Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

Zusammenfassung

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Zusammenfassung

Die Isolierung von Riesen-Viren ist von großem Interesse in dieser neuen Ära der Virologie, vor allem, da diese riesigen Viren sind Protisten verwandt. Riesen Viren können potentiell pathogen sein für viele Arten von Protisten. Sie gehören zu den kürzlich beschriebenen Reihenfolge von Megavirales. Die neue Linie Faustovirus, die von Abwasserproben isoliert wurde, ist weitläufig verwandt mit dem Säuger-Erreger der Afrikanischen Schweinepest-Virus. Dieses Virus ist auch spezifisch für seine Amöben Wirt, Vermamoeba vermiformis, einem Protisten gemeinsam in Wassersystemen Gesundheitswesen. Es ist wichtig, neue Faustovirus Genotypen fortzusetzen, um die Isolierung ihres Genotyps Sammlung zu vergrößern und seine pan-Genom untersuchen. Wir entwickelten neue Strategien für die Isolierung von zusätzlichen Belastungen durch die Verwendung von Antibiotika und Antimykotika Kombinationen, um die Verbesserung der Bakterien- und Pilzkontaminationen der Amöbe Kokultur und begünstigen die Virusvermehrung zu vermeiden. Wir führten auch eine neue starvation Medium zu halten V. vermiformis unter optimalen Bedingungen für Viren Co-Kultur. Schließlich verwendeten wir Durchflusszytometrie statt mikroskopischen Beobachtung, die zeitaufwendig ist, den cytopathogenen Effekt zu erkennen. Wir erhielten zwei Isolate von Abwasserproben, die Effizienz dieses Verfahrens zu beweisen und damit die Verbreiterung der Sammlung von Faustoviruses, besser an ihre Umgebung zu verstehen, Wirtsspezifität und genetische Inhalt.

Einleitung

Die Entdeckung des Riesen Viren, vor allem die Angehörigen der Megavirales Ordnung, völlig verändert die Welt der Viren in Bezug auf die Partikelgröße und Genom Komplexität. Die Viren wurden bisher angenommen , kleine Einheiten zu sein, und die Mimivirus erschienen , alle Regeln zu brechen. ¹ metagenomische Daten , die die Allgegenwart von Riesen Viren nicht nur in der Umgebung vermuten lässt, ^2-5 , sondern auch beim Menschen. ⁶ Daher besteht weiterhin ein Bedarf ist für diese Viren in großem Maßstab zu suchen. Die Vielfalt dieser riesigen Viren durch Abtasten nicht nur eine Vielzahl von Gewässern und die damit verbundenen Ablagerungen weltweit beurteilt wurde, ^7-11 , sondern auch durch eine Vielzahl von humanen Proben ^12,13 Screening und Umweltproben. ^7,9 Die Acanthamoeba polyphaga Mimivirus war isoliert durch Co-Kultur phagozytischen Protisten verwenden, in erster Linie spp Acanthamoeba. ^14-16 waren eine ganze Sammlung von Riesenviren dann auchisoliert von dieser angegebenen Protisten Host, die die wissenschaftliche Gemeinschaft ihre Forschungs- und Isolierungsverfahren für Acanthamoeba spp beschränken gemacht. Offensichtlich diese Abhängigkeit von einem einzigen Host-Spezies hat dazu geführt, ein großer Teil der Viren übersehen. Die Tatsache , dass der Riese Virus, CroV, mit dem hoch motile marine Einzeller Cafeteria Roenbergensis isoliert wurde, zeigt , ^17,18 die Notwendigkeit , eine breitere Palette von Protozoen zu verwenden , um neue Linien oder Familien von Riesen-Viren zu entdecken. Reteno et al. Gelang andere Protozoen als Zellwirte auszuwählen , die nie benutzt worden war, und isoliert die neue Asfar bezogenen Linie von Riesenviren (die neu benannte Faustovirus). ¹⁹

