG). אנא קרא רכב PYG בטבלת 1.
      הערה: לאחר 48 שעות, אמבות הם לכמת ידי מגלשות ספירה באמצעות נורמליות לספור (למשל, Kovaslides).
   3. קציר תאים בריכוז של 5 x 10 ⁵ כדי 10 ⁶ תאים / מ"ל, אמבות גלולה ידי צנטריפוגה ב 720 XG במשך 10 דקות.
   4. הסר את supernatant על ​​ידי שאיפה, מחדש להשעות גלולה אמבות ב 30 מ"ל של תמיסת מלח amoebal של עמוד סטרילי (PAS) טבלה 1. חזור על הליך שטיפה זו.
   5. Re- להשעות אמבות ב 30 מ"ל של מדיום רעב עם תערובת אנטיביוטיקה נגד פטריות בריכוז של כ 10 ⁶ אמבה / מ"ל. המדיום הרעב הוא מדיום הישרדות של האמבה, מה שמאפשר את זה כדי להישאר בחיים ללא יצירת ביצי קיימא או כפל. בדקו רכב בטבלה 1.
      הערה: תערובת סוכן מיקרוביאלית הכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ונקומיצין, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אימיפנם, 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ciprofloxacin, 20 μg / ml דוקסיציקלין, ו -20 מיקרוגרם / מ"ל ​​voriconazole. תמהיל זה שימש כדי להפחית את זיהום חיידקים ופטריות שיכולים להקטין או לשנות כפל ויראלי.
   6. ישירות לחסן 25 μl של כל דגימה על monolayer אמבת 200 μl ב תחתית שטוחת צלחת 96-היטב לטובת דבקות האמבה לדגור על 30 מעלות צלזיוס בסביבה לחה (בסביבת לחה מורכבת הצבת רטייה רטובה בתוך השקית עם הצלחת על מנת למנוע אידוי). זהו-תרבות פרימו. השאר שתי בארות של אמבות ללא כל חיסון מדגם; זה משמש השליטה השלילית. דגירה במשך שלושה ימים פרימו-תרבות זו.
   7. שלושה ימים לאחר החיסון הראשונה, תת-תרבות צלחת פרימו-התרבות על אמבות טריות כמתוארת לעיל ללא כל תצפית מיקרוסקופית. דגירה את הצלחת החדשה במשך שלושה ימים תחת אותם התנאים כמו-תרבות פרימו.
   8. בצע את התרבות הסופית לאחר שלושה ימים אלה של דגירה באותו אופן כמו עבור הדואר תת תרבות primo- ו. דגירת התרבות הסופית במשך ימים. ואז להמשיך זיהוי.
2. איתור של תמוגה ידי האוטומטית cytometry הזרימה
   הערה: התרבות עיוורת בשילוב עם זרימת cytometry שונה ממערכת התקן הקודמת של בידוד. זה הוא רגיש יותר, מדויק אוטומטי. למטרות זיהוי, אנחנו מוחלים טכניקה חדשה שפותחה כדי לזהות תמוגה במהירות הגבוהה ביותר וללא השגחה מיקרוסקופית. טכניקה זו היא יתרון עבור דגימות הקרנה ויש לו רגיש יותר טוב שיטות ישנות. ^7-9
   1. השתמש צלחת 96-היטב של שיתוף התרבות הסופית לזהות תמוגה.
   2. הפעל את cytometer ולהפעיל מחזור נקי לשטוף כדי להשיג רעש רקע נמוך על פי הפרוטוקול של היצרן.
   3. הפעל את סמפלר התפוקה הגבוה (HTS) בשילוב עם זרימת cytometer לטעון דגימות באופן אוטומטי מהצלחת 96-היטב ולבצע רכישה אוטומטית לחלוטין בתוך 40 דקות Accordinז הפרוטוקול של היצרן.
   4. הגדרת HTS כדלקמן: נפח דגימה 150 μl, ערבוב נפח 50 μl, ערבוב מהיר 180, מספר תערובות 5, נפח כביסה בין כל μl מדגם 400, קצב זרימת 2.5 μl / sec, מספר האירועים שנרשמו 10,000.
   5. להעריך את בארות בקרה השליליות של שיתוף תרבות מייקרו-צלחת הגמר ראשון על מנת שער אוכלוסיית האמבה ולקבוע את אחוז צבאות תאים אלה על פי המאפיינים הפיסיים שלהם. הקפד בעלות אוכלוסייה הומוגנית אמבה ואוכלוסייה שנייה של אירועים נמוכים המתאים פסול ורעש.
      הערה: הליך gating זו מייחד פסולת subcellular וגושי מתאים יחידים לפי גודל, מוערכים על ידי פיזור קדימה. לכן חשוב לקבוע את האחוז המדויק של כל אוכלוסייה באמצעות הליך gating הטוב ביותר האפשרי. אחוזים אלה עשויים להשתנות, במיוחד אם יש סוגים רבים של פרוטוזואה משמשים, ולכן חשוב תמיד להיות negativשליטה דואר, אשר ניתן להשתמש בהם כמו האוכלוסייה התייחסות שאר הדגימות.
   6. הפעל את gating על ידי לחיצת מדגם רכישה.
   7. רשום את מספר אירועים לא פחות מ -10,000 אירועים.
   8. בתרגום אוכלוסיית אמבת עניין באמצעות החץ. זה איך להגדיר את השערים.
   9. לאחר gating, לתת את המקום HTS או לאתר את הצלחת על ידי לחיצה על 'הבית', ולאחר מכן להפעיל את הצלחת כולה באופן אוטומטי. בצע נתונים הרכישה וניתוח על פי הפרמטרים גודל ומבנה (בהתאמה, FSC (פיזור קדימה) ו SSC (פיזור צד)).
      הערה: זיהוי אובדן אוכלוסיית האמבה מגודרת מסמן את הנוכחות של סוכן פתוגניים אחראי תמוגה אמבה. תמוגה פרוטוזואה קשורה לזיהום וירוס מזוהית עם סף תוכנן באופן שרירותי לתמס 50% מאוכלוסיית האמבה המגודרות על ידי המנתח ולעומת האוכלוסייה הלא הנגועה אותה משמשת כביקורת שלילית אמינה.

