用いた環境サンプルから新規Faustovirusesの単離のための迅速な戦略<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

要約

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

要約

巨大なウイルスの分離は、これらの巨大なウイルスが原生生物に関連している、特に以来、ウイルス学のこの新しい時代に大きな関心です。ジャイアントウイルスは、原生生物の多くの種のための潜在的に病原性であってもよいです。彼らはMegaviralesの最近記載された順序に属しています。下水試料から単離された新しい系統Faustovirusは、哺乳動物の病原体アフリカ豚コレラウイルスの遠縁です。このウイルスはまた、そのアメーバホスト、Vermamoeba vermiformis、ヘルスケア水システムにおける共通の原生生物に固有のものです。 その遺伝子型のコレクションを拡大し、その汎ゲノムを研究するために、新しいFaustovirus遺伝子型を単離することを継続することが重要です。我々は、アメーバの共培養の細菌および真菌の汚染を回避するために、抗生物質および抗真菌組み合わせの使用を改善し、ウイルス増殖を有利にすることによって、追加の株の単離のための新たな戦略を開発しました。我々はまた、新しいstarvatioを実装しましたV.を維持するために、n個のメディアウイルス共培養のための最適な条件でvermiformis。最後に、我々は、細胞変性効果を検出するために、時間がかかり、フローサイトメトリーではなく、顕微鏡観察を使用します。私たちは、より自分の環境、宿主特異性と遺伝的内容を理解するために、この方法の効率を証明するため、Faustovirusesのコレクションを広げ、下水試料から2つの単離を得ました。

概要

巨大なウイルスの発見、Megavirales順に属する特には、完全に粒子サイズおよびゲノムの複雑さの点でウイルスの世界を変えました。ウイルスは以前に小規模事業体であると考えられ、そしてミミウイルスは、すべてのルールを破るように見えた^。1メタゲノムデータは、環境だけでなく、巨大なウイルスの普遍性を示唆して^2-5でなく、ヒトで^。6ので、必要性がまだあります大規模にこれらのウイルスを検索します。これらの巨大なウイルスの多様性は、世界的な水環境の多様性とそれに関連する堆積物だけでなくをサンプリングすることによって評価^7-11だけでなく、ヒトサンプル^12,13及び環境試料の様々なスクリーニングすることにより行った^。7,9 アカントアメーバカブトムシ亜目のミミウイルスでした貪食原生生物を用いた共培養により単離され、主にアカントアメーバ属巨人ウイルスの^14-16全体のコレクションはまた次いで科学界は、 アカントアメーバ属のための研究および単離手順を制限作られ、この指定された原生生物宿主から単離されました。明らかに、単一の宿主種で、この依存は見落とされているウイルスの大部分をもたらしました。巨大なウイルス、CroVは、非常に運動性の海洋原生動物カフェテリアroenbergensisで単離されたという事実は^{、17,18は、}新しい系統または巨大ウイルスの家族を発見するために原生動物の広い範囲を使用する必要性を示しています。 Reteno らは以前に使用されていなかった細胞宿主として他の原生動物を選択するために管理され、巨大なウイルス（新しく名前を付けたFaustovirus）の新しいAsfar関連の系統を単離した^。19

このウイルス系統のメンバーを拡大するために、新しいFaustovirus遺伝子型を分離する試みでは、我々は我々の単離手順を修正し、新しいFaustovirusesを収穫することが可能な環境サンプルをスクリーニングするためにそれらを使用しました。私たちはその後、新しい分離株を特徴づけるプロトコル全体を説明。我々はすでに最初のFaustovirusプロトタイプE12の単離に使用されているVermamoebaのvermiformis、人間の環境で見られる最も一般的な自由生活原生生物^、20-22を評価^{した 。19}この原生生物は、現在まだホスト固有Faustovirusためです。我々は、我々の研究室で他の巨大なウイルスを成長させるいかなる試みはアメーバ溶解またはウイルス増殖を示さなかったので知られている巨大なウイルスのいずれもが、このアメーバのために病原性ではなかったことを知っていました。このような理由から、私たちはそれを信じてV. vermiformisは新しいFaustovirusesを単離するために、既知の最良かつ最もユニークな細胞支持体です。

