Быстрой стратегия для выделения новых Faustoviruses из проб окружающей среды Использование<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

Резюме

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Аннотация

Выделение гигантских вирусов представляет большой интерес в этой новой эры вирусологии, тем более, что эти гигантские вирусы связаны с простейшими. Гигантские вирусы могут быть потенциально патогенными для многих видов протистов. Они принадлежат к недавно описанному порядку Megavirales. Новая линия Faustovirus, который был выделен из проб сточных вод является отдаленное отношение к возбудителю млекопитающих африканской чумы свиней вирусом. Этот вирус также специфическими для его amoebal хозяина, Vermamoeba vermiformis, в протисты распространены в системах здравоохранения воды. Крайне важно, чтобы продолжить выделения новых генотипов Faustovirus для того, чтобы расширить свою коллекцию генотип и изучения ее пан-геном. Мы разработали новые стратегии для выделения дополнительных штаммов путем улучшения использования антибиотиков и противогрибковых комбинаций, чтобы избежать бактериальных и грибковых загрязнений амебы сокультивирования и пользу размножение вируса. Мы также реализовали новую starvatioп среда для поддержания V. vermiformis в оптимальных условиях на наличие вирусов сокультивирования. Наконец, мы использовали поточной цитометрии, а не Микроскопическое наблюдение показало, что занимает много времени отнимает много, чтобы обнаружить цитопатогенный эффект. Мы получили два изолятов из проб сточных вод, доказывая эффективность этого метода и таким образом расширяя коллекцию Faustoviruses, чтобы лучше понять их окружение, хозяина и специфичность генетического содержания.

Введение

Открытие гигантских вирусов, особенно те, которые принадлежат к порядку Megavirales, полностью изменили мир вирусов с точки зрения размера частиц и сложности генома. Вирусы были ранее считались малые предприятия, а мимивирус явился нарушить все правила. ¹ метагеномной данные свидетельствуют о вездесущность гигантских вирусов не только в среде, ^2-5 , но и в организме человека. ⁶ Таким образом, все еще ​​существует необходимость для поиска этих вирусов в больших масштабах. Разнообразие этих гигантских вирусов оценивали путем отбора проб не только разнообразие водной среды и связанных с ними отложений по всему миру, ^7-11 , но и путем скрининга различных человеческих образцов ^12,13 и проб окружающей среды. В ^7,9 Polyphaga мимивирус Acanthamoeba было изолированы путем совместной культуры с помощью фагоцитоза простейших, в первую очередь Acanthamoeba SPP. ^14-16 вся коллекция гигантских вирусов были тогда такжеизолированы от этого указанного протисты хозяина, который сделал научное сообщество ограничить свою исследовательскую и изолированности процедуру Acanthamoeba SPP. Ясно, что эта зависимость от одного вида хозяина привела большая часть вирусов не замечают. Тот факт , что гигантский вирус, CroV, был выделен с высоко мотильных морских простейшими кафетерия roenbergensis, ^17,18 демонстрирует необходимость использования более широкого спектра простейшими для того , чтобы открыть новые клоны или семейства гигантских вирусов. Reteno и др. Удалось выбрать другой простейшими в качестве клетки хозяев , которые никогда ранее не были использованы, и выделили новый Asfar связанную происхождение гигантских вирусов (недавно названный Faustovirus). ¹⁹

В попытке выделить новые генотипы Faustovirus с целью расширения членов этого вирусного происхождения, мы изменили наши процедуры изоляции и использовали их для скрининга проб окружающей среды, способных уборки новых Faustoviruses. Мы тогдаописал весь протокол для характеристики новых изолятов. Мы оценивали Vermamoeba vermiformis, наиболее распространенный свободно живущих протисты обнаружены в человеческих условиях, ^20-22 , которая уже используется в изоляции первого Faustovirus прототипа E12. ¹⁹ Этот протисты в настоящее время до сих пор у себя специфичные для Faustovirus. Мы знали, что ни один из известных вирусов гигантских был патогенным для этого амебы, потому что никакие попытки не выращивать другие вирусы гигантские в нашей лаборатории показали, амебы лизиса или вирусный рост. По этой причине мы считаем , что В. vermiformis является лучшим и самым уникальным поддержка клеток известно, выделить новые Faustoviruses.