3. אפיון של המבודד החדש לאחר איתור תמוגה

1. מכתים מקדמיות לגלות את נוכחותם של ענק וירוסים
   1. לאחר זיהוי תמוגה ידי cytometry זרימה, פיפטה שיתוף תרבויות lysed להשעות את האמבות הנותרות. ואז ישירות cytocentrifuge 50 μl של השעיה ב 800 XG במשך 10 דקות.
   2. לאחר צנטריפוגה, לתקן את השקופיות עם פתרון מתנול טהור. כתם השקופיות באמצעות מכתים מהיר מסחרי של Eosin / כחול מכתים Azur ו DAPI ולבחון תחת מיקרוסקופ אור בהגדלת 1,000X כדי לבדוק את קיומו של מפעלי וירוס.
      1. עבור מכתים מהיר, לצלול השקופיות לתוך תמיסת eosin הראשונה (4 שניות חזרו שלוש פעמים) ולאחר מכן לעבור ישירות לצלול מגלשות לתוך תמיסת תיקון הנוספת שהכילה הכחול Azur במשך 6 שניות, ולבסוף לשטוף את השקופיות עבור 45 שניות עם פתרון חיץ פוספט pH 7.2. השאירו את השקופיות לייבוש בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להמשיך observatiעַל.
      2. עבור מכתים DAPI, פיקדון 15 μl של פתרון המניות המסחרי DAPI לשקופית היבשה הקבועה. להגן מפני אור מכן להמשיך תצפית.
2. מיקרוסקופי אלקטרונים
   1. לאחר זיהוי הראשון בשקופיות, להעריך את הנוכחות של הנגיף הענק באמצעות תצפית במיקרוסקופ אלקטרונים של תרבויות supernatant.
   2. הפקדה 5 μl של המדגם החיובי על הרשת-משוחרר הזוהרת. המתן כ 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. יבש את הרשת בזהירות פיקדון עבורו טיפה קטנה של molybdate אמוניום 1% למשך 10 שניות. השאר את הרשת להתייבש במשך 5 דקות.
   4. המשך במיקרוסקופ אלקטרונים ב 200 keV.
   5. מניחים את הרשת על בעל; להציג המחזיק לתוך מיקרוסקופ. בדוק את סקירת הוואקום על ידי לחיצה על הסמל המקביל. שסתום לסגור ולהתחיל התבוננות בכל גודל נקודה 5, וגדלה של x 25,000.
   6. מדוד את הווירוס הענק באמצעות ImageJ או ישירly על המיקרוסקופ שימוש באפשרות המידה של המיקרוסקופ ממוקם על מסך הרכישה.
      הערה: לסווג את המדגם לתוך הקבוצה Faustovirus עם גודל קפסיד של כ 200 ננומטר.
3. ביולוגיה מולקולרית
   הערה: בעקבות זיהוי זה, בדיקות ביולוגיה מולקולרית היו מכריעים עבור אישור כדי להבדיל Faustovirus מ Marseillevirus, אשר יש באותו גודל קפסיד והמראה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים, למרות שאין להם את אותה הספציפיות המארח. Marseillevirus לא יכול לצמוח על Vermamoeba, את Faustovirus ספציפי Vermamoeba וכל הניסיונות לגדל אותו על אמבה אחרת כגון Acanthamoeba נכשלו עד כה. העיצוב והיישום של מערכות פריימר / בדיקה הספציפיות מופיעות בעבודות של Reteno et al. מופעל סיווג ראשוני מדויק יותר של הווירוסים חדשים מבודדים באמצעות הגברת רצף של גני ויראלי.
   1. לְשֶׁעָבַרדנ"א בדרכי ממדגמים התרבות החיוביים באמצעות מערכת חילוץ אוטומטית על פי הפרוטוקול של היצרן.
   2. בצע בזמן אמת PCR להשתמש thermocycler כמתואר Reteno et al. ¹⁹
   3. רצף באמצעות אותו פריימרים ששימשו הגברה. השתמש פריימרים מיקוד למקטע RNA פולימראז מכוונת DNA 1 הגן: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT גת GGT CAC ATA G-3 '(קדימה) Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3 "(הפוכה) עם החללית Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-טמרה.