In einem Versuch, neue Faustovirus Genotypen zu isolieren, um die Mitglieder dieser viralen Linie zu erweitern, modifizierten wir unsere Isolierungsverfahren und verwendet sie Umweltproben zum Screening der Lage, neue Faustoviruses Ernte. Wir danndas gesamte Protokoll beschrieben, um die neuen Isolate zu charakterisieren. Wir untersuchten Vermamoeba vermiformis, die am häufigsten Protisten freilebende in menschlichen Umgebungen gefunden, ^20-22 , die bereits in der Isolierung des ersten Faustovirus Prototyp E12 verwendet wird. ¹⁹ Diese Protisten ist derzeit noch wirtsspezifisch für Faustovirus. Wir wussten, dass keines der bekannten Riesen Viren für diese Amöbe pathogen war, weil keine Versuche anderen Riesen Viren wachsen in unserem Labor Amöbe Lyse oder das virale Wachstum zeigte. Aus diesem Grund glauben wir , dass V. vermiformis ist die beste und einzigartige Zell Unterstützung bekannt zu neuen Faustoviruses isolieren.

Protokoll

1. Probenentnahme

1. Sammeln Sie 70 Proben aus verschiedenen Umgebungen und Regionen. In diesem Fall verwenden Sie die folgenden: 5 schmutzige Wasserproben aus dem Dorf Saint Pierre de Meyzoargues (Frankreich), 15 Proben aus dem See im Parc Borély in Marseille (Frankreich); 15 Meerwasserproben mit Sediment aus den Felsbuchten an Samena in Marseille (Frankreich), 25 Flusswasserproben aus den Alpen (Frankreich), und schließlich, 10 Proben von Abwasser in La Ciotat (Frankreich).
2. Vortex Proben zur Homogenisierung vor dem Beimpfen, für eine Minute bei Raumtemperatur ohne jede Behandlung.