протокол

1. Сбор образцов

1. Соберите 70 образцов из различных условий и регионов. В этом случае рекомендуется использовать следующие: 5 грязных проб воды из деревни Сен-Пьер-де-Meyzoargues (Франция), 15 образцов из озера в Парк Барели в Марселе (Франция); 15 образцов морской воды с осадком из скалистыми бухтами в Samena в Марселе (Франция), 25 проб речной воды из Альп (Франция), и, наконец, 10 образцов из сточных вод в Ла-Сьота (Франция).
2. Образцы Vortex для гомогенизации перед заражением, в течение одной минуты при комнатной температуре без какого-либо лечения.

Процедура 2. Изоляция

1. Принимающая Подготовка к процедурам Слепой культуры и образца Прививка
   1. Использование В. vermiformis (штамм CDC19) в качестве поддержки клеток для совместной культуры.
   2. Поддержание амебы при 28 ° С, в 75 см ² клеточной культуральной колбе с 30 мл протеаза-пептон-дрожжевой экстракт-глюкоза среде (PyГ). Пожалуйста , проверьте состав PYG в таблице 1.
      Примечание: Через 48 ч амебы количественно с помощью обычных подсчета с помощью подсчета слайдов (например, Kovaslides).
   3. Урожай клетки в концентрации 5 х 10 ⁵ до 10 ⁶ клеток / мл, и осадок амебы центрифугированием при 720 х г в течение 10 мин.
   4. Удалить супернатант аспирацией и вновь приостановить амеб осадок в 30 мл физиологического раствора стерильного amoebal Пейджа (ССА) Таблица 1. Повторите эту процедуру полоскания.
   5. Повторное приостановить амебы в 30 мл голодной среды с антибиотиком и противогрибковым смеси в концентрации приблизительно 10 ⁶ амебовидных / мл. Голодание среда является средой выживания для амебы, что позволяет ему остаться в живых без инцистирования или умножения. Проверить состав в таблице 1.
      Примечание: Противомикробное смесь агент содержал 10 мкг / мл ванкомицина, 10 мкг / мл имипенема, 20 мкг / мл ципрофлоксацин, 20 МКМг / мл доксициклин, и 20 мкг / мл вориконазола. Эта смесь служит для уменьшения бактерий и грибков загрязнение, которое может уменьшить или изменить размножение вируса.
   6. Непосредственно инокуляции 25 мкл каждого образца на 200 мкл амебы монослое в 96-луночный планшет плоским дном в пользу присоединения амеба и инкубировать при 30 ° С во влажной среде (влажная среда состоит из размещения влажного компресса внутри мешка, содержащего пластины для того, чтобы избежать испарения). Это прима-культура. Оставьте две лунки амеб без какого-либо образца прививки; это действует в качестве отрицательного контроля. Выдержите эту Primo-культуру в течение трех дней.
   7. Через три дня после первой иммунизации, к югу от культуры Primo-культуральный планшет на свежем амебы, как описано выше, без каких-либо микроскопического наблюдения. Выдержите новую плиту в течение трех дней при тех же самых условиях, что и примы-культуры.
   8. Выполните окончательную культуру после того, как эти три дня инкубации таким же образом, что и для ее primo- и субкультура. Выдержите окончательную культуру в течение двух дней. Затем приступают к обнаружению.
2. Обнаружение лизису автоматизированной проточной цитометрии
   Примечание: Слепой культура в сочетании с проточной цитометрии отличается от предыдущей стандартной системы изоляции. Он более чувствителен, точный и автоматизированный. Для обнаружения целей, мы применили новую методику, разработанную для обнаружения лизис на максимальной скорости и без микроскопического наблюдения. Этот метод является предпочтительным для образцов скрининга и имеет лучшую чувствительность , чем более старые методы. ^7-9
   1. С помощью 96-луночного планшета окончательного сокультивирования для обнаружения лизис.
   2. Включите цитометр и запустить чистый и полоскание цикла, чтобы получить более низкий фоновый шум в соответствии с протоколом производителя.
   3. Запуск High Throughput Sampler (HTS) в сочетании с проточной цитометрии для автоматической загрузки образцов из 96-луночного планшета и выполнять полностью автоматизированное приобретение в течение 40 мин Accordinг с протоколом производителя.
   4. Настройте HTS следующим образом: объем пробы 150 мкл, смешиваясь объем 50 мкл, скорость перемешивания 180, количество смесей 5, объем промывки между каждой пробы 400 мкл, при скорости потока 2,5 мкл / сек, количество зарегистрированных событий 10000.
   5. Оценка негативных контрольных лунках конечного сокультуры микроплиты сначала, чтобы ворота население амеба и определить процент этих клеток хозяев в соответствии с их физическими характеристиками. Обязательно иметь однородную амебы населения и второй популяции низших событий, соответствующих мусора и шума.
      Примечание: Эта процедура стробирования отличает внутриклеточную мусора и комков из отдельных клеток, по размеру, по оценкам, от рассеяния вперед. Поэтому очень важно, чтобы точно определить процент каждой группы населения, используя наилучшую процедуру стробирования. Эти проценты могут различаться, особенно если используются многие виды простейших, поэтому важно всегда иметь Negativуправления е, который может быть использован в качестве референтной группы населения для остальных образцов.
   6. Запустите стробирования, нажав образец приобрести.
   7. Запишите число событий, не менее 10000 событий.
   8. Локализуйте амебы население интереса с помощью стрелки. Это, как определить ворота.
   9. После того, как стробирования, пусть пятно HTS или найти пластину, нажав 'Home', а затем запустить всю пластину автоматически. Выполнение сбора и анализа данных в соответствии с параметрами размера и структуры (соответственно, FSC (вперед разброс) и SSC (боковое рассеивание)).
      Примечание: Обнаружение потери амебы закрытого населения сигнализирует о присутствии патогенного агента, ответственного за амебы лизиса. Простейшие лизис, связанный с вирусной инфекцией обнаруживается с произвольно разработанной порогом 50% лизиса населения амебы закрытого типа с помощью анализатора и по сравнению с тем же неинфицированным населения, используемого в качестве надежного отрицательного контроля.