4. הפקת וירוס, רצף טיהור הגנום

1. תת תרבות אמבת וירוס אחד עבור שיבוט דילול נקודת סיום.
2. לייצור: להכין 20 צלוחיות המכיל 30 מ"ל של PYG, 10 מ"ל של vermiformis Vermamoeba ו -5 מ"ל של הנגיף מבודד כבר הועבר מבארות צלוחיות קטנות.
3. לדגור על 30 מעלות צלזיוס עד מלאתמוגה של אמבה. שים לב כל יום על ידי מיקרוסקופ אופטי הפוך עד שכל האמבה הם lysed.
4. לאחר תמוגה שלם, ברכה כל הצלוחיות לתוך נמען אחד. מסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר לחסל פסולת.
5. הפעל את הטיהור ידי ultracentrifugation ב 89,800 XG במשך 75 דקות. הקפד לכייל את המשקל של הצינורות לפני תחילת צנטריפוגה.
6. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant מצינור כל על ידי שאיפה מחדש להשעות הגלולה ב PAS עם אותו הנפח משמש לכיול, לפני חזרה צנטריפוגה.
7. כנ"ל, להסיר את supernatant מחדש להשעות את כל כדורי ב 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS).
8. לטהר את הנגיף מיוצר, באמצעות סוכרוז 25% (27.5 גרם של סוכרוז 100 מ"ל של PBS, מסונן על מסנן 0.22 מיקרומטר).
   1. השתמש 8 מיליליטר של סוכרוז 2 מיליליטר של השעית ויראלי. צנטריפוגה ב 89,800 XG במשך שעה 1 15 דקות. מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של PBS. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

המערכת למדה בכתב היד הזה תוקפת הוכחה של מושג על ידי בידוד השני Faustoviruses החדש. מבין 70 הדגימות שנבדקו, שני פרקים לתמס אותרו, בניגוד לביקורות השליליות האמינות שלנו. השליטה השלילית עבור תמוגה הכילה אוכלוסיית אמבת 86%. לעומת זאת, דגימות חיוביות (ST1 עבור סנט פ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

האפשרות Faustovirus יכול להיות החבר הראשון של משפחה חדשה Megavirales קרוב ASFV הוצע לראשונה על ידי Reteno et al., ¹⁹ אבל כמה הבדלים עדיין ניתן להבחין. נראה ברור אם Faustovirus צריך להצטרף למשפחת Asfarviridae או שמא במקום ליצור משפחה ויראלי המשוערת חדש. בעיה זו תדרוש חקירה נוספת, בפרט אפיו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR FORTESSA cytometer	BD Biosciences	France	649225B4
TECNAI G2 F20	FEI	Germany	5027/11
Optical inverted microscope	leica	France	72643
DNA extraction	Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot	France	L106A0452
PCR Cycler CFX96	Bio rad	France	785BR06298
PYG medium, PAS, Starvation medium	In house laboratory production	Marseille URMITE	x
Amoeba strain CDC-19	ATCC	France	50237
Plates	Cellstar	France	655180
PCR materials, primers.	eurogentec	France	Primers cited in manuscript
glasstic slide 10 with grids	Kova	USA	H899871441F
Eosin/blue Azur-Hemacolor stain	Merck milipore	France	111955,6,57,109468
Vacuum driven filters	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
DAPI stain	Life Technologies	France	D1306
cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Fisher scientific	France	10522013JT184-31
Single cytology tunnel	Biomedical polymers inc.	France	BMP-cyto-S50
Carbon grids	Euromedex	France	FCF400NI
Ammonium molibdate	VWR internationanl	France	21276185
Flasks	SARSTEDT	Germany	833911
0.22 μm filters	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultracentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Rapid-flow filters	Nalgene	France	450-0020