2. Isolierung Procedure

1. Host-Vorbereitung für Blinde Kulturverfahren und Proben Inokulation
   1. Verwenden V. vermiformis (Stamm CDC19) als Zell Unterstützung für die Co-Kultur.
   2. Aufrechterhaltung der Amöben bei 28 ° C, in einem 75 cm ² Zellkulturflasche mit 30 ml Protease-Pepton-Hefeextrakt-Glucose - Medium (PYG). Bitte überprüfen Sie PYG Zusammensetzung in Tabelle 1.
      Hinweis: Nach 48 Stunden Amöben durch eine normale Zählung mit Zählen Dias quantifiziert werden (zB Kovaslides).
   3. Ernte Zellen bei einer Konzentration von 5 × 10 ⁵ zu 10 ⁶ Zellen / ml und Pellet Amöben durch Zentrifugation bei 720 xg für 10 min.
   4. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen, und erneut zu suspendieren die Amöben Pellet in 30 ml sterile Seite der Amöbensalzlösung (PAS) Tabelle 1. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang.
   5. Re-suspendieren Amöben in 30 ml Hungermedium mit einem Antibiotikum und antimykotische Mischung in einer Konzentration von etwa 10 ⁶ amoeba / ml. Das Hungermedium ist ein Überlebensmedium für die Amöbe, es ermöglicht, ohne Encystirung oder Multiplikation am Leben zu bleiben. Überprüfen Zusammensetzung in Tabelle 1.
      Hinweis: Das antimikrobielle Mittel Gemisch enthielt 10 ug / ml Vancomycin, 10 & mgr; g / ml Imipenem, 20 ug / ml Ciprofloxacin, 20 μg / ml Doxycyclin und 20 & mgr; g / ml Voriconazol. Diese Mischung diente dazu, die Bakterien und Pilzbefall zu reduzieren, die Virusvermehrung zu verringern oder verändern kann.
   6. impfen Direkt 25 ul jeder Probe auf die 200 ul Amöbe Monoschicht in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden, die Amöbe Einhaltung begünstigen und bei 30 ° C in einer feuchten Umgebung brüten (feuchter Umgebung besteht in der Tasche eine nasse Kompresse des Vergebens enthält, die Platte, um Verdampfung zu vermeiden). Dies ist die primo-Kultur. Lassen Sie zwei Brunnen von Amöben ohne Probe Impfung; Dies dient als Negativkontrolle. Inkubieren dieses primo-Kultur für drei Tage.
   7. Drei Tage nach der ersten Inokulation Subkultur der primo-Kulturplatte auf frischem Amöben als ohne mikroskopische Beobachtung oben beschrieben. Inkubieren Sie die neue Platte für drei Tage unter den gleichen Bedingungen wie die primo-Kultur.
   8. Führen der endgültigen Kultur nach diesen drei Tagen Inkubation die gleiche Weise wie für the primo- und Subkultur. Inkubieren Sie die letzte Kultur für zwei Tage. Dann auf die Erkennung fortzufahren.
2. Der Nachweis von Lysis durch automatisierte Flow Cytometry
   Hinweis: Blind Kultur gepaart mit Durchflusszytometrie unterscheidet sich vom bisherigen Standard der Isolation. Es ist empfindlicher, präzise und automatisiert. Für Nachweiszwecke, wandten wir eine neue Technik der Lyse mit der höchsten Geschwindigkeit zu erfassen, entwickelt und ohne mikroskopische Beobachtung. Diese Technik ist von Vorteil für das Screening Proben und hat eine bessere Empfindlichkeit als ältere Techniken. ^7-9
   1. Verwenden, um die 96-Well-Platte der endgültigen Kokultur Lyse zu detektieren.
   2. Schalten Sie das Zytometer und führen Sie einen sauberen und Spülgang, um nach niedrigeren Hintergrundrauschen zu Protokoll des Herstellers zu erhalten.
   3. Starten Sie den High Throughput Sampler (HTS) in Kombination mit Durchflusszytometer automatisch Proben laden von der 96-Well-Platte und führen Sie eine vollständig automatisierten Erfassung innerhalb von 40 min according dem Protokoll des Herstellers.
   4. Richten Sie die HTS wie folgt: Probenvolumen 150 & mgr; l, Volumen 50 ul Mischen, Mischgeschwindigkeit 180, die Anzahl der Mixe 5, Waschvolumen zwischen jeder Probe 400 & mgr; l, Flussrate 2,5 l / s ab, die Anzahl der aufgezeichneten Ereignisse 10.000.
   5. Bewertung der negativen Kontrollvertiefungen des endgültigen Kokultur Mikroplatte zuerst um die amöben Bevölkerung Gate und der Anteil dieser Zellwirten gemäß ihrer physikalischen Eigenschaften zu bestimmen. Achten Sie darauf, eine homogene Amöbe Bevölkerung und eine zweite Population einer unteren Ereignisse zu haben, um Schmutz und Lärm entspricht.
      Hinweis: Dieses Gating-Verfahren unterscheidet subzellulärer Schutt und Klumpen aus einzelnen Zellen durch Größe, durch Vorwärtsstreuung geschätzt. mit der bestmöglichen Gating-Verfahren ist es deshalb wichtig, genau den Prozentsatz jeder Population bestimmen. Diese Prozentsätze können variieren, insbesondere wenn viele Arten von Protozoen verwendet werden, so ist es wichtig, stets einen negativ zu haben,e Steuerung, die als die Referenzpopulation für den Rest der Proben verwendet werden kann.
   6. Starten Sie die Gating acquire Probe durch einen Klick.
   7. Notieren Sie die Anzahl der Ereignisse, die nicht weniger als 10.000 Veranstaltungen.
   8. Localize die Amöbe Population von Interesse mit dem Pfeil. Dies ist, wie die Tore zu definieren.
   9. Nach Gating, lassen Sie den HTS-Spot oder die Platte finden, indem Sie "Start" klicken, dann die gesamte Platte automatisch ausgeführt. Führen Sie die Datenerfassung und Analyse nach der Größe und Strukturparameter (bzw. FSC (Vorwärtsstreuung) und SSC (side scatter)).
      Hinweis: Die Erkennung des Verlust der Amöbe-gated Bevölkerung signalisiert das Vorhandensein eines Krankheitserregers verantwortlich für Amöbe Lyse. Protozoen Lyse mit Virusinfektion assoziiert ist mit einer beliebig gestaltet Schwelle von 50% Lyse der Amöbe Population durch den Analysator und im Vergleich zu dem gleichen nicht-infizierten Population verwendet als zuverlässige negative Kontrolle gated detektiert.