3. Характеристика Новых изолятов после обнаружения лизиса

1. Предварительное Окрашивание, чтобы выявить наличие гигантских вирусов
   1. После обнаружения лизиса с помощью проточной цитометрии, пипеткой лизированных сопутствующих культур приостановить остальные амебы. Затем непосредственно цитоцентрифуге 50 мкл суспензии при 800 х г в течение 10 мин.
   2. После центрифугирования фиксируют слайды с чистым раствором метанола. Пятно слайды с использованием коммерческого быстрого окрашивания Azur и DAPI окрашивания эозином / синий и наблюдать под световым микроскопом при увеличении 1,000X с целью проверки на наличие вирусов заводов.
      1. Для быстрого окрашивания, погрузить слайды в первый раствор эозина (4 сек повторяли три раза), а затем перейти непосредственно погрузить слайдов во вторую фиксирующем растворе, содержащем синий Azur в течение 6 сек, и, наконец, полоскание слайды в течение 45 секунд с фосфатным буферным раствором рН 7,2. Оставьте слайды высохнуть при комнатной температуре, а затем приступить к observatiна.
      2. Для окрашивания DAPI, депозит 15 мкл коммерческого раствора DAPI на фиксированный сухой слайд. Защита от света затем приступить к наблюдению.
2. Электронная микроскопия
   1. После первой идентификации на слайдах, оценить наличие гигантского вируса путем наблюдения электронной микроскопии супернатанта культур.
   2. Депозит 5 мкл положительного образца на раскаленной разряжен сетки. Подождите примерно 20 минут при комнатной температуре.
   3. Тщательно высушите сетку и депозит на него небольшую каплю 1% молибдата аммония в течение 10 сек. Оставьте сетку, чтобы высохнуть в течение 5 мин.
   4. Перейдем к электронной микроскопии при 200 кэВ.
   5. Поместите сетку на держателе; ввести держатель в микроскоп. Проверьте обзор вакуума, нажав на соответствующую иконку. Закройте клапаны и начать наблюдение в размере пятна 5, и увеличение х 25000.
   6. Измерьте гигантский вирус с помощью ImageJ или прямойLY на микроскопе с помощью инструмента измерения микроскопа, расположенного на экране сбора.
      Примечание: Классифицировать образец в группе Faustovirus с размером капсида приблизительно 200 нм.
3. Молекулярная биология
   Примечание: После этой идентификации, тесты молекулярной биологии имеет решающее значение для подтверждения для того, чтобы отличить Faustovirus от Marseillevirus, который имеет тот же размер капсида и внешний вид под электронным микроскопом, хотя они не имеют один и тот же хост-специфичность. Marseillevirus не может расти на Vermamoeba, Faustovirus является специфическим для Vermamoeba и все попытки вырастить его на других амебы , таких как Acanthamoeba не смогли до сих пор . Конструкция и применение конкретных систем праймера / зонда , перечисленных в работах Reteno и др. позволило более точную предварительную классификацию вновь выделенных вирусов путем амплификации и секвенирования вирусных генов.
   1. бывшийДНК-кишечного тракта из положительных образцов культуры с использованием автоматизированной системы экстракции в соответствии с протоколом производителя.
   2. Выполните ПЦР в реальном времени с использованием Термоциклер , как описано в Reteno и др. ¹⁹
   3. Последовательность с использованием тех же праймеров, которые были использованы для амплификации. С помощью праймеров улавливающей ДНК-направленной РНК-полимеразы субъединица 1 ген: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(вперед) и Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT ТАА A-3' (обратный) с Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA зонд.