プロトコル

1.サンプルコレクション

1. 異なる環境と地域から70のサンプルを収集します。サンピエールドMeyzoargues（フランス）、マルセイユ（フランス）でボレリー公園内の湖から15のサンプルの村から5汚れた水試料;：この場合は、以下を使用マルセイユのSamenaで岩の入口（フランス）、アルプスから25河川水試料（フランス）からの土砂で15海水サンプル、ラ・シオタ（フランス）で下水から最終的に、10サンプル。
2. 任意の処理をせずに室温で1分間、接種前に、均質化のための渦サンプル。

2.単離操作

1. ブラインド文化の手順とサンプル接種のための準備をホスト
   1. 使用V.共培養のための細胞のサポートなどvermiformis（株CDC19）。
   2. プロテアーゼペプトン-酵母エキス-グルコース培地30mlで75cm ²の細胞培養フラスコ中、28℃でアメーバを維持する（PYG）。 表1にPYG組成を確認してください。
      注：48時間後、アメーバはカウントスライドを使用して、通常のカウント（ 例えば 、Kovaslides）によって定量化されています。
   3. 10分間、720×gで遠心分離することによって、5×10 ^{5〜10 6}細胞/ mlであり、ペレットアメーバの濃度で細胞を回収します。
   4. 吸引により上清を除去し、滅菌ページのアメーバ生理食塩水（PAS） 表1の30ミリリットルでアメーバペレットを再懸濁する。この洗浄手順を繰り返します。
   5. 約10 ⁶アメーバ/ mlの濃度で抗生物質や抗真菌混合物と飢餓培地30ml中のアメーバを再サスペンド。飢餓培地は、シスト化や乗算なしで生き続けるためにそれを可能にする、アメーバの生存媒体です。 表1に組成を確認してください。
      注：抗菌剤ミックスを10μg/ mlのバンコマイシン、10 / mlのイミペネム、20 / mlのシプロフロキサシン、20μを含有していましたグラム/ mlのドキシサイクリン、および20μg/ mlのボリコナゾール。この混合物は、ウイルス増殖を減少または変更することができ、細菌および真菌汚染を低減するのに役立ちました。
   6. 直接湿潤環境が入った袋の内側に湿布を置くことで構成され（アメーバ接着に有利な96ウェルプレート平底に200μlのアメーバの単層上に各サンプルを25μl接種し、湿潤環境で30℃でインキュベート蒸発を避けるためにプレート）。これは、プリモ・文化で​​す。任意のサンプル接種せずにアメーバの2つのウェルを残します。これは、陰性対照として働きます。 3日間このプリモ・文化をインキュベートします。
   7. 三日新鮮なアメーバの最初の接種、サブカルチャープリモ培養プレートの後の顕微鏡で観察することなく、上述したように。プリモ培養と同じ条件下で3日間の新しいプレートをインキュベートします。
   8. インキュベーションのこれらの3日後に目の場合と同じように、最終的な培養を行います電子primo-とサブカルチャー。 2日間の最終培養をインキュベートします。そして、検出に進みます。
2. 自動化フローサイトメトリーによる溶解の検出
   注：フローサイトメトリーで結合されたブラインド文化は分離の前の標準的なシステムとは異なります。これは、より敏感な正確かつ自動化されています。検出目的のために、我々は、最高速度で、顕微鏡観察することなく溶解を検出するために開発された新たな技術を適用しました。この技術は、スクリーニング試料について有利で ​​あり、より古い技術よりも優れた感度を有している^。7-9
   1. 溶解を検出するために、最終的な共培養の96ウェルプレートを使用してください。
   2. サイトメーターの電源をオンにし、製造業者のプロトコルに従って、より低いバックグラウンドノイズを得るために、クリーンですすぎサイクルを実行します。
   3. サイトメーター自動的に96ウェルプレートからサンプルをロードし、accordin 40分以内に完全に自動化された取得を実行するために、フローと組み合わせるハイスループットサンプラー（HTS）を起動製造業者のプロトコルにグラム。
   4. サンプル容量150μLを、体​​積50μLを混合速度180、ミックス5の数、各サンプルを400μl、流速2.5μL/秒、記録されたイベント万の数との間の洗濯量を混合、次のようにHTSを設定します。
   5. ゲートするために、第1アメーバ集団を、最終的な共培養マイクロプレートの陰性対照ウェルを評価し、それらの物理的特性に応じて、これらの細胞宿主の割合を決定します。均質なアメーバの人口と破片やノイズ​​に対応する下のイベントの第二集団を持っているようにしてください。
      注：このゲーティング手順は、前方散乱によって推定さ、サイズによって単一細胞から細胞内破片や凝集塊を区別します。正確に可能な限り最高のゲーティング手順を使用して各集団の割合を決定することが重要です。これらのパーセンテージは、原生動物の多くの種類が使用される場合は特に、変化し得るので、negativを有することが常に重要ですサンプルの残りの参照集団として使用することができる電子制御。
   6. サンプルを取得クリックして、ゲーティングを開始します。
   7. 10,000事象未満ではないイベントの数を記録します。
   8. 矢印を使用して、関心のアメーバ集団をローカライズします。これは、ゲートを定義する方法です。
   9. その後、自動的にプレート全体を実行し、ゲーティングした後、HTSスポットを聞かせまたは「ホーム」をクリックして、プレートを見つけます。サイズおよび構造パラメータに従ってデータ収集と分析を実行します（それぞれ、FSC（前方散乱）およびSSC（側方散乱））。
      注：アメーバ依存性人口の損失を検出するには、アメーバ溶解を担当する病原体の存在を示します。ウイルス感染に関連原虫溶解アナライザによってゲート及び信頼陰性対照として使用したものと同じ非感染個体群と比較して、アメーバ集団の50％溶解を任意に設計しきい値を用いて検出されます。