3. Charakterisierung des neuen Isolaten nach der Lyse-Erkennung

1. Vorläufige Färbung zu offenbaren die Anwesenheit von Riesenviren
   1. Nach der Lyse Detektion mittels Durchflusszytometrie, pipettieren lysiert Kokulturen die verbleibenden Amöben zu suspendieren. Zytozentrifuge dann direkt 50 ul der Suspension bei 800 xg für 10 min.
   2. Nach dem Zentrifugieren fixieren Sie die Folien mit einer reinen Methanollösung. Stain die Folien eine kommerzielle Schnellfärbung von Eosin / blau Azur und DAPI-Färbung mit und beobachten unter einem Lichtmikroskop bei 1,000x Vergrößerung, um das Vorhandensein von Viren Fabriken zu überprüfen.
      1. Für eine schnelle Färbung, die Folien in die erste Eosinlösung stürzen (4 sec dreimal wiederholt) dann direkt gleitet in die zweite Befestigungslösung, die blauen Azur für 6 sec tauchen passieren, und spülen Sie schließlich die Folien für 45 sec mit einer Phosphatpufferlösung pH-Wert 7,2. Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur trocknen, dann gehen Sie zu observatiauf.
      2. Für DAPI-Färbung, Ablagerung 15 ul der DAPI kommerziellen Stammlösung auf dem festen trockenen Objektträger. Vor Licht gehen dann auf die Beobachtung.
2. Elektronenmikroskopie
   1. Nach der ersten Identifizierung auf den Folien, um die Anwesenheit des Virus durch giant Elektronenmikroskopie Beobachtung der Überstand Kulturen beurteilen.
   2. Kaution 5 ul der positiven Probe auf die glow-entladen Gitter. Warten für etwa 20 min bei Raumtemperatur.
   3. Trocknen Sie das Gitter vorsichtig und sich auf sie einen kleinen Tropfen von 1% Ammoniummolybdat für 10 Sekunden. Lassen Sie das Raster für 5 Minuten trocknen lassen.
   4. Gehen Mikroskopie bei 200 keV bis Elektron.
   5. Legen Sie das Gitter auf den Halter; den Halter in das Mikroskop einzuführen. Schauen Sie sich die Vakuum-Übersicht, indem Sie auf das entsprechende Symbol klicken. Ventile schließen und beginnen Beobachtung bei einer Punktgröße 5 und Vergrößerung von x 25.000.
   6. Messen Sie die Riesen-Virus mit ImageJ oder direktly am Mikroskop das Messwerkzeug des Mikroskops auf den Erwerb Bildschirms verwenden.
      Hinweis: Klassifizieren Sie die Probe in die Faustovirus Gruppe mit einem Kapsid Größe von etwa 200 nm.
3. Molekularbiologie
   Anmerkung: Nach dieser Identifizierung, Molekularbiologie Untersuchungen zur Bestätigung, um entscheidend waren Faustovirus von Marseillevirus zu unterscheiden, die die gleiche Kapsid Größe und Aussehen unter Elektronenmikroskopie hat, obwohl sie die gleiche Wirtsspezifität nicht haben. Die Marseillevirus nicht auf Vermamoeba wachsen kann, ist die Faustovirus ist spezifisch für Vermamoeba und alle Versuche , es wie Acanthamoeba auf andere Amöbe zu wachsen sind bisher gescheitert. Das Design und die Anwendung der spezifischen Primer / Sonde - Systeme aufgeführt in den Werken von Reteno et al. ermöglichte eine genauere vorläufige Klassifizierung der neu-Amplifikation und Sequenzierung der viralen Gene isoliert Viren durch.
   1. ExTrakts DNA aus den positiven Kulturproben eines automatisierten Extraktionssystems nach dem Protokoll des Herstellers.
   2. Eine Echtzeit - PCR - Thermocycler unter Verwendung der in Reteno et al. ¹⁹
   3. Sequenz unter Verwendung der gleichen Primer, die für die Amplifikation verwendet wurden. Verwenden Sie die Primer DNA-RNA-Polymerase-Untereinheit 1 Gen-Targeting: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(vorwärts) und Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (rückwärts) mit die Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA-Sonde.