4. Вирус производства, очистки и секвенированию генома

1. Субкультуры один вирус амебы культуры для конечной точки разбавления клонирования.
2. Для производства: готовят 20 колб , содержащих 30 мл PYG 10 мл Vermamoeba vermiformis и 5 мл выделенного вируса уже переданного из скважин , в небольших флаконах.
3. Инкубируют при 30 ° С до завершения реакциилизис амебы. Обратите внимание каждый день с помощью перевернутой оптической микроскопии, пока все амеба не лизируют.
4. После полного лизиса, объединить все колб в адрес одного получателя. Фильтр с 0,45 мкм фильтр для устранения мусора.
5. Начните очистку с помощью ультрацентрифугирования в 89,800 мкг в течение 75 мин. Убедитесь в том, чтобы откалибровать вес труб перед началом центрифугирования.
6. После центрифугирования, удалить супернатант из каждой пробирки с помощью аспирации и повторно приостанавливать осадок в ПАС с таким же объемом, используемого для калибровки, прежде чем повторить центрифугирование.
7. Как и выше, удалить супернатант и повторно приостанавливать все гранулы в 1 мл фосфатно-буферного раствора (PBS).
8. Очищают вирус, который производится с использованием 25% сахарозы (27,5 г сахарозы в 100 мл PBS, фильтруют на фильтре 0,22 мкм).
   1. С помощью 8 мл сахарозы и 2 мл вирусной суспензии. Центрифуге при 89,800 мкг в течение 1 ч 15 мин. Повторно приостанавливать осадок в 1 мл PBS. Хранить при температуре -80 ° С.

Результаты

Система, изучаемые в этой рукописи подтверждено ее доказательство концепции путем выделения двух новых Faustoviruses. Из 70 испытанных образцов, были обнаружены два эпизода лизиса, в отличие от наших надежных отрицательных контролей. Отрицательный контроль за лизиса содерж...

Обсуждение

Возможность того, что Faustovirus может быть первым членом нового семейства Megavirales близко к АЧС была впервые предложена Reteno и др., ¹⁹ , но некоторые различия все еще ​​можно отличить. Оказывается, неясно, следует ли Faustovirus присоединиться к семье Asfarviridae или должен ли он вместо того, чт...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR FORTESSA cytometer	BD Biosciences	France	649225B4
TECNAI G2 F20	FEI	Germany	5027/11
Optical inverted microscope	leica	France	72643
DNA extraction	Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot	France	L106A0452
PCR Cycler CFX96	Bio rad	France	785BR06298
PYG medium , PAS, Starvation medium	In house laboratory production	Marseille URMITE	x
Amoeba strain CDC-19	ATCC	France	50237
Plates	Cellstar	France	655180
PCR materials, primers.	eurogentec	France	Primers cited in manuscript
glasstic slide 10 with grids	Kova	USA	H899871441F
Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain	Merck milipore	France	111955,6,57,109468
Vacuum driven filters	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
DAPI stain	Life Technologies	France	D1306
cytospin  4 cytocentrifuge	Thermo Fisher scientific	France	10522013JT184-31
Single cytology tunnel	Biomedical polymers inc.	France	BMP-cyto-S50
Carbon grids	Euromedex	France	FCF400NI
Ammonium molibdate	VWR internationanl	France	21276185
Flasks	SARSTEDT	Germany	833911
0.22μm filters	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultracentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Rapid-flow filters	Nalgene	France	450-0020