3。溶解検出後の新分離株のキャラクタリゼーション

1. 巨人ウイルスの存在を明らかにするための予備染色
   1. フローサイトメトリーによる溶解検出した後、残りのアメーバを中断し溶解した共培養をピペット。その後、直接10分間、800×gで懸濁液50μlの細胞遠心。
   2. 遠心分離した後、純粋なメタノール溶液でスライドを固定します。ウイルスの工場が存在するかどうかを確認するために、エオシン/ブルーアズールとDAPI染色の商業迅速な染色を用いてスライドを染色し、1,000倍の倍率で光学顕微鏡下で観察します。
      1. 迅速な染色のために、第一のエオシン溶液にスライドを突入後、リン酸緩衝液で45秒間スライドをすすぎ、最終的に6秒間青色ジュールを含む第二の定着液中にスライドを突入に直接渡し、及び（4秒を3回繰り返します） pHは7.2。 observatiに進み、その後、室温で乾燥さスライドを残しますに。
      2. DAPI染色、預金固定乾式スラ​​イド上にDAPI商用原液15μlのために。観察に進み、その後、光から保護します。
2. 電子顕微鏡
   1. スライド上の最初の同定後、上清を培養物の電子顕微鏡観察によって巨大なウイルスの存在を評価します。
   2. グロー放電したグリッド上に正のサンプルの寄託5μlの。室温で約20分間待ちます。
   3. その上で10秒間、1％モリブデン酸アンモニウムの小滴を慎重にグリッドと堆積物を乾燥させます。 5分間乾燥させるためにグリッドを残します。
   4. 200 keVので顕微鏡を電子に進みます。
   5. ホルダーにグリッドを配置します。顕微鏡にホルダーをご紹介します。対応するアイコンをクリックして真空の概要を確認してください。開閉弁とスポットサイズ5であり、x 25,000倍の倍率で観察を始めます。
   6. ImageJのか、直接を使用して巨大なウイルスを測定します取得画面上にある顕微鏡の尺度ツールを使用して、顕微鏡上LY。
      注：200nm程度のカプシドサイズでFaustovirusグループ内に試料を分類します。
3. 分子生物学
   注：それらが同じ宿主特異性を持っていませんが、この同定した後、分子生物学的テストは、電子顕微鏡の下で同じカプシドのサイズと外観を有するMarseillevirusからFaustovirusを区別するために、確認のために非常に重要でした。 MarseillevirusがVermamoebaに成長できない、FaustovirusはVermamoebaに固有であり、そのようなアカントアメーバのような他のアメーバの上に成長するすべての試みは、これまでに失敗した。Reteno らの作品に記載されている特異的なプライマー/プローブシステムの設計とアプリケーションを。ウイルス遺伝子の増幅および配列決定を介して新たに分離されたウイルスのより正確な予備分類を可能にしました。
   1. 例製造業者のプロトコルに従って自動抽出システムを使用して、陽性培養試料から管DNA。
   2. Retenoに記載されているように^。19らサーモサイクラーを用いてリアルタイムPCRを行います
   3. 増幅に使用した同じプライマーを用いて配列。 Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '（フォワード）およびFstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3'（リバース）を持つ：DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニット1遺伝子を標的とするプライマーを使用してくださいFstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRAプローブ。