4. Virus Produktion, Reinigung und Genomsequenzierung

1. Subkultur das einzige Virus Amöbe Kultur für Endpunktverdünnung Klonen.
2. Zur Herstellung: Es werden 20 - Kolben , die 30 ml PYG, 10 ml Vermamoeba vermiformis und 5 ml des isolierten Virus bereits aus Brunnen zu kleinen Kolben übertragen.
3. Inkubieren bei 30 ° C bis zur vollständigenLyse der Amöbe. Beachten Sie jeden Tag durch invertierte Lichtmikroskopie, bis alle Amöben lysiert werden.
4. Nach der vollständigen Lyse, bündeln alle Flaschen in einen Empfänger. Filter mit einem 0,45 um-Filter zur Beseitigung Schutt.
5. Starten Sie die Reinigung durch Ultrazentrifugation bei 89.800 × g für 75 min. Achten Sie darauf, das Gewicht der Rohre zu kalibrieren, bevor Zentrifugation starten.
6. Nach Zentrifugation entfernen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen durch Absaugen und das Pellet in PAS mit dem gleichen Volumen für die Kalibrierung verwendet resuspendieren, vor der Zentrifugation wiederholt.
7. Wie oben, entfernen Sie den Überstand und resuspendiere alle Pellets in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
8. Man reinige das Virus, das hergestellt wird, unter Verwendung von 25% Sucrose (27,5 g Saccharose in 100 ml PBS, filtriert auf einem 0,22 um Filter).
   1. Verwenden 8 ml Saccharose und 2 ml der viralen Suspension. Zentrifuge bei 89.800 · g für 1 h 15 min. Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS. Bei -80 ° C.

Ergebnisse

Das System in diesem Manuskript studiert validiert seine Proof of Concept durch zwei neue Faustoviruses zu isolieren. Von den 70 getesteten Proben wurden zwei Episoden der Lyse nachgewiesen, im Gegensatz zu unseren zuverlässigen negativen Kontrollen. Die negative Kontrolle für die Lyse enthielt eine 86% Amöbe Bevölkerung. Dagegen sind die positiven Proben (ST1 für Saint Pierre de Meyzoargues) und (LC9 für das La Ciotat Probe 9) zeigte einen dramatischen Rückgang der gated Amöben;...

Diskussion

Die Möglichkeit , dass Faustovirus schließen das erste Mitglied einer neuen Megavirales Familie ASFV zuerst von Reteno et al vorgeschlagen wurde sein könnte., ¹⁹ , aber einige Unterschiede noch unterschieden werden können. Es scheint unklar, ob Faustovirus die Asfarviridae Familie beitreten sollte oder ob es stattdessen eine neue vermeintliche Virusfamilie bilden. Dieses Problem wird weiter untersucht werden müssen, insbesondere eine umfassende Charakterisierung seiner Morphologie, Wirt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR FORTESSA cytometer	BD Biosciences	France	649225B4
TECNAI G2 F20	FEI	Germany	5027/11
Optical inverted microscope	leica	France	72643
DNA extraction	Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot	France	L106A0452
PCR Cycler CFX96	Bio rad	France	785BR06298
PYG medium , PAS, Starvation medium	In house laboratory production	Marseille URMITE	x
Amoeba strain CDC-19	ATCC	France	50237
Plates	Cellstar	France	655180
PCR materials, primers.	eurogentec	France	Primers cited in manuscript
glasstic slide 10 with grids	Kova	USA	H899871441F
Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain	Merck milipore	France	111955,6,57,109468
Vacuum driven filters	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
DAPI stain	Life Technologies	France	D1306
cytospin  4 cytocentrifuge	Thermo Fisher scientific	France	10522013JT184-31
Single cytology tunnel	Biomedical polymers inc.	France	BMP-cyto-S50
Carbon grids	Euromedex	France	FCF400NI
Ammonium molibdate	VWR internationanl	France	21276185
Flasks	SARSTEDT	Germany	833911
0.22μm filters	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultracentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Rapid-flow filters	Nalgene	France	450-0020