4.ウイルス産生、精製およびゲノムシーケンシング

1. 終点希釈クローニングのための単一のウイルスアメーバ文化をサブカルチャー。
2. 生産のために：PYGの30ミリリットルを含む20フラスコ、Vermamoebaのvermiformis、すでに小さなフラスコに井戸から転送された単離ウイルスの5ミリリットルの10ミリリットルを準備します。
3. 完了するまで30℃でインキュベートアメーバの溶解。すべてのアメーバが溶解するまで倒立光学顕微鏡により毎日観察します。
4. 完全に溶解した後、一人の受信者にすべてのフラスコをプール。破片を除去するために0.45μmのフィルターでフィルタリングします。
5. 75分間、89,800×gで超遠心分離による精製を開始します。遠心分離を開始する前に、チューブの重量を校正することを確認します。
6. 遠心分離した後、吸引によって各チューブから上清を除去し、遠心分離を繰り返す前に、キャリブレーションに使用したのと同じ量でPASでペレットを再懸濁。
7. 上記のように、上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1ml中のすべてのペレットを再懸濁します。
8. （0.22μmのフィルターで濾過PBS 100ml中のスクロース27.5 gで）25％のショ糖を使用して、製造されたウイルスを精製します。
   1. ショ糖の8ミリリットルとウイルス懸濁液の2ミリリットルを使用してください。 1時間15分間、89,800×gで遠心します。 1mlのPBSでペレットを再懸濁。 -80℃で保管してください。

結果

この原稿で研究システムは、2つの新しいFaustovirusesを単離することによって、概念の、その証拠を検証しました。テストした70サンプルのうち、溶解の2つのエピソードは、私たちの信頼性が陰性対照とは対照的に、検出されました。溶解のためのネガティブコントロールは、86％のアメーバ集団を含んでいました。これとは対照的に、正のサンプル（サンピエール・デ...

ディスカッション

FaustovirusがASFVに近い新しいMegaviralesファミリーの最初のメンバーであるという可能性はまずReteno ら^、19によって示唆されたが、いくつかの違いがまだ区別することができます。 Faustovirusがアスファウイルス科ファミリーに参加する必要があるかどうかではなく、新しい推定されるウイルスのファミリーを形成する必要があるかどうかは不明で表示されます。この問題はさらに?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR FORTESSA cytometer	BD Biosciences	France	649225B4
TECNAI G2 F20	FEI	Germany	5027/11
Optical inverted microscope	leica	France	72643
DNA extraction	Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot	France	L106A0452
PCR Cycler CFX96	Bio rad	France	785BR06298
PYG medium , PAS, Starvation medium	In house laboratory production	Marseille URMITE	x
Amoeba strain CDC-19	ATCC	France	50237
Plates	Cellstar	France	655180
PCR materials, primers.	eurogentec	France	Primers cited in manuscript
glasstic slide 10 with grids	Kova	USA	H899871441F
Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain	Merck milipore	France	111955,6,57,109468
Vacuum driven filters	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
DAPI stain	Life Technologies	France	D1306
cytospin  4 cytocentrifuge	Thermo Fisher scientific	France	10522013JT184-31
Single cytology tunnel	Biomedical polymers inc.	France	BMP-cyto-S50
Carbon grids	Euromedex	France	FCF400NI
Ammonium molibdate	VWR internationanl	France	21276185
Flasks	SARSTEDT	Germany	833911
0.22μm filters	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultracentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Rapid-flow filters	Nalgene	France	450-0020